Многоцелевая многофункциональная высокоэффективная композиция щелочного раствора, ее получение и применение в качестве неспецифического иммуностимулятора

Многоцелевая многофункциональная высокоэффективная композиция щелочного раствора, ее получение и применение в качестве неспецифического иммуностимулятора

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к многоцелевой высокоэффективной композиции щелочного раствора, ее получению и применению в качестве неспецифического иммуностимулятора. Более конкретно настоящее изобретение относится к композиции щелочного раствора, которая содержит, прежде всего, метасиликат натрия (пентагидрат) и обладает неспецифическими иммуностимулирующими активностями, такими как производство антител и усиление иммунитета, которые обусловлены активацией иммуноцитов, тем самым усиливая до максимума действия вакцинации в отношении вызываемых вирусами злокачественных заболеваний, к ее получению и применению в качестве иммуностимулятора.

Описание известного уровня техники

Функциональная активность щелочных компонентов в организме привлекала большой интерес исследователей с начала 20-го века. В настоящее время благодаря обширным исследованиям установлено, что щелочные компоненты в организме увеличивают скорость ионизации калия и натрия, повышая тем самым способность крови к очищению, что приводит к клиренсу крови, снижает усталость и замедляет процесс старения. Один из составов щелочных растворов описан в корейском патенте № 128110, выданном на имя авторов настоящего изобретения. Этот раствор содержит 10-18 мас.част. силиката натрия, 0,1-0,5 мас.част. гипероксида натрия, 5-10 мас.част. карбоната калия, 1 мас.част. карбоната натрия, 10-18 мас.част. сахара-рафинада и 0,1-3,0 мас.част. тиосульфата серебра в воде. В настоящее время указанную композицию применяют для завершающей обработки волокнистых материалов и ферментации кормов в сельском хозяйстве благодаря ее эффективности в отношении длинноволнового инфракрасного излучения, антибактериальной активности и дезодорирующих свойств. Однако недостатком композиции является сложность ее получения и хранения в течение длительного времени.

Между тем, количество применяемых антибиотиков во всем мире возрастает с каждым годом. Однако при увеличении количества вводимых антибиотиков возрастает количество вызываемых ими побочных воздействий. Например, для лечения пациентов, которые злоупотребляли применением антибиотиков, необходимы более высокие дозы антибиотиков, поскольку они приобрели к ним устойчивость. Кроме того, неправильное применение и злоупотребление антибиотиками привели к появлению супербактерий, которые обладают высоким уровнем устойчивости (полностью невосприимчивы) к существующим антибиотикам. Одним из путей снижения применения антибиотиков является общее усиление иммунной системы организма, что приводит к повышению эффективности вакцинации. Например, для специалистов-медиков большой интерес представляют неспецифические иммуностимуляторы (далее обозначены как «НИС»), которые индуцируют повышение иммунного ответа организма на внешние патогены, и в настоящее время во всем мире проводятся широкомасштабные исследования по разработке НИС.

Японские исследователи обнаружили, что субстанция, экстрагированная из съедобного гриба (Lentinus edoddes), обладает противораковым действием. Кроме того, уже сто лет назад НИС были обнаружены в бактериях. В настоящее время активно изучаются как роль НИС в отношении образования антител и индукции цитокинов, так и усиление иммунной активности при их использовании. Например, установлено, что экстракт клеточной мембраны Norcardia opaca индуцирует активацию макрофагов, полученных из брюшной полости мышей (Barot-Ciobaru и др., 1987). Обнаружено, что субстанции RU41740, полученная из Klebsiella pneumoniae, KP-40, полученная из Propionibacterium avidum, и QH-В, полученная из Quillaja saponaria, обладают ценными свойствами, связанными с индукцией цитокинов и стимуляцией иммуноцитов (Bessler и др., 1997; Nimier и др., 1999; Ronnberg и др., 1997; Siwiki и др., 1998; Tewari и др., 1996). В настоящее время установлено, что полученные из бактериальной ДНК мотивы CPG, названные мотивы-иммуностимуляторы, обладают способностью индуцировать экспрессию в иммуноцитах IL-6, IL-12, IL-18 и IFN-γ (Bohle и др., 1999; Klinman и др., 1999; Krieg, 1999).

