Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество -2',3'- дидегидро-2',3'-дидезокси-5-фторцитидина, и способ лечения или профилактики вич-инфекции у человека

Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество -2',3'- дидегидро-2',3'-дидезокси-5-фторцитидина, и способ лечения или профилактики вич-инфекции у человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение частично профинансировано грантом United States National Institutes of Health №1R01-A1-41980-01. Правитель сто США имеет определенные права на данное изобретение.

В соответствии с данной заявкой испрашивается приоритет по предварительной заявке на выдачу патента США №60/116773, поданной 22 января 1999 года.

Предпосылки изобретения:

В 1983 году в качестве этиологического фактора СПИД был определен вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). В 1985 году появились сообщения о том, что синтетический нуклеозид 3'-азидо-3'-дезокситимидин (AZT) ингибирует репликацию вируса иммунодефицита человека. С тех пор было доказано, что ряд других синтетических нуклеозидов, включая 2',3'-дидезоксиинозин (DDI), 2',3'-дидезоксицитидин (DDC), 2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидротимидин (D4T), цис-2-гидроксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан (FTC), (-)-цис-2-гидроксиметил-5-(цитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан (3ТС), эффективны против ВИЧ. После клеточного фосфорилирования 5'-трифосфатом клеточными киназами данные синтетические нуклеозиды включаются в растущую цепь вирусной ДНК, вызывая терминацию цепи из-за отсутствия 3'-гидроксильной группы. Они также способны ингибировать вирусный фермент обратную транскриптазу.

Было выявлено, что устойчивые к лекарственным средствам варианты ВИЧ могут возникать после продолжительного лечения противовирусным средством. Устойчивость к лекарственным средствам обычно возникает в результате мутации гена, который кодирует фермент, используемый при репликации вируса, и, как правило, в случае ВИЧ обратной транскриптазы, протеазы или ДНК-полимеразы. Недавно было показано, что эффективность лекарственного средства против ВИЧ-инфекции может быть продлена, улучшена или восстановлена путем введения соединения в сочетании или чередовании со вторым и, возможно, третьим противовирусным средством, которое индуцирует мутацию, отличную от таковой, индуцированной основным лекарственным средством. Альтернативно, с помощью подобной сочетанной или чередующейся терапией могут быть изменены фармакокинетика, биологическое распределение или иной параметр лекарственного средства. Вообще, сочетанная терапия, как правило, является предпочтительной по сравнению с чередующейся терапией, поскольку она оказывает множественное одновременное давление на вирус. Однако, нельзя предсказать, какие мутации будут индуцированы в геноме ВИЧ-1 введенным лекарственным средством, является ли мутация постоянной или временной, или как инфицированная ВИЧ-1 с мутантной последовательностью будет реагировать на сочетаную или чередующуюся терапию другими средствами. Это осложняется тем фактом, что имеется мало данных по кинетике устойчивости к лекарственным средствам в долгоживущих клеточных культурах, обрабатываемых современными противоретровирусными средствами.

Варианты ВИЧ-1, устойчивые к 3'-азидо-3'-дезокситимидину (AZT), 2',3'-дидезоксиинозину (DDI) или 2',3'-дидезоксицитидину (DDC), были выделены из организма пациентов, получавших длительную монотерапию данными лекарственными средствами (Larder BA, Darby G, Richman DD, Science, 1989; 243:1731-4; St.Clair MH, Martin JL, Tudor WG, et al., Science, 1991; 253:1557-9; St.Clair MH, Martin JL, Tudor WG, et al., Science, 1991; 253:1557-9; and Fitzgibbon JE, Howell RM, Haberzettl CA, Sperber SJ, Gocke DJ, Dubin DT, Antimicrob Agents Chemother, 1992; 36:153-7). Растущие клинические данные свидетельствуют о том, что устойчивость к AZT является предвестником неблагоприятного клинического исхода как у детей, так и у взрослых (Mayers DL, Lecture at the Thirty-second Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (Anaheim, CA. 1992); Tudor-Williams G, St.Clair MH, McKinney RE, et al., Lancet, 1992; 339:15-9; Ogino MT, Dankner WM, Spector SA, J.Pediatr., 1993; 123:1-8; Crumpacker CS, D'Aquila RT, Johnson VA, et al., Third Workshop on Viral Resistance, (Gaithersburg, MD. 1993); and Mayers D, and the RV43 Study Group, Third Workshop on Viral Resistance, (Gaithersburg, MD. 1993)). Также сообщалось о быстром развитии устойчивости ВИЧ-1 к ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (ННИОТ) как в клеточной культуре, так и в ходе клинических испытаний на людях (Nunberg JH, Schleif WA, Boots EJ, et al., J.Virol., 1991; 65(9):4887-92; Richman D, Shin CK, Lowy I, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.(USA), 1991; 88:11241-5; Mellors JW, Dutschman GE, Im GJ, Tramontane E, Winkler SR, Cheng YC, Mol.Pharm., 1992; 41:446-51; Richman DD and the ACTG 164/168 Study Team, Second International HIV-1 Drug Resistance Workshop, (Noordwijk, the Netherlands, 1993); and Saag MS, Emini EA, Laskin OL, et al., N. Engi. J.Med., 1993; 329:1065-1072). В случае ННИОТ L'697661, устойчивый к лекарственному средству ВИЧ-1 возник в течение 2-6 недель от начала терапии в сочетании с возвратом виремии к уровням, существовавшим до лечения (Saag MS, Emini EA, Laskin OL, et al., N.Engl.J.Med., 1993; 329:1065-1072). Внезапно развивающаяся виремия, связанная с присутствием устойчивых к лекарственным средствам штаммов, также отмечалась и в случае с другими классами ингибиторов ВИЧ-1, включая ингибиторы протеазы (Jacobsen H, Craig CJ, Duncan IB, Haenggi M, Yasargil К, Mous J, Third Workshop on Viral Resistance, (Gaithersburg, MD, 1993)). Данный опыт привел к осознанию того, что потенциал к развитию устойчивости к лекарственным средствам ВИЧ-1 должен быть оценен в ходе ранних доклинических исследований всех новых способов лечения ВИЧ-1.

