Способ получения с1-эстеразного ингибитора человека и продукт для использования в медицине

Способ получения с1-эстеразного ингибитора человека и продукт для использования в медицине

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области биотехнологии, фармации и медицины и касается нового способа получения Cl-эстеразного ингибитора, фармацевтический продукт которого в последнее время все шире используется в медицине.

Cl-эстеразный ингибитор является белком крови (молекула представляет собой цепь из 478 аминокислотных остатков, молекулярная масса 105 кДа) и основным ингибитором классического пути системы комплемента, непрямым ингибитором калликреин-кининовой, свертывающей и фибринолитической систем, которые, в свою очередь, продуцируют биологически активные белки. То есть Cl-эстеразный ингибитор является одним из регуляторов системы развития воспалительной реакции организма, а также ингибирует активированный фактор XI и может служить ингибитором коагуляции, а также тканевого активатора плазминогена и плазмина (A. Groner et al., US 6242239).

Такая роль Cl-эстеразного ингибитора в организме предопределила возможность его использования в заместительной терапии при ангионевротических отеках, для профилактики и лечения сепсиса, в том числе тяжелого, и септического шока, для профилактики и лечения полиорганной дисфункции, синдрома повышенной проницаемости капилляров при сепсисе и септическом шоке, для профилактики и лечения острого респираторного дистресс-синдрома, для адъювантной терапии при атеросклеротическом поражении сосудов любой локализации, для профилактики и лечения ишемического инсульта и его осложнений, повторного острого нарушения мозгового кровообращения, профилактики и лечения шоковых состояний в операционном и послеоперационном периодах при аортокоронарном шунтировании, для предупреждения и лечения шоковых состояний при проведении транслюминальной ангиопластики, для профилактики и лечения синдрома реперфузии после аортокоронарного шунтирования и транслюминальной ангиопластики в комбинации с прямыми антикоагулянтами, для профилактики и лечения реакции отторжения при трансплантации органов и тканей (в том числе - костного мозга), для лечения или предупреждения системных ревматологических заболеваний, протекающих с активацией комплемента (системная красная волчанка, системная склеродеромия, дерматомиозит, ревматоидный артрит и т.д.), для профилактики и лечения осложнений у больных с травматологическими повреждениями различной локализации, для адъювантной терапии любых состояний, в том числе - новообразований, протекающих с активацией системы комплемента.

Важным показателем Cl-эстеразного ингибитора является его специфическая активность, выражаемая как ед/мг белка или МЕ/мг белка (здесь и далее - международных единиц) или U/mg (IU/mg).

Однако доказанное исследовательскими работами многообразие функций Cl-эстеразного ингибитора не позволяет широко использовать его в медицинской практике ввиду невысокой чистоты получаемого до сих пор препарата: наилучшие результаты, показанные W.Schoenhofel et al. (EP 1244706) для трансгенного Cl-эстеразного ингибитора в результате сложной и дорогой системы очистки, не превышали 6 ME на 1 мг белка при декларируемой теоретически возможной (но практически не подтвержденной) активности до 8 МЕ/мг (активность определяется общепринятым в настоящее время методом с использованием тест-системы Berichrom Cl-INH, Dade-Behring Diagnostics). He стоит игнорировать и нежелательные побочные эффекты, вызванные введением в организм чужеродных белков (аллергические реакции, тромбоз вен и т.п.) (Caiezi С. et al. Pharmacological Reviews 2000, v.52 (1): 91-112).

Основная задача данного изобретения - получение продукта, содержащего природный Cl-эстеразный ингибитор из плазмы крови с изначально высокой активностью, от 7,5±0,5 МЕ/мг белка и более.