Проблемами, связанными с применением этих и других разработанных таким образом НИС, являются сложность их получения, невозможность длительного хранения и высокая стоимость.

Краткое изложение сущности изобретения

В связи с известными из существующего уровня техники проблемами в основу настоящего изобретения была положена задача разработать композицию, обладающую ингибирующим действием в отношении пролиферации бактерий и вирусов щелочного раствора, который можно легко приготавливать и хранить в течение длительного периода времени и который можно применять в качестве неспецифического иммуностимулятора.

Другим объектом настоящего изобретения является способ приготовления такой композиции щелочного раствора.

Следующим объектом настоящего изобретения является применение такой композиции щелочного раствора.

И еще одним объектом настоящего изобретения являются способы повышения скорости прироста массы скота и урожая культурных растений.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ хранения сельскохозяйственных, рыбных или мясных продуктов в течение длительного периода времени.

И еще одним объектом настоящего изобретения является нетоксичный неспецифический иммуностимулятор, обладающий противораковым действием.

Краткое описание чертежей

Указанные выше, а также другие объекты, особенности и другие преимущества настоящего изобретения более подробно пояснены ниже со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых показано:

на фиг.1 - график зависимости от времени изменений уровня CD4⁺-Т-лимфоцитов у свиней из группы, в корм которой добавляли BARODON^®, и контрольной группы;

на фиг.2 - график зависимости от времени изменений количества клеток, презентирующих МНС класса II у свиней из группы, в корм которой добавляли BARODON^®, и контрольной группы;

на фиг.3 - график зависимости от времени изменений в содержании «ни Т»/«ни В-лимфоцитов» (N-лимфоцитов) у свиней;

на фиг.4 - график зависимости от времени изменений уровня CD8⁺-Т-лимфоцитов у свиней из группы, корм которой добавляли BARODON^®, и контрольной группы;

на фиг.5 - гистограмма лимфопролиферативной активности лимфоцитов, выделенных из периферической крови свиней из группы, в корм которой добавляли BARODON^®, и контрольной группы в ответ на стимуляцию Con A (конканавалин А), ФГА (фитогемаглютинин), PWM (экстракт корня лаконоса) и LPS (липополисахарид);

на фиг.6 - гистограмма лимфопролиферативной активности лимфоцитов свиней, выделенных из мезентериальных лимфатических узлов свиней из группы, в корм которой добавляли BARODON^®, и контрольной группы в ответ на стимуляцию Con А, ФГА, PWM и LPS;

на фиг.7 - график зависимости производства противохолерного антитела у животных из группы, в корм которой добавляли BARODON^®, и контрольной группы от времени;

на фиг.8 - график зависимости изменений активности мышечной Са-АТФ-азы в треске, которую обрабатывали BARODON^®, и в контроле от продолжительности хранения;

на фиг.9 - ЯМР-спектр, на котором представлена полоса длин волн, соответствующая пику абсорбции для меченной с помощью ¹⁷О водопроводной воды; и

на фиг.10 и 11 - ЯМР-спектры, на которых представлены полосы длин волн, соответствующие пикам абсорбции для меченных с помощью ¹⁷О молекул водопроводной воды в водном растворе, содержащем композицию по настоящему изобретению.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к НИС, основой которого является композиция щелочного раствора определенного состава. Композиция содержит метасиликат натрия, буру, тиосульфат натрия, карбонат калия, сахар-рафинад и воду, необязательно хлорид натрия, тиосульфат серебра и/или молибдат натрия.