2',3'-Дидезокси-2',3'-дидегидро-5-фторцитидин (D4FC) является известным соединением. В публикации заявки на выдачу европейского патента №0 409 227 А2, поданной Ajinomoto Co., Inc., описан β-D-D4FC (пример 2) и его применение для лечения гепатита В. В патенте Нидерландов №8901258, выданном Stichting Rega V.Z.W., описаны, главным образом, производные 5-галоген-2',3'-дидезокси-2',3'-дидегидроцитидина для применения в лечении ВИЧ-инфекции и гепатита В (HBV). В патенте США №5703058 описан способ лечения ВИЧ- и HBV-инфекций, который предусматривает введение эффективного количества β-L-D4FC в сочетании или чередовании с цис-2-гидроксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиоланом, цис-2-гидроксиметил-5-(цитозин-1-ил)-1,3-оксатиоланом, 9-[4-(гидроксиметил)-2-циклопентен-1-ил)гуанином (карбовиром), 9-[(2-гидроксиэтокси)-метил]гуанином (ацикловиром), интерфероном, 3'-дезокси-3'-азидотимидином (AZT), 2',3'-дидезоксиинозином (DDI), 2',3'-дидезоксицитидином (DDC), (-)-2'-фтор-5-метил-β-L-арауридином (L-FMAU) или 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезокситимидином (D4T). В патенте США №5905070 описан способ лечения ВИЧ- и HBV-инфекций, который предусматривает введение эффективного количества β-D-D4FC в сочетании или чередовании с цис-2-гидроксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиоланом, цис-2-гидроксиметил-5-(цитозин-1-ил)-1,3-оксатиоланом, 9-[4-(гидроксиметил)-2-циклопентен-1-ил)гуанином (карбовиром), 9-[(2-гидроксиэтокси)метил]гуанином (ацикловиром), интерфероном, 3'-дезокси-3'-азидотимидином (AZT), 2',3'-дидезоксиинозином (DDI), 2',3'-дидезоксицитидином (DDC), (-)-2'-фтор-5-метил-β-L-арауридином (L-FMAU) или 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезокситимидином (D4T).

Объектом настоящего изобретения является определение оптимального способа введения β-D-D4FC для лечения ВИЧ-инфекции.

Другими объектами настоящего изобретения являются способ и композиция, которая включает β-D-D4FC, для лечения пациентов, инфицированных ВИЧ, которая проявляет преимущественные или улучшенные фармакокинетические параметры, параметры биологического распределения, метаболические параметры, параметры устойчивости и другие параметры по сравнению с введением одного β-D-D4FC.

Другими объектами настоящего изобретения являются способ и композиция для лечения пациентов, инфицированных ВИЧ, в которой β-D-D4FC вводят в сочетании или чередовании со вторым соединением, которое действует синергически β-D-D4FC против вируса.

Другими объектами настоящего изобретения являются способ и композиция для лечения пациентов, инфицированных устойчивой к лекарственным средствам форме ВИЧ.

Другими объектами настоящего изобретения являются способ и набор для оценки наилучшего способа введения β-D-D4FC.

Сущность изобретения:

Было выявлено, что β-D-D4FC индуцирует мутации в ВИЧ-1 в 70 (К на N), 90 и 172 кодонах обратно-транскриптазного участка генома вируса. На основании данного открытия разработан способ лечения ВИЧ-инфекции, который предусматривает введение β-D-D4FC или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства человеку, нуждающемуся в таком лечении, в сочетании или чередовании с лекарственным средством, которое индуцирует мутацию ВИЧ-1 в положении, отличном от 70 (К на N), 90 и 172 кодонов обратно-транскриптазного участка. Данное изобретение может быть осуществлено с использованием опубликованных профилей мутаций, индуцируемых известными анти-ВИЧ лекарственными средствами, или с помощью определения профиля мутаций, индуцируемых новым лекарственным средством.