Предшествующий уровень техники

Известны способы получения Cl-эстеразного ингибитора из плазмы крови человека. Все они сводятся к комбинации методов предварительной очистки белка с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) и двух-трех хроматографических стадий. Однако либо это были лабораторные подходы, которые трудно масштабировать для широкого промышленного производства (Harrison R. Biochemistry, 1983, 22, 5001-5007), либо использовались дорогостоящие аффинные носители (Pilatte Y.M. et al., US 5030578), либо метод давал невысокий выход конечного продукта и имел ряд технических и экономических недостатков (Poulle M. et al., US 5681750), либо выделялся неактивный Cl-ингибитор (Розина М.Н. и др. РФ 2068693), либо предлагаемый подход не давал хорошего выхода конечного препарата с высокой удельной активностью по причине отсутствия эффективных стабилизаторов на этапах проведения вирусной инактивации (Schoenhofer W. et al. EP 1244706).

Подбор эффективных стабилизаторов играет важную роль при проведении процессов вирусной инактивации, таких как обработка сольвент/детергентом или тепловая обработка, поскольку известно, что эти факторы могут приводить к необратимым конформационным изменениям серпинов (Mast A.E. et al., Blood 1999, 94, 11, 3922-3927), что, в свою очередь, отрицательно сказывается на их активности.

Для стабилизации белков широко используются сахара, полиолы, полимеры, аминокислоты (См., например: Структура и стабильность биологических макромолекул под ред. Тимашеффа С.Н. и Фасмана Г.Д. M.: Мир, 1973; Привалов П.С. Биофизика 1987, 32, 742-759; Введение в прикладную этимологию под ред. Березина И.В. и Мартинека К. M.: МГУ, 1982; Айсина Р.Б. и др. Биоорганическая химия 1994, 20, 2, 182-189). Выбор стабилизатора определяется как природой стабилизируемого белка, так и природой воздействия.

В частности, вышеперечисленные сахара, аминокислоты, соли органических кислот (натрия каприлат, цитраты калия, натрия или аммония) ранее применяли для стабилизации Cl-эстеразного ингибитора в процессе его получения (Craigenne A.W. US 4379085; J Eibl et al US 5733885).

Поскольку наибольшей эффективностью при противовирусной обработке плазмы и ее компонентов является комбинация методов, подбор наиболее эффективной защиты для целевого белка является непростой задачей. Для Cl-эстеразного ингибитора данный аспект малоизучен. Видимо, это и является одной из основных причин низкого выхода целевого белка для большинства заявленных способов его выделения и очистки. Повышение же качества конечного препарата наряду с очевидными преимуществами позволяет значительно расширить область его применения.

Наиболее близким по сущности к предлагаемому изобретению является способ получения Cl-эстеразного ингибитора, изложенный Poulle M. et al. в US 5681750.

В способе-прототипе (Poulle M. et al. US 5681750) особенности получения Cl-эстеразного ингибитора состояли в том, что свободная от криопреципитата плазма подвергалась предварительной очистке от витамин К-зависимых белков на колонне с ДЕАЕ-сефарозой и от антитромбина Ш - на гепарин-сефарозе. Полученная таким образом фракция, содержащая Cl-эстеразный ингибитор, наносилась на слабый анионообменник (ДМАЕ-типа) для освобождения от сопутствующих белков (альбумина, иммуноглобулинов, альфа-антитрипсина, альфа-2-макроглобулина и т.д.).

После проведения антивирусной обработки сольвент/детергентом (об изменении активности целевого белка в ходе такой процедуры авторы не сообщают) смесь наносится на сильный катионообменник для удаления антивирусных агентов. Фракционирование на этом носителе позволяет освободиться от IgM. После этапа концентрирования и диализа на ультрафильтрационной мембране проводят заключительную процедуру удаления вирусов. Для этого авторы предлагают использовать нанофильтрацию последовательно на фильтрах с диаметром пор 35 нм и 15 нм. Готовый продукт имел специфическую активность около 6 ед/мг белка.