Применяемый согласно настоящему изобретению метасиликат натрия несет пять молекул кристаллической воды и содержит диоксид кремния (SiO₂) в количестве 27,5-29,0% и оксид натрия (Na₂O) в количестве 28,5-30,0%, причем пределы ошибки содержания указанных веществ составляют менее 2%. Это соединение весьма стабильно по сравнению с поступающим в продажу жидким силикатом натрия. Метасиликат натрия, представляющий собой порошок или гранулы белого цвета, легко взвешивать с большой точностью, удобно хранить в течение длительного периода времени и транспортировать. При растворении в воде метасиликат натрия приобретает сильную щелочность. Кремний, аналогично другим компонентам метасиликата натрия, представляет собой важный элемент для роста животных и растений.

Бура, содержащая десять молекул кристаллической воды, имеет удельную плотность 1,715. Компонент буры бор (В) представляет собой микроэлемент, дефицит которого испытывают животные и растения. При недостатке в почве бора плодовые деревья не дают урожая, а если плоды образуются, то многие из них являются дефектными. Как правило, буру применяют в качестве репеллента для бактерий, репеллента для насекомых, кровоостанавливающего средства и аппретирующего материала. При сплавлении с металлами бура обладает способностью растворять металлы. Раствор буры в воде обладает щелочными свойствами, значение рН составляет примерно 9,5. В композиции по настоящему изобретению количество буры предпочтительно доводят до 1-15 мас.част. в пересчете на 100 мас.част. метасиликата натрия. Например, если буру применяют в количестве менее 1 мас.част., то ее действия не проявляются. С другой стороны, если содержание буры превышает 15 мас.част., то она может оказывать токсическое действие.

Содержащий пять молекул кристаллической воды тиосульфат натрия не растворяется в спирте, но растворяется в воде, придавая ей характерный соленый вкус. Водный раствор является нейтральным (значение рН составляет 6,5-8,0). Поскольку тиосульфат натрия обладает химической способностью растворять галогениды серебра или другие соли серебра, его обычно используют для экстракции серебра из руд. Кроме того, тиосульфат натрия можно применять для удаления хлора и тяжелых металлов. Согласно настоящему изобретению тиосульфат натрия применяют в количестве примерно 10^-5-10^-4 мас.част. в пересчете на 100 мас.част. метасиликата натрия. Например, при применении тиосульфата натрия в количестве, ниже нижнего предела, можно не получить никаких дополнительных его действий. С другой стороны, применение тиосульфата натрия в количестве, превышающем верхний предел, вызывает седиментацию тканевого Са в организме животных, что приводит к их возбуждению и к опорожнению кишечника.

Карбонат калия хорошо растворяется в воде и его раствор имеет сильную щелочность (рН 11,6). Подобно натрию калий является необходимым элементом для организма, играя важную роль в метаболизме и кровообращении. Например, для предупреждения гипертензии и сахарного диабета необходим соответствующий баланс между калием и натрием in vivo. Согласно настоящему изобретению предпочтительное количество карбоната калия составляет 30-150 мас.част. в пересчете на 100 мас.част. метасиликата натрия. При обработке животных или растений, например, количеством карбоната калия, находящемся вне указанного диапазона, можно нарушить баланс натрия/калия in vivo.