На основании данного изобретения также предоставляется способ применения β-D-D4FC в качестве "терапии спасения" для пациентов, у которых наблюдается устойчивость к другим анти-ВИЧ средствам. Было обнаружено, что β-D-D4FC не проявляет существенной перекрестной устойчивости с AZT, DDC, DDI, D4T, 3ТС, (-)-FTC или β-L-D4FC. Напротив, β-L-D4FC быстро индуцирует мутацию в кодоне 184 (метионин на валин), что приводит к высокому уровню устойчивости 3ТС и FTC. β-D-D4FC может быть, как правило, использован как терапия спасения для любого пациента, у которого наблюдается устойчивость к лекарственному средству, которое индуцирует мутацию кодонов, отличных от 70 (К на N), 90 или 172 кодонов.

Изобретение, описанное здесь, в более общем смысле охватывает, по крайней мере, следующие осуществления:

(i) Способ лечения ВИЧ-инфекции у человека, предусматривающий введение эффективного количества β-D-D4FC или его фармацевтически приемлемого пролекарства или соли человеку, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе, в сочетании или чередовании с лекарственным средством, которое индуцирует мутацию ВИЧ-1 в положении, отличном от 70 (К на N), 90 или 172 кодонов обратно-транскриптазного участка, и которое отлично от цис-2-гидроксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана, цис-2-гидроксиметил-5-(цитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана, 9-[4-(гидроксиметил)-2-циклопентен-1-ил)гуанина (карбовира), 9-[(2-гидроксиэтокси)метил]гуанина (ацикловира), интерферона, 3'-дезокси-3'-азидотимидина (AZT), 2',3'-дидезоксиинозина (DDI), 2',3'-дидезоксицитидина (DDC), (-)-2'-фтор-5-метил-β-L-арауридина (L-FMAU) или 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезокситимидина (D4T).

(ii) Способ лечения ВИЧ-инфекции у человека, предусматривающий введение эффективного количества β-D-D4FC или его фармацевтически приемлемой соли человеку, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе, в сочетании или чередовании с лекарственным средством, которое индуцирует мутацию ВИЧ-1 кодона 70 с К на N (т.е. с лизина на аспарагин), мутацию кодона 90 с V на I (т.е. с валина на изолейцин) и мутацию кодона 172 с R на К (т.е. с аргинина на лизин) обратно-транскриптазного участка и которое отлично от цис-2-гидроксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана, цис-2-гидроксиметил-5-(цитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана, 9-[4-(гидроксиметил) -2-циклопентен-1-ил)гуанина (карбовира), 9-[(2-гидроксиэтокси)метил]гуанина (ацикловира), интерферона, 3'-дезокси-3'-азидотимидина (AZT), 2',3'-дидезоксиинозина (DDI), 2',3'-дидезоксицитидина (DDC), (-)-2'-фтор-5-метил-β-L-арауридина (L-FMAU) или 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезокситимидина (D4T).

(iii) Способ лечения пациента, инфицированного штаммом ВИЧ, который устойчив к ЗТС, предусматривающий введение эффективного количества β-D-D4FC или его фармацевтически приемлемого пролекарства или соли пациенту, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе.

(iv) Способ лечения пациента, инфицированного штаммом ВИЧ, который устойчив к AZT, предусматривающий введение эффективного количества β-D-D4FC или его фармацевтически приемлемого пролекарства или соли пациенту, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе.

(v) Способ лечения пациента, инфицированного штаммом ВИЧ, который устойчив к цис-2-гидроксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолану, предусматривающий введение эффективного количества β-D-D4FC или его фармацевтически приемлемого пролекарства или соли пациенту, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе.

(vi) Способ лечения пациента, инфицированного штаммом ВИЧ, который устойчив к цис-2-гидроксиметил-5-(цитозин-1-ил)-1,3-оксатиолану, предусматривающий введение эффективного количества β-D-D4FC или его фармацевтически приемлемого пролекарства или соли пациенту, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе.

(vii) Способ лечения пациента, инфицированного штаммом ВИЧ, который устойчив к 2',3'-дидегидро-2',3'-дидезокситимидину (D4T), предусматривающий введение эффективного количества β-D-D4FC или его фармацевтически приемлемого пролекарства или соли пациенту, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе.

(viii) Способ лечения пациента, инфицированного штаммом ВИЧ, который устойчив к 2',3'-дидезоксиинозину (DDI), предусматривающий введение эффективного количества β-D-D4FC или его фармацевтически приемлемого пролекарства или соли пациенту, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе.

(ix) Способ лечения пациента, инфицированного штаммом ВИЧ, который устойчив к 2',3'-дидезоксицитидину (DDC), предусматривающий введение эффективного количества β-D-D4FC или его фармацевтически приемлемого пролекарства или соли пациенту, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе.

(х) Способ лечения пациента, инфицированного ВИЧ, предусматривающий введение эффективного количества β-D-D4FC или его фармацевтически приемлемого пролекарства или соли в сочетании или чередовании с эффективным количеством (S)-6-хлор-4-циклопропилэтинил-4-трифторметил-1,4-дигидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-он (SUSTIVA, смотри патент США 5519021).

