Мутации enos, используемые для генной терапии и терапевтического скрининга

Мутации enos, используемые для генной терапии и терапевтического скрининга

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестные ссылки на родственные заявки

В настоящей заявке испрашивается приоритет Предварительной заявки США №60/129550, поданной 16 апреля 1999 г., которая во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки.

Подтверждение о государственной дотации

Исследования для разработки настоящего изобретения проводились частично на средства федерального правительства, выделенные в соответствии с грантом NL 57665 и HL 61371.

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым NOS-вариантам или мутантам, которые содержат структурные модификации в сайте Akt-зависимого фосфорилирования. Модифицированные NOS-белки или пептиды и кодирующие их молекулы нуклеиновых кислот могут быть использованы в генной терапии в качестве агентов для лечения заболеваний, включая рестеноз после ангиопластики, гипертензия, атеросклероз, сердечная недостаточность, диабет и заболевания с дефектным ангиогенезом.

Предпосылки создания изобретения

Атеросклероз и сосудистый тромбоз являются главной причиной патологий и смертности, являющихся следствием поражения коронарной артерии, инфаркта миокарда и инсульта. Атеросклероз начинается с изменения в эндотелии, выстилающем кровеносные сосуды. Изменение в эндотелии может, в конечном счете, приводить к развитию эндотелиального поражения, вызываемого отчасти поглощением окисленного холестерина липопротеина низкой плотности (ЛНП). Разрыв в участке этого поражения может приводить к тромбозу и окклюзии кровеносного сосуда. В случае поражения коронарной артерии разрыв в месте комбинированного поражения может приводить к инфаркту миокарда, а в случае поражения сонной артерии он может приводить к инсульту.

При ишемической болезни сердца, сопровождающейся атеросклерозом, эндотелиальная дисфункция может приводить к снижению продуцирования сосудорасширяющих веществ, таких как окись азота. Ишемия миокарда возникает при нарушении саморегулирующегося расширения сосудов независимо от того, является ли оно следствием кровотокограничивающего стеноза коронарной артерии или эндотелиальной дисфункции. В обоих случаях артериальный кровоток не может больше увеличиваться пропорционально возникающей потребности в кислороде. В других ситуациях ишемия миокарда может возникать в случае постоянной потребности в кислороде, но на фоне первичного снижения коронарного кровотока, опосредованного спазмом коронарной артерии, быстрым развитием атеросклеротических бляшек, образующихся на внутренней стенке сосуда и приводящих к сужению просвета коронарного артериального сосуда, и/или периодическим образованием пробок в капиллярах вследствие агрегации тромбоцитов.

Баллонная ангиопластика, в основном, используется для открытия кровеносного сосуда, суженного бляшкой. Хотя в большинстве случаев баллонная ангиопластика является достаточной для открытия сосуда, однако часто этот процесс приводит к удалению эндотелия и повреждению сосуда. Такое повреждение вызывает миграцию и пролиферацию клеток гладкой мускулатуры кровеносного сосуда в область повреждения с образованием патологии, известной как гиперплазия миоинтимы или рестеноз. Эта вновь образовавшаяся патология приводит к рецидиву симптомов через три-шесть месяцев после ангиопластики у значительного числа пациентов.

При атеросклерозе, тромбозе и рестенозе происходит также нарушение нормальной функции сосудов с тенденцией скорее к их сужению, чем расширению. Чрезмерное сужение сосуда, кроме того, приводит к уменьшению просвета сосуда, ограничивая, тем самым, кровоток. Это может приводить к возникновению симптомов, таких как стенокардия (при повреждении артерии сердца) или преходящая ишемия мозга (то есть "микроинсульт" при повреждении сосуда головного мозга). Такое нарушение функции сосудов.(чрезмерное сужение сосудов или неадекватное расширение сосудов) также возникает и при других патологических состояниях. Гипертензия (высокое кровяное давление) вызывается чрезмерным сужением сосудов, а также утолщением стенок сосудов, и в частности стенок мелких сосудов в системе кровообращения. Этот процесс может влиять на сосуды легких и может также вызывать пульмонарную (легочную) гипертензию. Другими нарушениями, которые, как известно, ассоциируются с чрезмерным сужением сосудов или с неадекватным расширением сосудов, являются атеросклероз сосуда-трансплантата, застойная сердечная недостаточность, токсикоз беременности, феномен Рейно, стенокардия Принцметала (коронарный вазоспазм), церебральный вазоспазм, гемолитическая уремия и импотенция.