В композиции по настоящему изобретению сахар-рафинад предупреждает рекомбинацию ионизированных неорганических субстанций, стабилизируя тем самым композицию. Кроме того, сахар-рафинад превращает неорганические субстанции в вещества органического типа в виде связанных с сахаром форм, а также повышает адгезивную или адсорбционную способность композиции. Эти функции сахар-рафинад может осуществлять при его применении в количестве 30-200 мас.част. в пересчете на 100 мас.част. метасиликата натрия. Содержание воды в композиции составляет 100-200 мас. част. Хлорид натрия, который не является обязательным компонентом композиции по настоящему изобретению, используют в качестве источника натрия для регулирования баланса натрий/калий. Что касается тиосульфата серебра, то его часто применяют для подавления синтеза этилена у растений или для облегчения дифференциации растений. В водном растворе тиосульфат серебра при низкой концентрации S₂О₃ ^2- образует [Ag(S₂О₃ ^2-)₂]^3-, а при высокой концентрации S₂О₃ ^2- образует [Ag₂(S₂О₃ ^2-)₆]^10-. Согласно настоящему изобретению тиосульфат серебра подобно тиосульфату натрия существует в поливалентной анионной форме, и его действие связано с клеточной дифференцировкой. Согласно настоящему изобретению молибдат натрия служит в качестве источника молибдена, представляющего собой элемент, который практически отсутствует в организме животных и растений. Все необязательные соединения используют в количестве 10^-1 мас.част. или менее в пересчете на 100 мас.част. метасиликата натрия.

После полного растворения компонентов композицию по настоящему изобретению окрашивают в цвет слоновой кости. Композиция не имеет запаха и является нетоксичной, а кроме того, она является стабильной и имеет удельную вязкость 1,43-1,50, постоянное значение рН 13 и вязкость от 61,0 до 239,0. В частности, даже после обработки НСl, композиция по настоящему изобретению плохо поддается отвердеванию или изменениям значения рН. С помощью различных экспериментов, проведенных в течение длительного периода времени, продемонстрировано, что композиция по настоящему изобретение способствует повышению скорости прироста массы скота и урожая культурных растений, а также является очень хорошим НИС как для растений, так и для животных.

Композицию по настоящему изобретению можно скармливать животным, например, параллельно с кормом, в смеси с кормом, или после ферментации в корме, или после разбавления водой. После поглощения композиция обусловливает очень высокой уровень повышения иммунитета у скота. Например, композиция по настоящему изобретению эффективно предупреждает эпидемическую диарею свиней (ЭДС) и холеру свиней - болезни, представляющие собой серьезные проблемы для свиноводства на промышленной основе. Кроме того, обнаружено, что композиция является эффективной для профилактики и лечения дающего высокий уровень смертности тифа птиц - болезни, которая наносит серьезный урон птицеводству, осуществляемому на промышленной основе. В случае дойных коров при включении в корм композиции снижалось количество соматических клеток в единице объема молока, что является критерием качества молока. Другие воздействия композиции по настоящему изобретению на скот включают усиление роста и улучшение качества мяса. Обнаружено, что коровники, в которых содержатся животные, в корм которых добавляют композицию по настоящему изобретению, имеют менее неприятный запах, чем коровники, в которых содержатся животные на обычном корме.

Композиция по настоящему изобретению оказывает благоприятные воздействия на растения при ее внесении в смесях с удобрениями или после разбавления водой, включая облегчение прорастания и роста, повышение устойчивости к болезням, повышение урожайности культурных растений, повышение качества урожая и т.д.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах, не ограничивающих его объем.

Пример получения 1

В очищенную воду (500 кг) последовательно добавляли, поддерживая температуру на уровне 60-80°С, метасиликат натрия (пентагидрат, 300 кг), буру (декарбогидрат, 35 кг), тиосульфат натрия (0,01 кг), хлорид натрия (1 кг) и карбонат калия (150 кг) и перемешивали в течение 3 ч до растворения. В гомогенный раствор добавляли сахар-рафинад (450 кг), а затем перемешивали в течение 4 ч, получая щелочной раствор с рН 13 (далее обозначен как «BARODON^®-1»).

Пример получения 2

В BARODON^® - 1 (1,436 кг), полученный согласно примеру получения 1, добавляли по каплям раствор тиосульфата серебра (0,02 кг) в воде (1 л), перемешивали и выдерживали при температуре примерно 50°С в течение 4 ч в термостате. Образовавшийся раствор обозначили «BARODON^® - 2».