Описанные схемы сочетания, чередования и спасения применимы для профилактики и лечения ВИЧ-инфекции и других ассоциированных состояний, таких как СПИД-ассоциированный комплекс (ARC), персистирующая генерализованная лимфаденопатия (PGL), СПИД-ассоциированные неврологические состояния, состояния, связанные с наличием анти-ВИЧ антителами и ВИЧ, саркома Калоши, тромбоцитопеническая пурпура и оппортунистические инфекции. Кроме того, данные соединения или композиции могут применяться профилактически для предотвращения или замедления прогрессирования клинических проявлений заболевания у субъектов, положительных по анти-ВИЧ антителам или антигенам ВИЧ или контактировавших с ВИЧ.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлена формула β-D-D4FC.

Фиг.2 представляет собой график зависимости концентрации β-D-D4FC, выраженной в микромоль/л, от процентного ингибирования продукции антигена р24. Фиг.2 иллюстрирует отбор вируса с пониженной чувствительностью к β-D-D4FC.

Подробное описание изобретения:

I. Определения

Используемый здесь термин "устойчивый вирус" относится к вирусу, который проявляет трех-, а обычно пятикратное или большее увеличение значения EC₅₀ по сравнению с интактным вирусом в непрерывной клеточной линии, включающей, не ограничиваясь, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) или клетки МТ2 или МТ4.

Термин "D-D4FC" используется ниже взаимозаменяемо с термином "β-D-D4FC".

Используемый здесь термин "по существу, чистый" или "по существу, в виде одного оптического изомера" относится к нуклеозидной композиции, которая содержит по крайней мере 95-98% и более предпочтительно 99-100%, одного энантиомера данного нуклеозида. В предпочтительном осуществлении β-D-D4FC вводят по существу в чистом виде по любому из указанных показаний.

Используемый здесь термин "пролекарство" относится к 5'- и N⁴-ацилированным, алкилированным или фосфорилированным (включая моно-, ди- и трифосфатные эфиры, равно как и стабилизированные фосфатные и фосфолипидные) производные D-D4FC. В одном осуществлении ацильная группа представляет собой эфир карбоновой кислоты, в котором некарбонильный радикал сложноэфирной группы выбран из неразветвленного, разветвленного или циклического алкила, алкоксиалкила, включая метоксиметил, аралкила, включая бензил, арилоксиалкила, включая феноксиметил, арила, включая фенил, необязательно замещенный галогеном, алкилом или алкокси, эфиры сульфоната, такие как алкил- или аралкилсульфонил, включая метансульфонил, тритил или монометокситритил, замещенного бензила, триалкилсилила или дифенилметилсилила. Арильные группы в сложных эфирах предпочтительно содержат фенильную группу. Алкильная группа может быть неразветвленной, разветвленной или циклической и предпочтительно представляет собой C₁-C₁₈.

Используемый здесь термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к фарцевтически приемлемым солям, которые, будучи введены реципиенту, способны непосредственно или опосредованно образовывать β-D-D4FC или которые проявляют активность сами по себе.

Сокращения наименований аминокислот, используемые здесь, пояснены в таблице 1.

II. Мутации обратной транскриптазы ВИЧ-1, отбираемые с помощью β-D-D4FC

Как D-, так и L-энантиомеры β-2',3'-дидегидро-2',3'-дидезокси-5-фторцитидина (D4FC) являются мощными и селективными ингибиторами ВИЧ-1, хотя D-энантиомер является более селективным. Развитие устойчивости к D-D4FC in vitro оценивали путем серийных посевов ВИЧ-1_LAI в клетках МТ-2 и мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) в присутствии растущих концентраций лекарственного средства. Варианты, устойчивые к D-D4FC, возникли лишь после продолжительного контактирования с лекарственным средством. Вирус, полученный после 20 посевов в клетках МТ-2, проявил 5,3-кратную устойчивость к D-D4FC. Устойчивый вирус не удалось выделить из РВМС, несмотря на многочисленные попытки. Секвенирование ДНК ОТ вируса, отобранного в клетках МТ-2, выявило две мутации: K65R и V179D. Отбор устойчивого к D-D4FC вируса повторяли в клетках МТ-2, и варианты, проявляющие 19,3-кратную устойчивость, кодировали три новые мутации ОТ: K70N, V90I и R172K. Рекомбинантный K65R вич-1_LAI проявлял 3,9-кратную устойчивость к D-D4FC. V179D, мутация, придающая устойчивость к ненуклеозидным ингибиторам ОТ, наиболее вероятно, компенсирует K65R. Роль других мутаций в формировании устойчивости к D-D4FC также оценивали путем конструирования рекомбинантного вируса с одной или множественными мутациями, однако, ни один из протестированных рекомбинантов не проявлял более чем 2-кратную устойчивость.

Материалы и методы.