Очевидно, что использованная комбинация методов в способе-прототипе имеет ряд недостатков. Во-первых, данный способ может существовать только сам по себе, и его нельзя внедрить в качестве модуля в процесс фракционирования плазмы по Кону, что делает его экономически невыгодным. Во-вторых, в способе-прототипе не учтен тот факт, что серпины, к которым относится и Cl-эстеразный ингибитор, могут заметно терять свою активность при антивирусной обработке сольвент-детергентами (Mast A.E. et al., Blood 1999, 94, 11, 3922-3927).

Раскрытие изобретения

В связи с этим была поставлена задача - разработать способ получения концентрата Сl-эстеразного ингибитора, лишенный этих недостатков, используя легко масштабируемые стадии.

Заявляемый способ отличается тем, что из плазмы крови человека получают концентрат Сl-эстеразного ингибитора с удельной активностью в конечном препарате от 7,5±0,5 ед/мг белка и более, содержащий лизин в конечной концентрации не менее 10 мМ и глицин в конечной концентрации не менее 100 мМ. Способ включает следующие обязательные стадии в указанной последовательности: удаление белков плазмы с использованием ионообменников, фракционирование полиэтиленгликолем, добавление в полученный раствор глицина и лизина, проведение вирусной инактивации, удаление ее продуктов хроматографией и тонкую очистку конечного продукта от примесей.

При этом предпочтительно последовательное использование слабого и сильного анионообменника при разных значениях рН, а также выполнение тонкой очистки конечного продукта методом металл-хелаторной хроматографии; также предпочтительно, чтобы вирусную инактивацию проводили сольвент-детергентом.

Достоинством заявленного способа является возможность после использования ионообменников направления плазмы в процесс производства ее белковых препаратов спиртовым методом Кона.

Более подробно способ приведен на Фиг. 1 (схема получения концентрата Сl-эстеразного ингибитора):

- на первом, предварительном этапе освобождаются от белков протромбинового комплекса. Для этого свежезамороженную плазму размораживают, отделяют центрифугированием криопреципитат и к криосупернатанту добавляют сухой DEAE-сефадекс А-50 из расчета 1,5 г на литр криосупернатанта. После инкубации при постоянном перемешивании осадок отделяют фильтрованием. Осадок отправляют на регенерацию или получение компонентов протромбинового комплекса. К фильтрату после подведения рН до 5,5 уксусной кислотой добавляют сухой QАЕ-сефадекс из расчета 2,5 г на литр плазмы. После инкубации сефадекс с сорбированными на нем белками отделяют фильтрацией и подвергают последовательной промывке, рН фильтрата доводят до исходного уровня и возвращают для дальнейшего фракционирования по Кону.

Отфильтрованный осадок, содержащий QАЕ-сефадекс и сорбированные на нем белки, в том числе и Cl-эстеразный ингибитор, подвергают последовательной промывке сначала 100 мМ натрий ацетатньм буфером рН 5,5, содержащим 50 мМ хлорид натрия, затем 20 мм трис-НСl буфером рН 7,5, содержащим 200 мМ хлорид натрия. Элюцию проводят 20 мМ трис-НСl буфером рН 7,7, содержащим 1 М хлорид натрия.

Фракцию, содержащую Cl-эстеразный ингибитор, подвергают диафильтрации против 20 мМ трис-НСl буфера рН 7,4, содержащего 50 мМ хлорид натрия. Добавляют ПЭГ-6000 до концентрации 12% и инкубируют при перемешивании на холоде в течение часа. Центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут получают осадок голубого цвета и бесцветный супернатант.