Вещество, высвобождаемое эндотелием, первоначально названное "эндотелиальным фактором релаксации" (EDRF), играет важную роль в ингибировании указанных патологических процессов. В настоящее время известно, что EDRF представляет собой окись азота (NO). NO имеет много функций в физиологии человека, включая релаксацию гладкой мускулатуры сосудов, ингибирование агрегации тромбоцитов, ингибирование митогенеза, пролиферацию гладкой мускулатуры сосудов и адгезию лейкоцитов. Поскольку NO является самым сильным эндогенным вазодилататором и поскольку он является в высокой степени ответственным за индуцированное физической нагрузкой расширение артерий резервуров, усиление синтеза NO должно также способствовать улучшению способности к перенесению физической нагрузки у нормальных индивидуумов и у индивидуумов с сосудистым заболеванием.

Эндотелиальная синтаза оксида азота (eNOS) представляет собой изоформу синтазы оксида азота (NOS), ответственной за поддержание системного кровяного давления, ремоделирования сосудов и ангиогенеза (Shesely et al., 1996; Huang et al., 1995; Rudic et al., 1998; Murohara et al., 1998). Поскольку дефицит продуцирования NO в эндотелии является ранним устойчивым признаком атеросклероза и поражения сосудов, было подтверждено, что eNOS представляет собой привлекательный объект для сосудистой генной терапии. Хотя механизм регуляции активации eNOS, в основном, не определен, известно, что eNOS фосфорилируется в ответ на различные формы стимуляции клеток (Michel et al., 1993; Garcia-Cardena et al., 1996; Corson et al., 1996), однако, какую роль играет фосфорилирование в регуляции продуцирования окиси азота (NO) и какая киназа(ы) ответственна за это пока еще не выяснено.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение частично основано на обнаружении того факта, что сериновая/треонининовая протеинкиназа, Akt (протеинкиназа В), может непосредственно фосфорилировать eNOS по сериновому остатку, соответствующему остатку 1179 в бычьем eNOS или остатку 1177 в eNOS человека, и активировать данный фермент, что приводит к продуцированию NO. Мутантный eNOS (S1179A или S1177A) является резистентным к фосфорилированию и активации с помощью Akt, а мутантный eNOS (S1179D и S1177D) или (S1179E и S1177E) является конститутивно активным. Кроме того, Akt, активированная переносом гена, опосредованным аденовирусом, увеличивает базальное высвобождение NO из эндотелиальных клеток, а Akt с дефицитом активации ослабляет VEGF-стимулированное продуцирование NO. Таким образом, eNOS представляет собой только что описанный субстрат для Akt, опосредующий передачу сигнала посредством Akt с высвобождением газообразного вторичного передатчика NO. Настоящее изобретение также частично основано на обнаружении того факта, что мутантный eNOS (S1179D) характеризуется увеличенной скоростью продуцирования NO и повышенной редуктазной активности.

Настоящее изобретение относится к NOS, полипептидам или белкам и к кодирующим их изолированным молекулам нуклеиновой кислоты, где указанный полипептид или белок NOS содержит замененный аминокислотный остаток, соответствующий остатку 1179 бычьего eNOS, остатку 1177 человеческого eNOS, остатку 1412 крысиного nNOS или остатку 1415 человеческого nNOS. Предпочтительными заменами являются аминокислоты с отрицательно заряженными группами R, включая аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту.

Настоящее изобретение также относится к полипептидам или белкам NOS и к кодирующим их изолированным молекулам нуклеиновой кислоты, где указанный полипептид или белок NOS содержит замененный аминокислотный остаток, сооответствугощий остатку 1179 бычьего eNOS, остатку 1177 человеческого eNOS, остатку 1412 крысиного nNOS или остатку 1415 человеческого nNOS. Предпочтительными заменами являются аминокислоты с положительно заряженными группами R, такие как аланин.

Настоящее изобретение относится к способам стимуляции развития коллатеральных сосудов при ишемических заболеваниях с дефицитом эндогенного ангиогенеза, а в частности при заболеваниях периферических сосудов и/или ишемии миокарда у пациента, где указанный способ предусматривает доставку трансгена, кодирующего полипептид NOS настоящего изобретения или полипептид Akt.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к трансгенному животному, не являющееся человеком, которое экспрессирует полипептид NOS настоящего изобретения.

И, наконец, настоящее изобретение относится к способам идентификации агента, который модулирует Akt-регулируемую активность NOS, где указанные способы включают общие стадии: (а) обработки этим агентом очищенного NOS, предпочтительно eNOS или nNOS, или клетки, экспрессирующей NOS, а предпочтительно eNOS или nNOS, и Akt; и (b) измерение Akt-регулируемой активности NOS, а предпочтительно eNOS или nNOS.