Химикалии. D-D4FC синтезировали в одной из лабораторий авторов настоящего изобретения, как описано ранее (Shi et al., 1999). Его получали в виде 10 мМ маточных растворов в стерильной воде и хранили при -20°С. Раствор оттаивали и разбавляли до желаемой концентрации непосредственно перед использованием.

Клетки. Клетки МТ-2 (AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health при содействии D. Richman) культивировали в RPMI 1640 (Whittaker M.A., Byproducts, Walkersville, MD), обогащенной 10% околоплодной сывороткой теленка, 10 мМ буфером HEPES, пенициллином (50 МЕ/мл) и стрептомицином (50 мкг/мл).

Вирусы. ВИЧ-1_LAI, молекулярно клонированный клинический изолят, применяли в качестве исходного вируса как для отбора устойчивости, так и для получения рекомбинантных мутантов. Маточные препараты ВИЧ-1_LAI получали путем электропорации 5-10 мкг провирусной плазмидной ДНК в 1,3×10⁷ клеток МТ-2. На пике цитопатического эффекта вируса (обычно через 7 суток после трансфекции) супернатант отбирали из инфицированных культур, разделяли на аликвоты и хранили при -80°С до использования. Препараты вируса титровали до трехкратного конечного разведения в клетках МТ-2 и значение TCID₅₀ рассчитывали по уравнению Reed и Muench.

Отбор устойчивых вирусов. До начала отбора вирусов, устойчивых к D-D4FC, исходный вирус (ВИЧ-1_LAI) высевали в виде бесклеточного вируса 10 циклов в клетках МТ-2 в отсутствие лекарственного средства. Устойчивый к D-D4FC вирус отбирали путем серийного высева ВИЧ-l_LAI в клетках МТ-2 в присутствии постепенно растущих концентраций D-D4FC. Отбор устойчивых к D-D4FC вирусов проводили дважды. Отбор начинали путем инокуляции 1×10⁶ клеток МТ-2 0,01 моль вируса. На пике цитопатического эффекта вируса (4-7 суток после инфекции), супернатант отбирали из инфицированных культур и 0,1-0,3 мл использовали далее для начала нового цикла инфекции. Супернатант также разделяли на аликвоты и хранили при -80°С для охарактеризования отобранного вируса. Вирус высевали по крайней мере трижды при каждой концентрации, причем число циклов при каждой конкретной концентрации лекарственного средства зависело от способности вируса к размножению при конкретной концентрации D-D4FC. В ходе первой процедуры отбора вирус высевали один раз в отсутствие лекарственного средства до повышения концентрации лекарственного средства (таблица 2). В качестве контроля параллельно также высевали вирус в отсутствие лекарственного средства. Первую процедуру отбора начинали при 0,75 мкМ и постепенно повышали концентрацию до 4,0 мкМ в течение 37 циклов бесклеточных посевов. Вторую процедуру отбора начинали при 0,2 мкМ и постепенно повышали концентрацию до 6,2 мкМ в течение 27 циклов бесклеточных посевов (таблица 2).

Таблица 2
Отбор №1	Отбор №2
Число посевов	[D-Fd4C], мкМ	Число посевов	[D-Fd4C], мкМ
1-2	0,75	1-3	0,2
3-4	1,5	4-6	0,4
5	1,0	7-9	0,8
6	0	10-12	1,6
7-9	1,5	13	3,2
10-12	2,0	14-16	1,6
13-16	3,0	17-19	3,2
17	0	20-22	4,8
18-20	4,5	23-25	6,2
21	0	26	12,0
22-35	4,5	27	6,2
36-38	1,0
39-41	2,0
42-43	4,0

Анализы чувствительности вируса. Чувствительность вируса к D-D4FC измеряли путем измерения процентного ингибирования продукции антигена р24. Вкратце, клетки МТ-2 (1×10⁵ клеток/мл) инфицировали вирусом при moi 0,01 в присутствии серийных разведений D-D4FC. Каждое разведение тестировали трижды. Культуральные супернатанты собирали на 7 сутки после инфекции и исследовали на предмет продукции антигена р24, используя коммерчески доступную тест-систему (DuPont, NEN Products, Wilmington, Del.). Чувствительность вируса выражали как концентрацию лекарственного средства, требующуюся для ингибирования продукции антигена р24 на 50% (EC₅₀).

Секвенирование ДНК отобранной вирусной обратной транскриптазы. Вирусную РНК (вРНК) из отобранного вируса выделяли, используя реагент TRIzol (GibcoBRL, Grand Island, NY). Полноразмерную кодирующую ОТ область амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР. Продукт ПЦР далее очищали, используя наборы для ПЦР Wizard (Promega, Madison, WI), и секвенировали.

Получение мутантного рекомбинантного ВИЧ-1. Мутантную ОТ получали, используя систему мутагенеза in vitro Altered SitesII (Promega, Madison, WI). Мутагенез проводили на ВИЧ-l_LAI, ОТ клонировали в вектор мутагенеза (PALTER, Promega). Наличие желаемой мутации определяли путем прямого секвенирования гена ОТ. Мутантную ОТ далее лигировали в вектор pxxHIV-1_LAI. Маточные растворы вируса получали путем электропорирования 5-10 мкг ДНК в 1,3×10⁷ клеток МТ-2, как описано выше.