Супернатант отделяют и добавляют глицин до конечной концентрации 100 мМ и лизин до конечной концентрации 10 мМ, подводят рН до 7,2 с помощью 0,5 М трис. К полученному раствору прибавляют твин 80 до конечной концентрации 1% и три(н-бутил)фосфат до конечной концентрации 0,3% для проведения инактивации вирусов. Процесс проводят при комнатной температуре в течение 6 часов. Потери активности при этом не наблюдается. В отсутствии же стабилизаторов активность падала примерно на 50% (Фиг. 2: Стабилизирующая роль глицина и лизина. А - активность Cl-эстеразного ингибитора до проведения процедуры вирусной инактивации, Б - активность Cl-эстеразного ингибитора при проведении вирусной инактивации в отсутствии глицина и лизина, В - активность Cl-эстеразного ингибитора при проведении вирусной инактивации в присутствии глицина и лизина). Для определения активности использовали тест-систему Berichrom Cl-INH, Dade-Behring Diagnostics, Германия (Плазма-калибратор Plasma S Dade-Behring). После проведения процедуры вирусной инактивации корректировали проводимость до 6,0 mS/cm.

Смесь наносилась на колонну с DEAE-сефарозой FF, уравновешенную 10 мМ трис буфером рН 7,0, содержащим 50 мМ хлорид натрия. Колонну промывали 10 мМ трис-НСl буфером рН 7,0, содержащим 100 мМ хлорид натрия. Элюцию целевого белка вели 10 мМ трис-НСl буфером рН 7,0, содержащим 250 мМ хлорид натрия.

Окончательная, тонкая очистка Cl-эстеразного ингибитора проводилась с использованием металлохелаторной хроматографии. Задача этого этапа - освободиться от минорных примесей. Целевой белок проходит через колонну, не сорбируясь, примесные же белки остаются связанными с носителем. С этой целью через колонну, наполненную Zn-хелатирующей сефарозой FF, уравновешенной 10 мМ трис буфером, содержащим 250 мМ хлорид натрия, рН 7,5, пропускали раствор белков, полученных на предыдущей стадии. Целевой белок проходил через колонну без задержки, на колонне сорбировались остатки неотделенного церуллоплазмина. Регенерацию колонны проводили 50 мМ натрий ацетатным буфером рН 4,0, содержащим 500 мМ хлорид натрия. После этого колону уравновешивали стартовьм буфером.

Выход целевого белка составлял 30-40%. Удельная активность Cl-эстеразного ингибитора в конечном препарате (концентрате) - 7,5±0,5 ед/мг белка; содержание лизина - не менее 10 мМ, глицина - не менее 100 мМ.

Для более детального представления предлагаемый способ может быть проиллюстрирован примером.

Пример (лучший вариант осуществления изобретения)

К 2 л криосупернатанта плазмы крови добавляем 3 г ДЕАЕ-сефадекса А50. После инкубации в течение 1 часа осадок отделяли фильтрацией. рН полученного таким образом фильтрата доводили 1М уксусной кислотой до 5,5. В конкретном примере на 1900 мл фильтрата добавляли 90 мл кислоты. Температуру раствора доводили до 5-8°С и добавляли сухой QAE-сефадекс А50 из расчета 2,5 г на 1 л плазмы. После двух часов инкубации сорбент со связанным Cl-эстеразным ингибитором отфильтровывали, а рН фильтрата доводили до 7,3-7,4. (Полученный раствор может быть использован для дальнейшего фракционирования, в частности по Кону). QAE-сефадекс со связанным с ним белками оставляли на фильтре и подвергали ступенчатой промывке. Процесс проводили при температуре 5-8°С. Вначале промывали 1 л 100 мМ натрий ацетатного буфера рН 5,5, содержащего 50 мМ хлорид натрия. После этого 1 литром 20 мМ трис-НСl буфера рН 7,5, содержащего 200 мМ хлорид натрия. Элюцию проводили 300 мл 20 мМ трис-НСl буфера рН 7,7, содержащего 1 М хлорид натрия. Элюат диализовали против 20 мМ трис-НСl буфера рН 7,4, содержащего 50 мМ хлорид натрия.

К 250 мл диализованного раствора было добавлено 79 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликоля 6000. Полученную суспензию перемешивали в течение 1 часа при температуре 5-8°С, после чего центрифугировали в течение 10 минут при 4000 об/мин.