Краткое описание графического материала

Фиг.1А-1В. Akt дикого типа, но не неактивная киназа Akt, способствует увеличению высвобождения NO из клеток, экспрессирующих мембрано-ассоциированный eNOS. На фиг.1А клетки COS трансфецировали плазмидами для eNOS в отсутствии или в присутствии Akt или неактивной киназы Akt (K179M), и продуцирование NO (анализируемого как NO₂ ^-) определяли с помощью хемилюминисценции. На фиг.1В клетки COS трансфецировали различными NOS-плазмидами, описанными выше. На фиг.1А и на фиг.1В величины для продуцирования NO₂ ^- вычитали из уровней, полученных от клеток, трансфецированных только кДНК β-галактозидазы. Вставка иллюстрирует экспрессию белков в полных лизатах клеток. Данные представляют собой среднее ± ср.кв.от., n=3-7 экспериментов; * означает р<0,05.

Фиг.2А-2D. Фосфорилирование eNOS активной киназой Akt in vitro и in vivo. На фиг.2А клетки COS трансфецировали HA-Akt или HA-Akt(K179M), лизаты подвергали иммунопреципитации и помещали в киназную реакцию in vitro с гистоном 2В (25 мг) или рекомбинантным eNOS (3 мг), используемыми в качестве субстратов. На верхней панели показано включение ³²P в субстраты, на нижней панели показано количество субстрата при окрашивании геля кумасси-синим. На фиг.2В ³²Р-меченый eNOS дикого типа или двойной сериновый мутант eNOS (eNOS S635/1179) подвергали аффинной очистке из трансфецированных клеток COS, а затем авторадиографии (верхняя панель) или Вестерн-блот-анализу (нижняя панель). Графические данные на фиг.2В показывают относительное количество меченого белка по отношению к количеству иммунореактивного eNOS в геле. На фиг.2С меченые eNOS гидролизовали трипсином и пептиды разделяли с помощью ОФ-ВЭЖХ. На верхней хроматограмме показан предварительно меченый триптический пептид, который мигрирует вместе с немеченным синтетическим фосфопептидным стандартом (нижняя хроматограмма). Вставки демонстрируют линейный характер МС меченого пептида (вверху) и фосфопептидные стандарнтые идентичные масс-ионы. На фиг.2D рекомбинантный eNOS дикого типа или eNOS S1179A очищали и равные количества (2,4 мг) добавляли в киназную реакцию in vitro с рекомбинантным Akt, как описано в "Методах". На верхней панели 2D показано включение ³²P в eNOS, на нижней панели показано количество субстрата при окрашивании геля кумасси-синим. Графические данные (n=3) показывают относительное количество меченого eNOS по отношению к массе eNOS (кумасси) в киназной реакции in vitro.

Фиг.3. Иллюстрируется, что серин 1179 играет функционально важную роль в Akt-стимулированном высвобождении NO. Клетки COS трансфецировали плазмидами для eNOS дикого типа или для eNOS-мутантов в отсутствии или в присутствии Akt и определяли экспрессию белков и уровень продуцирования NO (анализировали как NO₂ ^-). Интересно отметить, что конструкции с мутацией S1179 в А не активировались Akt, а мутация S1179 в D приводила к увеличению функции. Для А данные представляют собой среднее ± ср.кв.от., n=4-7 экспериментов; * означает значимые различия (р<0,05).

ФИГ.4А-4С. Akt регулирует базальное и стимулированное продуцирование NO в эндотелиальных клетках. На фиг.4А BLMVEC инфицировали аденовирусными конструкциями (β-gal в качестве контроля, mуr Akt и AA-Akt) и определяли количество NO₂ ^-, продуцированного за 24 часа (n=3). Вставки показывают экспрессию eNOS и Akt. На фиг.4В лизаты от инфицированных аденовирусом клеток BLMVEC оценивали на активность NOS. Равные количества белка (50 мг) инкубировали с различными концентрациями свободного кальция и определяли активность NOS (n=3 эксперимента). На фиг.4С BLMVEC инфицировали аденовирусами, как описано выше, с последующей стимуляцией VEGF (40 нг/мл) в течение 30 минут и высвобождение NO₂ ^- количественно оценивали с помощью хемилюминесценции. Данные представлены как VEGF-стимулированное высвобождение NO₂ ^- после вычитания базальных уровней. Данные представляют собой среднее ± ср.кв.от., n=4 экспериментов; * означает значимые различия (р<0,05).