Результаты и обсуждение

Фенотипирование устойчивого вируса. Вирус, устойчивый к D-D4FC, отбирали после 37 (отбор №1) и 20 (отбор №2) циклов инфекции в клетках МТ-2. Оценка чувствительности к D-D4FC вируса из посева 37 отбора №1 (р37 D-D4FC#1) показала, что р37 D-D4FC#1 в 19,4 раза менее чувствителен к D-D4FC, чем дикий тип, что выражается в увеличении значения EC₅₀ с 0,21 мкМ до 4,07 мкМ (фиг.2, таблица 3). Оценка чувствительности к D-D4FC вируса из посева 20 отбора №2 (р20 D4FC#2) показала, что р20 D-D4FC#2 в 5,3 раза менее чувствителен к D-D4FC, чем дикий тип, что выражается в увеличении значения EC₅₀ с 0,21 мкМ до 1,1 мкМ (фиг.2, таблица 3).

Генотипирование устойчивого вируса. вРНК из р37 D-D4FC#1 и р20 D-D4FC#2 выделяли и подвергали амплификации с помощью ОТ-ПЦР. Секвенирование продукта ПЦР выявило наличие трех новых мутаций в р37 D-D4FC#1: K70N (ААА→4ААТ), V901 (GTT→ATT) и R172K (AGA→AAA) (таблица 2). Две различные мутации были обнаружены в р20 D-D4FC#2: K65R (AAA→AGA) и V179D (GTT→GAT) (таблица 3). Других мутаций генов ОТ данных вирусов обнаружено не было (по аминокислотам 8-330). Кроме того, мутации не были обнаружены в контрольных вирусах, высеваемых параллельно в отсутствие лекарственного средства.

Выделение устойчивых к D-D4FC вирусов с различными ассоциированными мутациями может являться результатом различных методик отбора, применяемых для выделения устойчивого к D-D4FC вируса. В отборе №1 давление отбора снимали на один цикл инфекции до повышения концентрации лекарственного средства. Этого не было сделано в ходе второй процедуры отбора. Кроме того, исходная концентрация D-D4FC, примененная в каждой из процедур отбора, варьировалась приблизительно в 3 раза. Гораздо более высокая исходная концентрация лекарственного средства применялась для отбора №1 (0,75 мкМ). Данные два различия, вероятно, вызвали различные мутации, наблюдаемые в отобранных вирусах.

Мутантный рекомбинантный ВИЧ-1. Мутантный рекомбинантный ВИЧ-1, содержащий мутации, обнаруженные в отобранных вирусах, получали с помощью сайт-направленного мутагенеза. В таблице 4 перечислен каждый полученный мутантный рекомбинантный вирус, равно как и соответствующее значение EC₅₀. В то время, как вирус xxHIV-1_LAI, K65R проявил 3,9-кратное снижение чувствительности к D-D4FC, ни один другой вирус не проявил более чем 3,0-кратной устойчивости. Следует отметить, однако, что тройной мутант (xxHIV-1_LAI, K70N/V90I/R172K) размножался плохо, и это могло быть причиной неспособности воспроизводить устойчивость, наблюдаемую в отобранном in vitro вирусе.

Таблица 3.Чувствительность и ассоциированные мутации отобранного с помощью D-D4FC вируса в клетках МТ-2
Вирус	EC50 (мкМ)	Кратность устойчивости	Мутации по сравнению с контролем
HIV-1LAIp0	0,21	-	-
HIV-1p37 D-Fd4C#1	4,07	19,4	K70NV90IR172K
HIV-1p20 D-Fd4C#2	1,11	5,3	K65R V179D

Таблица 4.Чувствительность к D-D4FC рекомбинантного ВИЧ-1 в клетках МТ-2
Вирус	EC50	Кратность устойчивости
xxLAI	0,32	-
xxK65R	1,24	3,9
xxLAI	0,17	-
xxK70N	0,24	1,4
xxV90I	0,25	1,5
xxLAI	0,28	-
xxR172K	0,23	0,8
xxV90I/R172K	0,36	1,3
xxLAI	0,13	-
xxK70N/V90I/R172K	0,056	0,4

В таблице 5 приведены значения средней эффективной концентрации и индекса комбинаций (ИК) для D-D4FC в отдельности и в сочетании с AZT и D4T в остро инфицированных человеческих клетках РВМ (6 сутки). В таблице 6 описан эффект β-D и β-L-D4FC против ВИЧ-1 и клонируемых вирусов в человеческих клетках РВМ.

III. Сочетание или чередование анти-ВИЧ средств

Как правило, при чередующейся терапии эффективную дозу каждого агента вводят серийно, тогда как при сочетанной терапии эффективную дозу двух или более агентов вводят совместно. При чередующейся терапии, например, один или несколько первых агентов могут вводиться в эффективном количестве в течение эффективного периода времени для лечения вирусной инфекции, а затем могут вводиться один или несколько вторых агентов, замещающих указанные первые агенты в традиционных схемах лечения и аналогичным образом вводимых в эффективном количестве в течение эффективного периода времени.