К полученным 325 мл супернатанта добавляли глицин и лизин до конечной концентрации 100 мМ и 10 мМ соответственно, после чего корректировали величину рН с помощью 0,5 М трис, доводя до 7,25 единиц. Затем вносили 11% твин-80 до конечной концентрации в 1% и вновь корректировали рН, доводя его до 6,8-7,2 с помощью 0,5 М трис. После этого добавляли три-н-бутил-фосфат в количестве, необходимом для создания конечной концентрации в 0,3%. Суспензию перемешивали в течение 6 часов при комнатной температуре, после чего 2 М хлоридом натрия доводили проводимость раствора до величины 6,0-6,2 mS/cm, a pH до 6,8-7,0 с помощью 0,5 М трис.

Полученный раствор наносили на колонну, содержащую ДЕАЕ-сефарозу, уравновешенную 10 мМ трис-НСl буфером с pH 7,0, содержащим 50 мМ хлорид натрия и имеющему проводимость 6,0 mS/cm. Колонну промывали стартовым буфером, а затем 10 мМ трис-НСl буфером pH 7,0, содержащим 100 мМ хлорид натрия. Проводимость буфера 11,4 mS/cm. Целевой белок элюировали 10 мМ трис-НСl буфером pH 7,0, содержащим 250 мМ хлорид натрия.

100 мл раствора, содержащего целевой белок, пропускали через колонну, заполненную Zn-хелатирующей сефарозой и уравновешенной 10 мМ трис-НСl буфером pH 7,5, содержащим 150 мМ хлорид натрия. Регенерацию колонны проводили 50 мМ натрий ацетатным буфером pH 4,0, содержащим 0,5 М хлорид натрия.

Удельная активность Cl-эстеразного ингибитора в конечном препарате (концентрате) составляла 7,6 ед/мг белка, содержание лизина - не менее 10 мМ, глицина - не менее 100 мМ. Для оценки активности Cl-эстеразного ингибитора использовали тест Berichrom Cl-INH фирмы Dade-Behring Diagnostics, Germany.

Выход целевого продукта составил 37%. Полученный продукт был апирогенным, не проявлял токсичности в экспериментах на лабораторных животных (крысы, кролики), не вызывал аллергических реакций при внутрикожном или внутривенном введении.

Другим аспектом заявленного изобретения является фармацевтический продукт для использования в медицине, ветеринарии и/или в научно-исследовательских целях, содержащий концентрат Cl-эстеразного ингибитора, лизин в конечной концентрации не менее 10 мМ и глицин в конечной концентрации не менее 100 мМ, полученный способом, приведенным выше.

Продукт может быть представлен в виде раствора, лиофилизированного порошка (для чего указанный выше концентрат переносят во флаконы и сушат при замораживании под вакуумом), также он может дополнительно содержать традиционные фармацевтические наполнители, носители, растворители и/или эксципиенты, приемлемые для парентерального (например, внутривенного - струйно или инфузией, внутримышечного, внутрисуставного, коронарного, подкожного, внутрикожного, интраорбитального и/или интракраниального) введения. Перечисленные вспомогательные вещества смешивают с сухим концентратом или добавляют в раствор согласно общепринятым методам в соответствии с требованиями, предъявляемыми в технологии готовых лекарственных форм (см., например, “Технологию лекарств” И.С.Ажгихина или “Технологию лекарственных форм” под ред. Т.С.Кондратьевой).

Наполнителями являются, например, сахара (в частности, глюкоза, лактоза), белки, например альбумин, необязательно антиоксиданты, традиционные для инъекционных фармацевтических композиций. В случае необходимости продукт может содержать неорганические и/или органические соли и/или их сочетания для поддержания рН в диапазоне 7,2-7,4. Растворителями могут служить дистиллированная апирогенная стерильная вода, физиологический раствор, забуференный физиологический раствор, раствор 1,3-бутандиола, гликозаминогликанов, декстрозы, также раствор может содержать в случае необходимости белки сыворотки крови - альбумины и/или церуллоплазмин (последние также могут быть наполнителями в лиофилизированном готовом продукте).