Фиг.5А и 5В. Чистота и отношение димера/мономера eNOS дикого типа и eNOS S1179D. В А и В анализ с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН осуществляли на 7,5% полиакриламидных гелях, окрашенных кумасси синим. Слева показаны стандарты молекулярных масс (дорожка 1) и их размер в кДа. eNOS дикого типа (дорожка 2) и eNOS S1179D (дорожка 3)(1 мкг каждый) были разделены, как показано стрелками. На В белки (2 мкг каждого) разделяли с помощью электрофореза в ПААГ с ДСН при 4°С. Стандарты молекулярных масс показаны на дорожке 1. Некипяченые образцы дикого типа и eNOS S1179D были разделены на дорожках 2 и 3 соответственно. На дорожке 4 eNOS-дикого типа кипятили в буфере с ДСН для образца.

Фиг.6А и 6В. eNOS S1179D имеет более высокий уровень продуцирования NO (А) и редуктазной активности (В), чем eNOS дикого типа. На А скорость NO, продуцированного из eNOS дикого типа (•) и eNOS S1179D (O), определяли с помощью анализа на захват гемоглобина в зависимости от концентрации L-аргинина, и данные представлены двумя кривыми обратной зависимости. На В анализы на DCIP и цитохром с осуществляли в присутствии или в отсутствие СаМ. Величины представлены как среднее ± ср.кв.от., n=4-6 определений. Аналогичные результаты были получены с использованием, по крайней мере, трех ферментных препаратов. Значимые различия (р<0,05) между eNOS дикого типа и eNOS S1179D показаны звездочками.

Фиг.7А и 7В. NOS-активности (А) и активность NADPH-зависимой редуктазы (В) увеличивается при использовании eNOS S1179D по сравнению с ферментом дикого типа. Анализы на захват гемоглобина (А) и на NADPH-зависимое восстановление цитохрома с (В) осуществляли с использованием как eNOS дикого типа, так и eNOS S1179D. На А скорость продуцирования NO определяли в присутствии всех кофакторов NOS (eNOS дикого типа (заштрихованные символы) и eNOS S1179D (незаштрихованные символы). Уровень восстановления цитохрома с определяли в отсутствие аргинина и ВН4 (А) для фермента дикого типа (кружки) и для S1179D (треугольники) в отсутствие (незаштрихованные символы) или в присутствии 120 нМ кальмодулина (заштрихованные символы). Величины представлены как среднее ± ср.кв.от., n=3-6 определений, по крайней мере, для трех ферментных препаратов.

Фиг.8А-8D. Кальмодулин- и кальцийзависимая активация NOS и редуктазных активностей несколько увеличивается для eNOS S1179D. Анализы на кальмодулинзависимый захват гемоглобина (А) и восстановление цитохрома с (В) проводили с использованием как eNOS дикого типа (заштрихованные символы), так и eNOS S1179D (незаштрихованные символы). Уровень продуцирования NO, детектированного методом захвата гемоглобина, определяли в присутствии всех кофакторов NOS, тогда как восстановление цитохрома с определяли в отсутствие аргинина и ВН4. На С и D идентичные эксперименты осуществляли в присутствии возрастающих концентраций свободного кальция. На вставках С и D показан кальцийзависимый цикл превращения eNOS дикого типа и eNOS S1179D как в анализе на продуцирование NO, так и в анализе на цитохром с. Максимальные скорости превращений для eNOS дикого типа и S1179D составляли соответственно А 22 и 43 мин^-1; В 620 и 1400 мин¹; С 58 и 100 мин¹; D 1930 и 3810 мин^-1. Величины представлены как среднее ± ср.кв.от., n=3-6 определений, по крайней мере, для трех ферментных препаратов.

Фиг.9А и 9В. EGTA-инициированная инактивация NOS снижается для eNOS S1179D. Анализы на захват гемоглобина (А) и на редуктазу (В) осуществляли, как описано ранее со следующими модификациями. Для определения скорости инициации проводили мониторинг реакции в течение 1 минуты; а затем к реакционной смеси добавляли EGTA и скорость реакции прослеживали в течение еще 1 минуты. Концентрация свободного кальция в реакции составляла 200 мкМ, а количество добавленного EGTA давало конечные концентрации 0, 200, 400 и 600 мкМ хелатообразующего агента. Удельные активности нормализовали к 100% для eNOS дикого типа и S1179D. Величины представлены как среднее ± ср.кв.от., n=3-6 определений, по крайней мере, для трех ферментных препаратов; nd означает, что активность для eNOS дикого типа не детектировали.