Дозировки будут зависеть от таких факторов, как скорость всасывания, биологическое распределение, метаболизм и выведение каждого лекарственного средства, равно как и от других факторов, известных специалистам в данной области. Следует также отметить, что значение дозировки будет также варьироваться в зависимости от тяжести подлежащего лечению состояния. Следует также понимать, что для каждого конкретного субъекта должны быть разработаны особые временные режимы и схемы введения в зависимости от индивидуальной потребности и профессионального мнения лица, осуществляющего или наблюдающего за введением композиций. Примеры подходящих интервалов дозировок анти-ВИЧ соединений, включая нуклеозидные производные (например, AZT, D4T, DDI и 3ТС) или ингибиторы протеаз, например нелфинавир и индинавир, можно найти в научной литературе и в справочниках терапевта. Множество примеров подходящих интервалов дозировок других соединений также можно найти в опубликованной литературе или установить в соответствии с известными методиками. Данные интервалы дозировок могут быть модифицированы по желанию для достижения желаемого результата.

В одном предпочтительном осуществлении D-D4FC вводят в сочетании с ингибитором протеаз. В конкретных осуществлениях D-D4FC вводят в сочетании или чередовании с индинавиром (Crixivan), нелфинавиром ([3S-[2(2S*,3S*), 3-альфа,4-а-бета, 8а-бета]]-N-(1,1-диметилэтил)декагидро-2-)2-гидрокси-3-[(3-гидрокси-2-метилбензоил) амино]-4-(фенилтио)бутил]-3-изохинолинкарбоксамида монометансульфонатом) (Viracept), саквинавиром (Invirase) или 141W94 (ампренавиром; (S)-тетрагидрофуран-3-ил-N-[(1S,2R)-3-[N-[(4-аминофенил)сульфонил]-N-изобутиламино]-1-бензил-2-гидроксипропил] карбаматом); или эфавиренцем (efavirenz) ((S)-6-хлор-4-(циклопропилэтинил)-1,4-дигидро-4-(трифторметил)-2Н-3,1-бензоксазин-2-оном).

В другом предпочтительном осуществлении D-D4FC вводят в сочетании или чередовании с нуклеозидным аналогом, включая абакавир (1592U89), который представляет собой (1S,4R)-4-[2-амино-6-циклопропиламино)-9Н-пурин-9-ил]-2-циклопентен-1-метанола сукцинат.

В другом осуществлении D-D4FC вводят в сочетании с ненуклеозидным ингибитором обратной транскриптазы, таким как DMP-266 ((S)-6-хлор-4-циклопропилэтинил-4-трифторметил-1,4-дигидро-2Н-3,1-бензоксазин-2-он) (SUSTIVA, смотри патент США №5519021); делавирдин (1-[3-(1-метилэтил)амино]-2-пиридинил-4-[[5-[(метилсульфонил)амино]-1Н-индол-2-ил]карбонил]моноэтансульфонат), невирапин или деларвирдин.

В других осуществлениях D-D4FC вводят в сочетании или чередовании с ингибитором ВИЧ-интегразы или ингибитором хемокина.

II. Анализ индуцированной D-D4FC мутации генома ВИЧ

Для анализа присутствия мутаций, индуцированных D-D4FC, могут быть использованы способы и наборы, сходные с таковыми, описанными в патенте США №5409810, выданном Larder et al., для AZT, но основанные на профиле мутаций для D-D4FC, и, таким образом, они образуют часть настоящего изобретения, представленного здесь. В дополнение к включению патента Larder в качестве ссылки во всей полноте, данные методики изложены ниже.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу оценки чувствительности образца ВИЧ-1 к D-D4FC, который предусматривает:

(i) выделение нуклеиновой кислоты из образца,

(ii) гибридизацию олигонуклеотида с нуклеиновой кислотой, причем олигонуклеотид комплементарен области последовательности ДНК дикого типа (или соответствующей ей РНК) или области мутантной последовательности ДНК (или соответствующей ей РНК);

(iii) попытку полимеризации нуклеиновой кислоты с 3'-конца олигонуклеотида,

(iv) проверку факта присутствия удлиненного продукта олигонуклеотидного праймера.

В данной методике может быть использована геномная ДНК или РНК, выделенная из образцов ВИЧ-1. Подходящие клетки для поддержания роста изолята ВИЧ-1 инкубируют в течение некоторого периода времени. Клетки выделяют путем центрифугирования. ДНК может быть затем выделена путем разрушения клеток протеиназой К в присутствии ЭДТА и детергента, такого как ДСН, с последующей экстракцией добавлением фенола.