Также можно лиофилизировать готовый раствор, содержащий концентрат Cl-эстеразного ингибитора, глицин и лизин, и любое из перечисленных вспомогательных веществ или их сочетания.

В случае необходимости концентрат, содержащий Сl-эстеразный ингибитор, лизин в конечной концентрации не менее 10 мМ и глицин в конечной концентрации не менее 100 мМ, можно растворять перед введением в плазме крови, в сыворотке крови больного, или смешивать с растворами и/или фракциями белка (белков).

Продукт также может быть выполнен в виде разовой лекарственной формы, например, в виде флаконов или ампул с раствором или с лиофилизированным концентратом, содержащим Сl-эстеразный ингибитор, лизин в конечной концентрации не менее 10 мМ, глицин в конечной концентрации не менее 100 мМ и, необязательно вспомогательные вещества или их сочетания, при этом активность Cl-эстеразного ингибитора в каждой разовой дозе составляет 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200 или 500 ед; продукт дополнительно может иметь соответствующую упаковку и необязательно инструкцию по применению.

Предложенный согласно изобретению продукт можно использовать в более широких областях по сравнению с известными ранее: лечение септического шока, в том числе в рефракторной фазе при неэффективности стандартной противошоковой терапии, лечение и профилактика синдрома полиорганной недостаточности, профилактика и лечение острого респираторного дистресс-синдрома, адъювантная терапия при атеросклеротическом поражении сосудов любой локализации, лечение и профилактика системных ревматологических заболеваний, протекающих с активацией комплемента (системная красная волчанка, системная склеродермия, дерматомиозит, ревматоидный артрит и т.д.).

1. Способ получения концентрата C1-эстеразного ингибитора человека, характеризующийся тем, что к криосупернатанту плазмы крови человека добавляют DEAE-сефадекс А-50 из расчета 1,5 г на литр, инкубируют, фильтруют, к фильтрату при рН 5,5 добавляют QAE-сефадекс из расчета 2,5 г на 1 литр плазмы, инкубируют в течение двух часов, фильтруют, отфильтрованный осадок QAE-сефадекса подвергают последовательной ступенчатой промывке буферным раствором при рН 5,5 и 7,5, элюции при рН 7,7, диализу при рН 7,4, к диализованному раствору добавляют ПЭГ-6000 до концентрации 12%, инкубируют при температуре 5-8°С, центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют глицин до конечной концентрации 100 мМ и лизин до конечной концентрации 10 мМ при рН 7,2, вносят твин 80 до конечной концентрации 1%, корректируют рН до 6,8-7,2, затем добавляют три-н-бутил-фосфат до конечной концентрации 0,3%, полученную суспензию перемешивают, подвергают хроматографии на DEAE-сефарозе FF при рН 7,0, хроматографии на Zn-хелатирующей сефарозе FF при рН 7,5 и получают целевой продукт, с удельной активностью в конечном препарате от 7,5±0,5 ед/мг белка и более, содержащий лизин в конечной концентрации не менее 10 мМ и глицин в конечной концентрации не менее 100 мМ.

2. Продукт, представляющий собой концентрат C1-эстеразного ингибитора, характеризующийся тем, что он получен из плазмы крови человека способом по п.1 с удельной активностью от 7,5±0,5 ед/мг белка и более и содержит лизин в конечной концентрации не менее 10 мМ и глицин в конечной концентрации не менее 100 мМ.

3. Продукт по п.2, который представляет собой раствор или лиофилизат.

4. Продукт по п.2, который дополнительно содержит фармацевтически приемлемые для парентерального введения наполнители, носители, растворители и/или эксципиенты.

5. Продукт по п.2, который предназначен для использования в медицине, ветеринарии и/или в научно-исследовательских целях.

6. Продукт по п.2, который предназначен для лечения или предупреждения состояний, протекающих с активацией системы комплемента.