Подробное описание изобретения А

А. Общее описание

Настоящее изобретение частично основано на обнаружении того факта, что сериновая/треонининовая протеинкиназа, Akt (протеинкиназа В), может непосредственно фосфорилировать eNOS по сериновому остатку (серии 1177 в человеческом eNOS) и активировать данный фермент, что приводит к продуцированию NO, тогда как мутантный eNOS (S1179A) является резистентым к Akt-фосфорилированию и -активации. Кроме того, Akt, активированная переносом гена, опосредованным аденовирусом, увеличивает базальное высвобождение NO из эндотелиальных клеток, а дефицитная по активации Akt снижает VEGF-стимулированное продуцирование NO. Таким образом, eNOS представляет собой недавно описанный субстрат Akt, опосредующий передачу сигнала посредством Akt с высвобождением газообразного вторичного переносчика NO. Настоящие изобретения также основаны частично на обнаружении того факта, что мутантный eNOS, например S1179D, способствует увеличению скорости продуцирования NO и повышению редуктазной активности.

Обнаружение того факта, что продуцирование NO регулируется Akt-зависимым фосфорилированием eNOS, дает возможность использовать новые конститутивно активные eNOS-мутанты в генной терапии для улучшения эндотелиальной функции при сердечно-сосудистых заболеваниях, ассоциированных с нарушением синтеза или биологической активности NO. Такими заболеваниями являются рестеноз после ангиопластики, гипертензия, атеросклероз, сердечная недостаточность, включая инфаркт миокарда, диабет и заболевания с недостаточным ангиогенезом. Обнаружение этого факта также позволяет получить новую терапевтическую мишень для разработки нужных лекарственных средств, которые могут быть использованы для лечения заболеваний, ассоциированных с нарушением синтеза или биологической активности NO.

Настоящее изобретение также относится к новым конститутивно активным nNOS-мутантам, в которых аминокислота, соответствующая остатку 1412 крысиного nNOS или 1415 человеческого nNOS, была заменена в целях осуществления генной терапии для лечения заболеваний.

В. Конкретные варианты осуществления изобретения

Продуцирование мутантных белков NOS или полипептидов

Настоящее изобретение относится к белкам или полипептидам NOS, аллельным вариантам белков NOS и к заменам консервативных аминокислот белков NOS, все из которых содержат мутацию серинового остатка, присутствующего в сайте Akt-опосредованного фосфорилирования. Так, например, белками или полипептидами настоящего изобретения являются, но не ограничиваются ими (1) человеческие белки eNOS, которые содержат мутацию по остатку 1177 (Janssens et al. (1992) J.Biol.Chem. 267:14519-14522, эта работа во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки), как представлено в SEQ ID NO: 3 и соответствующей нуклеотидной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8 (GenBank-номер доступа М93718), с заменой серина на другую аминокислоту, такую как аланин, и которые являются резистентными к Akt-опосредованному фосфорилированию; (2) бычьи белки eNOS, которые содержат мутацию по остатку 1179 (SEQ ID NO:2 патент США 5498539, который во всей своей полноте вводится в настоящее описание посредством ссылки), как представлено в SEQ ID NO:4, с заменой серина на другую аминокислоту, такую как аланин, и которые являются резистентными к Akt-опосредованному фосфорилированию; (3) человеческие белки nNOS, которые содержат мутацию по остатку 1415 с заменой серина на другую аминокислоту, такую как аланин, и которые являются резистентными к Akt-опосредованному фосфорилированию; (4) крысиные белки nNOS, которые содержат мутацию по остатку 1412 с заменой серина на другую аминокислоту, такую как аланин, и которые являются резистентными к Akt-опосредованному фосфорилированию; (5) человеческие белки eNOS, которые содержат мутацию по остатку 1177, как представлено в SEQ ID NO:5, с заменой серина на аминокислоту, содержащую отрицательно заряженную группу R, такую как аспарагиновая (как представлено в SEQ ID NO:6) или глутаминовая кислота (как представлено в SEQ ID NO:7), и которые являются конститутивно активными и способствуют увеличению продуцирования NO и повышению редуктазной активности; (6) бычьи белки eNOS, которые содержат мутацию по остатку 1179 с заменой серина на аминокислоту, содержащую отрицательно заряженную группу R, такую как аспарагиновая или глутаминовая кислота, и которые являются конститутивно активными и способствуют увеличению продуцирования NO и повышению редуктазной активности; (7) человеческие белки nNOS, которые содержат мутацию по остатку 1415 с заменой серина на аминокислоту, содержащую отрицательно заряженную группу R, такую как аспарагиновая или глутаминовая кислота, и которые являются конститутивно активными и способствуют увеличению продуцирования NO и повышению редуктазной активности; (8) крысиные белки nNOS, которые содержат мутацию по остатку 1412 с заменой серина на аминокислоту, содержащую отрицательно заряженную группу R, такую как аспарагиновая или глутаминовая кислота, и которые являются конститутивно активными и способствуют увеличению продуцирования NO и повышению редуктазной активности и (9) белки NOS, которые не являются человеческими, бычьими или крысиными белками, и модифицированы так, что в положении, соответствующем серину 1177 человеческого eNOS, или серину в положении 1179 бычьего eNOS, серину в положении 1412 крысиного nNOS и серину в положении 1415 человеческого nNOS, они содержат аминокислоту, не являющуюся серином, и которые являются или резистентными к Akt-фосфорилированию, или являются конститутивно активными, способствуют увеличению продуцирования NO и увеличению редуктазной активности. Мутанты NOS могут быть также продуцированы путем введения мутаций других аминокислот в мотиве фосфорилирования RXRXXS/T.