Для выделения ДНК из образца доступны широко известные методики экстракции и очистки. РНК может быть выделена с использованием следующей методики. Подходящие клетки инфицируют и инкубируют в течение некоторого периода времени. Клетки выделяют путем центрифугирования. Клетки ресуспендируют в буфере для экстракции РНК с последующим разрушением с использованием буфера для протеиназного разрушения и разрушением протеиназой К. Белки удаляют в присутствии смеси фенол/хлороформ. РНК может быть затем выделена с помощью следующих стадий центрифугирования (Maniatis, Т., et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)).

Хотя можно применять неамплифицированную нуклеиновую кислоту, вследствие относительной редкости нуклеиновой кислоты в образце ВИЧ-1 предпочтительно ее амплифицировать. Нуклеиновая кислота может быть селективно амплифицирована с использованием технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая представляет собой in vitro методику получения больших количеств конкретного фрагмента нуклеиновой кислоты определенной длины и последовательности с малых количеств матрицы.

ПЦР состоит из стандартных условий реакции, включая концентрацию Mg²⁺, олигонуклеотидные праймеры и температурные условия проведения циклов. Выбирают такие праймеры, которые амплифицируют полноразмерный ген ОТ или выбранную последовательность, которая включает нуклеотиды, соответствующие области ДНК ВИЧ-1 дикого типа, которая включает мутированный кодон.

РНК не может подвергаться непосредственной амплификации путем ПЦР. Должна быть синтезирована соответствующая ей кДНК. Синтез кДНК, как правило, проводят путем праймированной обратной транскрипции с применением олиго-dT праймеров. Преимущественно, выбирают такие праймеры, которые упрощают последовательность нуклеиновой кислоты для ОТ или выбранную последовательность, которая включает нуклеотиды, соответствующие области РНК, соответствующей последовательности ДНК дикого типа или области мутантной последовательности ДНК, соответствующей 70-му (К на N), 90-му или 172-му кодону области обратной транскриптазы. Это может быть достигнуто путем получения олигонуклеотидного праймера, который комплементарен области цепи РНК, которая находится выше соответствующей последовательности ДНК дикого типа. кДНК, полученная в соответствии с данной методикой (смотри Maniatis, Т., et al., supra), может быть далее применена так же, как и уже обсуждавшаяся ДНК.

Следующей стадией методики является гибридизация с нуклеиновой кислотой олигонуклеотида, который комплементарен области последовательности ДНК дикого типа (или соответствующей ей РНК) или области мутантной последовательности ДНК (или соответствующей ей РНК).

Далее предоставляются условия и реагенты, обеспечивающие протекание полимеризации нуклеиновой кислоты с 3'-конца олигонуклеотидного праймера. Такие реакции полимеризации широко известны в данной области.

Если олигонуклеотидный праймер содержит на своем 3'-конце нуклеотид, который комплементарен мутантному генотипу, который представляет собой генотип, который содержит нуклеотидную замену по 70-му (К на N), 90-му или 172-му кодону области ОТ, полимеризация последовательности нуклеиновой кислоты происходит лишь в случае, если нуклеиновая кислота образца такая же, что и мутантный генотип. Полимеризация последовательности нуклеиновой кислоты дикого типа не будет происходить или по крайней мере не будет происходить в значительной степени вследствие несовпадения нуклеотидов на 3'-конце олигонуклеотидного праймера и последовательности нуклеиновой кислоты из образца.

Если олигонуклеотидный праймер содержит на своем 3'-конце нуклеотид, который комплементарен генотипу дикого типа, который представляет собой генотип, который содержит нуклеотид дикого типа в 70-м (К на N), 90-м или 172-м кодоне области ОТ, будет иметь место полимеризация последовательности нуклеиновой кислоты, которая соответствует дикому типу по данному положению. Полимеризация не будет происходить с нуклеиновой кислотой, которая содержит мутантный нуклеотид в 3'-положении.

Предпочтительная длина каждого нуклеотида составляет 15-20 нуклеотидов. Олигонуклеотид может быть получен в соответствии с методикой, хорошо известной специалистам в данной области (Koster, H., Drug Research, 30, р.548 (1980); Koster, H., Tetrahedron Letters, p.1527 (1972); Caruthers, Tetrahedron Letters, p.719, (1980); Tetrahedron Letters, p.1859, (1981); Tetrahedron Letters, 24, р.245, (1983); Gate, M. Nucleic Acid Research, 8, p. 1081, (1980)), и, как правило, его получают с применением автоматизированного ДНК-синтезатора, такого как синтезатор Applied Biosystems 381A.

Существует удобный способ определять наличие удлиненного продукта олигонуклеотидного праймера. Инструментом для проведения определения является подходящая метка.

Метка может быть подходящим образом прикреплена к олигонуклеотидному праймеру или к какой-либо другой молекуле, которая будет связываться с удлиненным продуктом олигонуклеотидного праймера.

Метка может представлять собой, например, фермент, радиоизотоп или флуорохром. Предпочтительной меткой может являться биотин, который может быть впоследствии определен с помощью стрептавидина, конъюгированного с ферментом, таким как пероксидаза или щелочная фосфатаза. Присутствие удлиненного продукта олигонуклеотидного праймера может бы