Способ титрования антирабических вируснейтрализующих антител

Способ титрования антирабических вируснейтрализующих антител

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, а именно к способу титрования вируснейтрализующих антител против бешенства в сыворотке крови вакцинированных животных, основанному на ингибиции цитопатического действия (ЦПД) вируса бешенства в культуре клеток, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.

Наиболее распространенным тестом определения антирабических вируснейтрализующих антител в крови животных является реакция нейтрализации на мышах, разработанная еще в 1935 г. (Webster L., Dawson J. Diagnosis of rabies by mouse inoculation. Measurement of humoral immunity to rabies by mouse protection test // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1935. - Vol.32. - P.570-573). Однако несмотря на доказанные временем и практикой преимущества данного теста, он имеет некоторые недостатки: проведение исследования в течение 15-21 суток, относительно дорогая стоимость животных и использование живого вируса, что связано с опасностью для исследователя.

В настоящее время для титрования антирабических антител in vitro разработаны и применяются различные методы.

Для мониторинга уровня специфических антител в сыворотке крови привитых животных, в частности, применяется твердофазный иммуноферментный анализ (ТФ ИФА) (Nicholson K.G., Prestage H. Enzyme-linked immunosorbent assay: A rapid reproducible test for the measurement of rabies antibody // J.Med.Virol. - 1982. - Vol.9, №1. - P.43-49; Smith J.S., Karamany R.M., Kazar J., Malik S.A., Badriya M. Rapid quantitative assay of rabies post-vaccination antibody by ELISA //APMIS. - 1988. - Vol.96, №3. - P.40-43.; Ботвинкин А.Д. Обнаружение антител к вирусу бешенства с помощью ИФА в пробах крови собранных на бумажные диски// Лабораторное дело. - 1988. - №3. - С.73-75; Сазанова Э.Я., Кузнецова С.В., Маслов Е.В., Боцко А.А. Иммуноферментный анализ при индикации вируса бешенства и определение уровня антител // Ветеринария. - 1991. - №8. - С.62-64). Данный тест может выполняться в практических условиях, и результаты могут быть получены в течение нескольких часов. Однако, кроме вируснейтрализующих антител, этот метод определяет также различные антитела других типов, при этом отсутствует корреляция результатов с данными реакции нейтрализации на мышах.

Для определения вируснейтрализующих антирабических антител применяется реакция ингибиции фокусов флуоресценции, выполненная на перевиваемых культурах клеток ВНК-21, почки сайги (ПС) с использованием вируса бешенства, штаммы ERA, CVS, Внуково-32/107, ТС-80 (Zaian E. et. al. A microtest for the quantitation of rabies virus neutralising antibodies // J. Biol. Stand. - 1979. - №7. - P.213-220; Lyng J. Potency assay of antibodies agains rabies. A report on a collaborative study// J.Biol. Stand. - 1989. - Vol.17, №3. - P.267-280; Сологуб Т.В. Разработка и совершенствование средств и методов диагностики бешенства// дисс. канд. биол. наук. - Покров, 1993; Zavadova J. et. al. Titration of antibodies by rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT)// Veter. Med. (Praha). - 1996. - Vol. 41, №.7. - P.225-230; Недосеков В.В. с соавт. Титрование антирабических антител с помощью теста ингибиции фокусов флуоресценции //Ветеринария. - 1998. - N. 7. - 28-30 и др.).

Принцип постановки реакции в приведенных источниках практически идентичен и заключается в том, что разведения сывороток смешивают с равным объемом вируса и инкубируют при 37°С в течение 90 минут, после чего реакционную смесь вносят в соответствующую культуру клеток и инкубируют 72 часа при 37°С. Затем культуру клеток фиксируют, обрабатывают антирабическими иммуноглобулинами конъюгированными с флуоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ-конъюгат) и посредством люминесцентной микроскопии проводят учет реакции.

Предложенные методы предполагают фиксацию клеток формалином или ацетоном, которые представляют собой токсичные препараты, и использование высокоспецифичных антирабических иммуноглобулинов, конъюгированных с флуоресцеинизотиоционатом, что несколько усложняет технологию тестирования сывороток крови животных и повышает себестоимость анализа.

Прототипом настоящего изобретения является разработанный нами ранее тест ингибиции фокусов флуоресценции, включающий взаимодействие компонентов реакционной смеси (вируса бешенства, штамм ТС-80, со специфической сывороткой) в течение 90 мин, оцениваемое по ингибиции фокусов флуоресценции в культуре клеток ПС (Недосеков В.В. с сотр. Титрование антирабических антител с помощью теста ингибиции фокусов флуоресценции // Ветеринария. - 1998. - №7. - С.28-30. Пат. №2130187 RU).

Целью предлагаемого изобретения является разработка чувствительного, более технологичного и экономически обоснованного способа титрования антирабических вируснейтрализующих антител, имеющего корреляцию с результатами титрования антител в тесте ингибиции фокусов флуоресценции.

Поставленная цель достигается тем, что используется вакцинный штамм 71БелНИИЭВ-ВГНКИ (РБ-71), адаптированный к культуре клеток ПС, в которой проводится инкубирование реакционной смеси вирус-сыворотка в течение 60 мин, с последующим определением, на 5-7 сутки, титра вируснейтрализующих антител по ингибиции цитопатического действия вируса в культуре клеток ПС.

В отечественной литературе материалов и результатов подобных исследований нет.

ПРИМЕРЫ КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

ПРИМЕР 1.