Настоящее изобретение относится к конститутивно активным полипептидам NOS, предпочтительно eNOS или nNOS, характеризующимся повышенным продуцированием NO и увеличенной редуктазной активностью, и содержащим мутацию по сериновому остатку в сайте Akt-опосредованного фосфорилирования. Следует также отметить, что каждый специалист может получить консервативные варианты, такие как мутанты с заменами, делеционные мутанты и инсерционные мутанты указанных полипетидов NOS, обладающие способностью к повышенному продуцированию NO и к увеличению редуктазной активности. Используемый здесь термин "консервативный вариант" означает такие модификации аминокислотной последовательности, которые не оказывают негативного воздействия на способность контитутивно активной NOS, предпочтительно eNOS или nNOS, продуцировать NO или на редуктазную активность контитутивно активного NOS, предпочтительно eNOS или nNOS. Считается, что замена, вставка или делеция оказывает негативное воздействие на конститутивно активный полипептид NOS, если данная модифицированная последовательность влияет на функцию конститутивной NOS, в результате чего он не может продуцировать повышенные уровни NO и не способен к увеличению редуктазной активности по сравнению с NOS дикого типа. Так, например, суммарный заряд, структура или гидрофобные/гидрофильные свойства конститутивного NOS могут быть модифицированы без негативного воздействия на активность конститутивного NOS. В соответствии с этим аминокислотная последовательность полипептида NOS может быть модифицирована, например, так, чтобы данный полипептид был более гидрофобным или гидрофильным, но чтобы это не оказывало негативного воздействия на активность NOS.

Используемый здесь термин "конститутивно активный" мутант или вариант NOS независимо от того, является ли он модифицированным или выделенным из природного источника, означает белок NOS, предпочтительно, eNOS или nNOS, который продуцирует NO на более высоком уровне, чем нативный NOS, содержащий серин в его нефосфорилированной форме в положении аминокислотного остатка, соответствующего остатку 1177 в человеческом NOS или остатку 1179 в бычьем NOS. Предпочтительные конститутивно активные варианты содержат аминокислоту с отрицательно заряженной группой R, такую как аспрагиновая или глутаминовая кислота, в аминокислотном остатке, соответствующем серину в положении 1177 человеческого cNOS или серину в положении 1179 бычьего NOS.

Настоящее изобретение относится к белкам или полипептидам NOS, аллельным вариантам белков NOS и к белкам NOS с консервативными аминокислотными заменами, которые содержат замененный аминокислотный остаток вместо соответствующего остатка 1179 в бычьем eNOS, остатка 1177 в человеческом eNOS, остатка 1412 в крысином nNOS, и остатка 1415 в человеческом nNOS, где указанный замененный аминокислотный остаток содержит неотрицательно заряженную группу R, такую как аланин.

Белки NOS, предпочтительно белки eNOS или nNOS, настоящего изобретения могут быть использованы в изолированной форме. Говорят, что используемый здесь белок является изолированным, если для отделения этого белка от клеточных компонентов, обычно ассоциированных с этим белком, используются физические, механические или химические методы. Каждый специалист может легко использовать стандартные методы очистки для получения изолированного белка.