Пример получения 3

В очищенную воду (5 л), поддерживая температуру на уровне 100°С, добавляли при перемешивании молибдат натрия (Na₂MoO₄·2Н₂О, 0,3 кг), получая бесцветный раствор без запаха, который затем по каплям добавляли BARODON^® - 1, перемешивали и выдерживали при температуре 50°С в течение 4 ч в термостате. Образовавшийся раствор обозначили «BARODON^® - 3».

Пример получения 4

Используя 6 кг буры и 300 кг карбоната калия с помощью метода, аналогичного методу, описанному в примере 1, получали щелочной раствор. К щелочному раствору (1,557 кг) по каплям добавляли раствор тиосульфата серебра (0,02 кг) в воде (1 л), перемешивали и выдерживали при 50°С в течение 4 ч в термостате. Образовавшийся щелочной раствор обозначили «BARODON^® - 4».

Пример получения 5

Используя 150 кг сахара-рафинада и метод, описанный в примере получения 4, получали щелочной раствор с относительной низкой вязкостью (далее обозначен «BARODON^® - 5»).

Пример 1

Эффективность при культивировании риса

Оценивали способность BARODON® - 1 - BARODON® - 5 повышать иммунитет и способствовать росту культур риса на рисовых полях.

Каждый BARODON® - 1 - BARODON® - 5 разбавляли 10 объемами воды и вновь разбавляли водой в 500 раз. После погружения на 24 ч в разбавленный раствор семена риса высевали в рассадочные грядки в теплице. За 2 дня до трансплантации рисовых растений из рассадочных грядок на рисовые поля молодые растения опрыскивали обычным методом разбавленными растворами. Опрыскивание разбавленным раствором проводили вновь за две недели до трубкования риса (колошение риса).

Рост находящихся в рассадочных грядках молодых растений риса, обработанных композицией по настоящему изобретению, был более однородным и сильным, и они практически не имели повреждений, связанных с холодной погодой, по сравнению с контрольной группой растений, которую не обрабатывали композицией. Кроме того, было обнаружено, что молодые растения риса, обработанные композицией, полностью укоренились всего лишь через три дня после трансплантации. В полевых условиях обработанные растения риса не поражались никакими болезнями, включая черную ножку, пирикуляриоз листьев и ризоктониоз стеблей. Кроме того, обработанные растения риса обладали повышенной устойчивостью к полеганию и, как было установлено, не полегли после тайфуна, в результате которого полегло 25% контрольных растений.

Была произведена оценка количества полученного риса, данные приведены ниже в таблице 1.

Таблица 1
Композиция	Урожай на км2 (рис сорта Chuchung®)
Контроль	575 кг
BARODON®-1	655 кг
BARODON®-2	690 кг
BARODON®-3	710 кг
BARODON®-4	680 кг
BARODON®-5	670 кг

Пример 2

Эффективность при культивировании грушевых деревьев

BARODON® - 3 смешивали с 9 объемами воды и затем еще раз разводили в 500 раз. После внесения в грушевый питомник компоста и органических удобрений растения опрыскивали разбавленной композицией. После этого вокруг питомника помещали ограду, препятствующую проникновению животных. Примерно за две недели до цветения грушевых деревьев землю опрыскивали BARODON® - 2. Грушевые деревья, удобренные композициями по настоящему изобретению, зацвели примерно на 4-5 дней раньше и дали готовые к сбору плоды примерно на 15 дней раньше, чем контрольные растения, которые не удобряли композициями. Груши, собранные с обработанных деревьев, обладали лучшими характеристиками с точки зрения внешнего вида, размера и показателя Брикса. У груш, собранных с растений, удобренных композициями, на 60% было снижено появление черных пятен, и они оказались более мягкими по сравнению с контролем. На обработанных деревьях не обнаружено водянистых груш. Опадание плодов в результате тайфуна с грушевых деревьев, обработанных композициями по настоящему изобретению, оказалось на 20% ниже по сравнению с контролем. Груши, собранные с обработанных деревьев, были примерно на 15% больше по размеру по сравнению с контрольными. Показатель Брикса для груш, собранных с обработанных деревьев, составил 13,0-15,0, что примерно на 12% выше, чем в контроле. Улучшилась также способность плодов к хранению.