Испытуемые сыворотки, полученные от вакцинированных животных, инактивировали при 56°С в течение 30 мин, затем в 96-луночных панелях для микрокультивирования готовили двукратные разведения на среде Игла (MEM) в объеме 50 мкл. Разведенные сыворотки смешивали с равным объемом культурального вируса бешенства, шт. РБ-71, содержащим 50-100 ККИД₅₀ (рабочее разведение). Приготовленные таким образом реакционные смеси инкубировали в течение 60 мин при 37°С, после чего вносили в односуточную интактную культуру клеток ПС, выращенную в 96-луночных панелях, предварительно удалив из лунок культуральную среду.

Панели помещали в СО₂-инкубатор (при 37°С с содержанием 5% углекислого газа и 95% влажности). Контролями служили лунки с используемой дозой вируса, смесью вируса с заведомо положительной (специфической) и отрицательной (нормальной) сыворотками, а также интакной культурой клеток.

Начиная с 4 суток культуру клеток в панелях просматривали при помощи инвертированного светового микроскопа Olympus, увеличение х40-80. В лунках с контролем вируса и нормальной сывороткой наблюдалось ярко выраженное ЦПД, которое характеризовалось набуханием пораженных клеток ПС, их округлением с появлением зернистости в цитоплазме, последующим разрушением и отделением от стекла, в то же время в лунках со специфической сывороткой ЦПД не проявлялось (нейтрализация вируса), что указывает на наличие в испытуемых сыворотках антирабических вируснейтрализующих антител.

ПРИМЕР 2.

Подготовку испытуемых сывороток с последующим приготовлением смеси вирус-сыворотка проводили аналогично схеме, описанной в примере 1. По истечении срока инкубирования реакционных смесей (60 мин при 37°С) в каждую лунку панелей вносили 100 мкл суспензии культуры клеток ПС в концентрации 300-500 тыс. клеток/см³, после чего планшеты помещали в СO₂-инкубатор (при 37°С с содержанием 5% углекислого газа и 95% влажности). Последующие этапы осуществляли согласно предыдущей методике.

Учет результатов реакции проводили на 5-7 сутки. Титром антирабических антител в испытуемом материале являлось предельное разведение сыворотки, при котором наблюдалось 50%-ное подавление цитопатического действия вируса на культуру клеток, т.е. нейтрализация вируса. При проведении исследований результаты определения антител в обоих примерах были аналогичны.

Результаты исследования сывороток крови тестом ингибиции фокусов флуоресценции и предлагаемой нами реакцией нейтрализации в культуре клеток ПС приведены ниже (табл. 1).

Таблица 1Результаты титрования вируснейтрализующих антител в тесте ингибиции фокусов флуоресценции и реакции нейтрализации в культуре клеток ПС
№п\п	Номер сыворотки	Тест ингибициифокусов флуоресценции	Реакция нейтрализации в культуре клетокПС
Сыворотки крови овец
1.	№1	1:270	1:270
2.	№2	1:90	1:90
3.	№3	1:30	1:30
4.	№4	1:30	1:30
5.	№5	1:90	1:90
6.	№6	1:270	1:270
Сыворотки крови собак
7.	№54	1:9	1:9
8.	№75	1:27	1:27
9.	№17	1:81	1:81
10.	№70	1:27	1:9
11.	№65	1:9	1:9
12.	№99	1:9	1:9
13.	№1	1:9	1:9
14.	№3	1:27	1:27
15.	№5	1:9	1:9
16.	№11	1:270	1:270
17.	№18	1:9	1:9
18.	№24	1:90	1:90
19.	№28	1:27	1:27
20.	№32	0	0
21.	№36	1:3	1:3
Сыворотки крови лисиц
22.	№1	1:8	1:8
23.	№2	1:16	1:16
24.	№3	1:16	1:16
25.	№5	1:64	1:64
26.	№7	1:8	1:8
27.	№11	1:16	1:16

Как видно из данных, приведенных в табл. 1, результаты тестирования сывороток двумя методами были идентичны.

С целью сокращения времени и оптимизации условий постановки реакции нами проведены исследования по влиянию времени инкубирования смеси вирус-сыворотка на результаты реакции (табл. 2).

Таблица 2Изучение влияния времени инкубации реакционной смеси на результаты титрования вируснейтрализующих антител
№	сыворотки	Титр антител в зависимости от времени инкубирования смеси вирус-сыворотка
		30 мин	60 мин	90 мин	120 мин
1.	овца 1	1:243	1:243	1:243	1:243
2.	овца 2	1:27	1:81	1:81	1:81
3.	овца 5	1:81	1:81	1:81	1:81
4.	овца 6	1:243	1:729	1:729	1:729
5.	фракция 1	1:90	1:270	1:270	1:270
6.	фракция 2	1:270	1:729	1:270	1:270

По данным табл. 2 видно, что оптимальным временем инкубирования смеси вирус-сыворотка является 60 мин (в отличие от традиционных 90 мин).

Таким образом, результаты титрования антирабических антител предложенным нами способом соответствуют результатам теста ингибиции фокусов флуоресценции. Предложенный способ титрования антирабических вируснейтрализующих антител прост в исполнении, высокочувствителен и является технологичным и экономически обоснованным, в связи с отсутствием необходимости использования токсичных фиксаторов и ФИТЦ-конъюгата и может быть использован при оценке иммунного статуса у животных, вакцинированных против бешенства.

Способ титрования антирабических вируснейтрализующих антител, включающий взаимодействие вакцинного вируса бешенства с исследуемыми сыворотками, отличающийся тем, что используют штамм 71 БелНИИЭВВГНКИ, реакционную смесь вирус - сыворотка инкубируют 60 мин при 37°С, вносят суточную интактную культуру клеток почки сайги и помещают в СО₂-инкубатор с последующим определением на 5-7 сутки титра вируснейтрализующих антител по предельному разведению сыворотки, при котором наблюдалось 50%-ное подавление цитопатического действия вируса на культуру клеток.