Настоящее изобретение также относится к пептидами NOS, включающие сайт фосфорилирования, соответствующий остатку 1179 в бычьем eNOS, остатку 1177 в человеческом eNOS, остатку 1412 в крысином nNOS, или остатку в 1415 человеческом nNOS. Пептиды могут содержать серин в сайте фосфорилирования или предпочтительно они могут содержать замену серина в положении, соответствующем остатку 1179 в бычьем eNOS, остатку 1177 в человеческом eNOS, остатку 1412 в крысином nNOS или остатку в 1415 человеческом nNOS. Такими заменами являются, но не ограничиваются ими аминокислоты с группой R, которые имитируют серин в его фосфорилированном состоянии, таким как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота. Такими заменами также являются аминокислоты с неотрицательно заряженной группой R, такой как аланин. Пептиды, включающие данный сайт, могут иметь длину примерно в 3, 5, 7, 10, 12, 15, 17, 20, 25, 30, 40, 50 или более аминокислот.

Белки, полипептиды или пептиды NOS настоящего изобретения могут быть получены любыми доступными способами, включая рекомбинантную экспрессию из кДНК NOS, которая была модифицирована с заменой или изменением нуклеотидного триплета, кодирующего серин, соответствующий серину в положении 1177 человеческого eNOS, в положении 1179 бычьего eNOS, остатку 1412 в крысином nNOS или остатку 1415 в человеческом nNOS. Для введения мутации в нуклеотидный триплет, кодирующий сериновый остаток, могут быть использованы любые подходящие методы, такие как го-мологичная рекомбинация, сайт-направленный мутагенез или ПЦР-мутагенез (см., Sambrook et al.. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). В случае кДНК могут быть использованы человеческая или бычья кДНК NOS, а также кДНК, кодирующая белки NOS животных других видов, включая, но не ограничиваясь ими, кролика, крысу, мышь, свинью, овцу, лошадь и приматов, не относящиеся к человеку.

Используемую здесь молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок или полипептид NOS, а предпочтительно белок или полипетид eNOS или nNOS, настоящего изобретения называют "изолированной", если указанная молекула нуклеиновой кислоты, в основном, отделена от примесной нуклеиновой кислоты, кодирующей другие полипептиды, и выделена из данного источника нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к фрагментам кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты. Используемый здесь термин "фрагмент кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты" означает небольшую часть полной кодирующей белок последовательности. Размер данного фрагмента определяется в соответствии с целями его использования. Так, например, если данный фрагмент выбран так, чтобы он кодировал активную часть белка, то этот фрагмент должен быть достаточно крупным, чтобы он кодировал функциональную часть (части) данного белка, включая сайт Akt-фосфорилирования. Если данный фрагмент используется в качестве нуклеотидного зонда или ПЦР-праймера, то длина фрагмента должна быть выбрана так, чтобы имело место относительно небольшое число ложноположительных событий во время зондирования/праймирования по отношению к области, которая включает или фланкирует сайт Akt-фосфорилирования NOS.

Фрагменты кодирующих молекул нуклеиновых кислот настоящего изобретения (то есть синтетические олигонуклеотиды), которые используются в качестве зондов или специфических праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР), или для синтеза генных последовательностей, кодирующих белки настоящего изобретения, могут быть легко синтезированы химическими методами, например фосфотриэфирным методом, описанным Matteucci и др. 1981, J.Am.Chem.Soc. 103:3185-3191), или методами автоматического синтеза. Кроме того, более крупные ДНК-сегменты могут быть легко получены хорошо известными методами, такими как синтез группы олигонуклеотидов, которые определяют различные модульные сегменты гена, с последующим лигированием олигонуклеотидов для конструирования полного модифицированного гена.

Кодирующие молекулы нуклеиновой кислоты настоящего изобретения могут быть, кроме того, модифицированы так, чтобы они содержали детектируемую метку для диагностических целей и для зондирования. Ряд таких меток известен специалистам и эти метки могут быть легко использованы с описанными здесь кодирующими молекулами. Подходящими метками являются, но не ограничиваются ими, биотин, радиоактивно меченные нуклеотиды и т.п. Каждый специалист может использовать любую из этих известных меток для получения меченой кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к рекомбинантным ДНК-молекулам (рДНК), которые содержат NOS-кодирующую последовательность, описанную выше. Используемая здесь молекула рДНК представляет собой ДНК-молекулу, которая была подвергнута молекулярным манипуляциям. Методы генерирования молекул рДНК хорошо известны специалистам и описаны, например, у Sambrook et al., Molecular Cloning (1989). В предпочтительных молекулах рДНК кодирующая последовательность ДНК функционально присоединена к регулирующим экспрессию последовательностям и/или векторным последовательностям.