Пример 3

Воздействие на рост растений

Разбавленный в 16 раз раствор BARODON® - 3 в воде подвергали дополнительному разведению, кратность которого указана ниже в таблице 2, и затем опрыскивали листья опытных растений. Было установлено, что обработанные листья были на 15,6% длиннее, на 8,7% шире и имели на 7-47% более высокую массу во влажном состоянии по сравнению с контрольной группой, не обработанной раствором.

Таблица 2
	Вегетационный сосуд, No.	Максимальная ширина листьев (см)
Кратность разведения
200 раз	300 раз	400 раз	Без опрыскивания
9ый день после опрыскивания (10 июля)	1	6,1	6,1	6,2	5,4
2	6,0	6,3	6,2	5,9
Среднее значение	6,1	6.2	6,2	5,7
	Вегетационный сосуд, No.	Масса листьев во влажном состоянии (г/вегетационный сосуд)
Кратность разведения	Без опрыскивания
200 раз	300 раз	400 раз
9ый день после 2-ого опрыскивания (10 июля)	1	57,8	59,2	44,6	39,9
2	56,3	60,5	42,8	41.5
Среднее значение	57,1 (140%)	59,9 (147%)	43.7 (107%)	40,7 (100%)

Пример получения 6

BARODON® - 2, приготовленный согласно методу, описанному в примере получения 2, разбавляли с кратностью разведения 10 и 500 г полученного раствора. Использовали для опрыскивания 1 тонны комбикорма, получая многофункциональный (высокоэффективный) корм (обозначен далее «BARODON®-6»).

Пример получения 7

Разбавленный в 10 раз BARODON® - 2, полученный согласно методу, описанному в примере получения 2, в воде (10 л) вместе с сахаром-рафинадом (3 кг), хлоридом натрия (1 кг) и водой (75 л) добавляли к комбикорму (1 тонна), после чего образовавшуюся смесь ферментировали в течение 24 ч при перемешивании, получая многофункциональный (высокоэффективный) корм (далее обозначен «BARODON® - 7»).

Пример 4

Серии композиций BARODON® оценивали в отношении способности вызывать прирост массы и повышать иммунитет животных следующим образом.

(1) Способность вызывать прирост массы свиней

Для опыта отбирали 30 голов полученных в результате скрещивания трех пород (Yorkshire x Landrace x Durroc) гибридных откормленных свиней, каждая возрастом 15 недель (104±4 дня). Их всех помещали в 3 загона для свиней, каждый размером 4×4,2 м, из расчета по 10 голов свиней на загон и адаптировали к новым условиям в течение 1 недели до начала опыта.

BARODON® - 6, приготовленный согласно методу, описанному в примере 6, включали в корм группы из 10 свиней (обозначена как «Тх-1-группа») в одном из загонов для свиней в течение 9 недель, в то время как в другом загоне для свиней группу из 10 свиней (обозначена как «Тх-2-группа») кормили композицией, содержащей 3% BARODON® - 7, приготовленной согласно методу, описанному в примере 7. Контрольной группе давали такой же корм, но без добавки «BARODON®». После этого всем свиньям давали обычный корм. Во время опыта все свиньи имели свободный доступ к корму.

В течение 6 недель для каждой группы оценивали прирост массы и поглощение корма и из этих данных рассчитывали эффективность использования кормов (поглощение корма/прирост массы). Было рассчитано, что средний ежедневный прирост массы контрольной группы составлял 842,86 г, для Тх-1-группы - 890,48 г и для Тх-2-группы - 880,95 г, этот показатель в двух последних группах оказался улучшенным на 5,65% и 4,52% соответственно по сравнению с контрольной группой. Среднее суточное потребление корма составило 2,71 кг для контрольной группы, 2,77 кг для Тх-1-группы и 2,65 кг для Тх-2-группы. Таким образом, конверсия корма в контрольной группе составила 3,22, для Тх-1-группы рассчитано, что этот показатель составляет 3,11, что означает улучшение на 3,54%, а в Тх-2-группе конверсия корма составила 3,01, что означает улучшение на 6,98%.

(2) Вкус свинины

Свинину из каждой тестируемой группы давали попробовать на вкус здоровым добровольцам обоих полов*, и они оценивали вкус и качество мяса.

Таблица 3
	Мягкость мяса	Мягкость мяса
мягкое	жесткое	хороший	средний
Контроль	0	8	0	3
Тх-1	6	1	8	2
Тх-2	11	0	10	0
* Количество людей, ответивших на вопросы после тестирования.

(3) Распределение иммуноцитов в периферической крови свиней

С помощью моноклональных антител, специфических в отношении поверхности лейкоцитов, и проточного цитометра, например, поставляемого фирмой Dickinson Immunocytometry System, Сан-Хосе, Калифорния, США, типа FACSCalibur, в периферической крови животных из Тх-1-и Тх-2-группы и контрольной группы определяли соотношение клеток, экспрессирующих главный комплекс гистосовместимости (МНС), и субпопуляций лимфоцитов.

(3-1) Выделение лейкоцитов из периферической крови

Кровь, взятую из передней полой вены свиней, хорошо перемешивали с цитратно-декстрозным раствором (ACD)-этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТК) и наносили на фикол-пак (Histopaque, фирма Sigma, Сент Луис, штат Миссури, США). После центрифугирования при 1500 об/мин в течение 30 мин получали лейкоциты, трижды промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (ЗФР, рН 7,2) и суспендировали в среде RPMI-1640 (фирма GibcoBRL, Гранд Айленд, штат Нью-Йорк, США). Для оценки количество лейкоцитов доводили до 1×10⁷ клеток/мл, при этом жизнеспособные клетки подсчитывали с помощью анализа исключения трипанового синего.

(3-2) Моноклональные антитела для оценки субпопуляций лейкоцитов

Воздействия на иммунную систему свиней, включая популяции иммуноцитов, определяли с использованием моноклональных антител, обладающих специфической реактивностью в отношении клеточных мембран свиных лейкоцитов, т.е. антигенов МНС класса II, Ро(свиной)СD2, PoCD4, PoCDS, поверхностного IgM (sIgM), ни Т/ни В (γδ TCR, Т-клеточный рецептор), и гранулоцитов и моноцитов (Г + М), которые приведены ниже в таблице 4.

Таблица 4
МАт*	Изотип МАт	Молекулы**	Тип клеток***	Ссылка
РТ85А	IgG2a	МНС класса I	Все нуклеарные клетки	Davis и др. (1987)
Н42А	IgG2a	МНС класса II	Ar-презентирующие клетки	Davis и др.(1987)
ТН81 А5	IgG2a	МНС класса II	Ar-презентирующие клетки	Davis и др.(1987)
MSA4	IgG2a	PoCD2	Т-клетки	Davis и др. (1987)
РТ90А	IgG2a	PoCD4	Тh/i-лимфоциты	Davis и др. (1987)
РТ81В	IgG2a	PoCD8	Т c/s (Т-лимфоциты-супрессоры)	Davis и др.(1987)
Plg45 А	IgG2b	SIgM	В-клетки	Davis и др. (1987)
РТ79А	IgG2a	γδTCR	N-клетки	Davis и др.(1987)
DH59 В	IgG1	Гранулоциты + моноциты	Гранулоциты + моноциты	Davis и др.(1987)
*МАт: моноклинальные антитела, обладающие специфической реактивностью в отношении различных субпопуляций дифференцировки лейкоцитов** Молекулы: Молекулы различных субпопуляций дифференцировки лейкоцитов свиней***Тип клеток: Клетки, экспрессирующие молекулы