Выбор векторных и/или регулирующих экспрессию последовательностей, к которым функционально присоединена одна из последовательностей, кодирующих семейство белков настоящего изобретения, непосредственно зависит, как хорошо известно специалистам, от желательных функциональных свойств, например от экспрессии белка и от трансформируемой клетки-хозяина. Вектор, рассматриваемый в настоящем изобретении, по крайней мере, способен направлять репликацию или встраивание в хромосому хозяина, а предпочтительно также регулировать экспрессию структурного гена, включенного в рДНК-молекулу.

Регулирующие экспрессию элементы, используемые для регуляции экспрессии функционально присоединенной кодирующей белок последовательности, известны специалистам, и такими элементами являются, но не ограничиваются ими, индуцибельные промоторы, конститутивные промоторы, сигналы секреции и другие регуляторные элементы. Предпочтительно, чтобы индуцибельный промотор был легко регулируемым, т.е. чтобы он был восприимчивым к питательному веществу, присутствующему в среде клетки-хозяина.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор, содержащий кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, включает прокориотический репликон, то есть последовательность ДНК, обладающую способностью направлять автономную репликацию и поддерживать внехромосомно рекомбинантную молекулу ДНК в прокариотической клетке-хозяине, такой как бактериальная клетка-хозяин, трансформированная этой молекулой. Такие репликоны известны специалистам. Кроме того, векторы, содержащие прокариотический репликон, могут также включать ген, экспрессия которого сообщает ему детектируемый маркер, такой как резистентность к лекарственному средству. Типичными бактериальными генами резистентности к лекарственному средству являются гены, которые сообщают резистентность к ампициллину или тетрациклину.

Векторы, содержащие прокариотический репликон, могут, кроме того, включать прокариотический или бактериофаговый промотор, способный направлять экспрессию (транскрипцию или трансляцию) последовательностей кодирующего гена в бактериальной клетке-хозяине, такой как E.coli. Промотор представляет собой элемент, регулирующий экспрессию и образованный последовательностью ДНК, которая делает возможным связывание РНК-полимеразы, в результате чего происходит транскрипция. Промоторные последовательности, совместимые с бактериальными хозяевами, обычно исходятся в плазмидных векторах, содержащих подходящие рестрикционные сайты для встраивания сегмента ДНК настоящего изобретения. Обычно, такими векторными плазмидами являются pUC8, pUC9, pBR322 и pBR329, поставляемые Biorad Laboratories (Richmond, CA), pPL и рКК223, поставляемые Pharmacia Piscataway, NJ.

Экспрессирующие векторы, совместимые с эукариотическими клетками, а предпочтительно совместимые с клетками позвоночных могут быть также использованы для получения рДНК-молекул, содержащих кодирующую последовательность. Экспрессирующие векторы эукариотических клеток хорошо известны специалистам и поставляются несколькими коммерческими фирмами. Обычно такие векторы содержат подходящие рестрикционные сайты для встраивания желательного сегмента ДНК. Типичными векторами являются pSVL и pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-l/pML2d (International Biotechnologies, Inc.), pTDT1 (ATCC #31225) и подобные эукариотические экспрессирующие векторы.

Экспрессирующие векторы эукариотических клеток, используемые для конструирования рДНК-молекул настоящего изобретения, могут, кроме того, включать селектируемый маркер, который является эффективным в эукариотической клетке, а предпочтительно маркер для отбора на резистентность к лекарственному средству. Предпочтительным маркером резистентности к лекарственному средству является ген, экспрессия которого приводит к резистентности к неомицину, то есть ген неомицин-фосфотрансферазы (neo) (Southern et al. (1982), J.Mol.Anal.Genet.1:327-341). Альтернативно, данный селектируемый маркер может присутствовать на отдельной плазмиде, и эти два вектора могут быть введены путем котрансфекции вклетки-хозяина с последующим отбором на данный селективный маркер путем культивирования в среде с соответствующим лекарственным средством.

Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам, трансформированным или трансфецированным молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок NOS, а предпочтительно белок eNOS или nNOS настоящего изобретения. Клетка-хозяин может быть либо прокариотической, либо эукариотической. Эукариотические клетки, используемые для экспрессии белка настоящего изобретения, не имеют конкретных ограничений при условии, что данная клеточная линия совместима с методами культивирования и размножения экспрессирующего вектора и с экспрессией генного продукта. Предпочтительными эукариотическими клетками-хозяевами являются, но не ограничиваются ими, дрожжевые клетки, клетки насекомых и клетки млекопитающих, предпочтительно позвоночных, такие как мышиные, крысиные,