(3-3) Проточная цитометрия

С использованием программы для проточной цитометрии CellQuest соотношения субпопуляций лейкоцитов анализировали согласно методу, описанному у Davis и др. (1990). Для того чтобы воспользоваться преимуществом проточной цитометрии с лазерным лучом, клетки метили с использованием косвенного метода с помощью одного или двух флуоресцентных красителей, таких как флуоресцининтиоцианат (ФИТЦ) и фикоэритрин (ФЭ). В каждую лунку 96-луночного микропланшета с V-образным дном вносили по 100 мкл выделенных из крови лейкоцитов (плотность клеток 1×10⁷ клеток/лунку) и по 50 мкл моноклонального антитела (концентрация 15 мкг/мл) и сенсибилизировали в течение 30 мин при 4°С, затем трижды промывали первым буфером для промывки [ЗФР, 450 мл; ACD, 50 мл; 20% NaN₃ 5 мл; лошадиная сыворотка без гамма-глобулина (фирма GibcoBRL), 10 мл; 250мМ ЭДТК, 20 мл; 0,5% фенолового красного, 1 мл] посредством центрифугирования. После сцеживания супернатанта находящийся на дне клеточный дебрис суспендировали с помощью смесителя для планшетов или вибрационного смесителя (фирма Scientific Industries, Богемия, штат Нью-Йорк, США.).

В анализе с использованием одного красителя конъюгированное с ФИТЦ козье антимышиное антитело IgG+IgM (фирма Caltag Lab, США), которое служило в качестве вторичного антитела, разбавляли с кратностью разведения 200 и вносили по 100 мкл в каждую лунку, в которой находились суспендированные лейкоциты. После сенсибилизации в течение 30 мин при 4°С с помощью центрифугирования осуществляли три промывки с использованием второго буфера для промывки, который имел такой же состав, что и у первого буфера для промывки, не содержал лошадиной сыворотки. С целью фиксации клеток в каждую лунку добавляли раствор 2% ЗФР-формалин (38% формалина, 20 мл, ЗФР, 980 мл) в количестве 200 мкл.

В анализе с использованием двух красителей для окраски клеток PoCD4 (ФИТЦ) конъюгировали с PoCD8 (ФЭ), PoCD4 (ФИТЦ) с МНС класса II (ФЭ) и РоСD8(ФИТЦ) с МНС класса II (ФЭ). Более подробно метод состоит в следующем: лейкоциты из одной из лунок смешивали с парой моноклональных антител и подвергали первичной сенсибилизации в зависимости от результатов анализа с использованием одного красителя, затем промывали трижды с помощью первого буфера для промывки при 4°С. После этого козье антитело, специфическое для каждого изотипа моноклонального антитела, добавляли из расчета 1,0 мкг на лунку для конъюгированных с ФИТЦ молекул и 0,1 мкг на лунку для конъюгатов с ФЭ, после чего подвергали второй сенсибилизации в течение 30 мин при 4°С. Процессы промывки и фиксации осуществляли аналогично методикам, описанным для анализа с одним красителем.

После завершения процесса окраски клетки до исследования хранили при 4°С в темном, прохладном месте. С помощью проточной цитометрии 2000 или большее количество окрашенных клеток анализировали в отношении количества позитивно реагирующих клеток. Для проведения измерений и оценки результатов использовали программное обеспечение FACScalibur и CellQuest (фирма Becton Dickinson).

Результаты позволили установить, что относительное содержание CD4⁺-Т-лимфоцитов в периферической крови свиней начало повышаться через 3 недели после начала кормления животных содержащим BARODON® кормом, что продемонстрировано на фиг.1, а на восьмой неделе после начала кормления в Тх-1-и Тх-2-группах были обнаружены существенно более высокие уровни CD4⁺-Т-лимфоцитов по сравнению с контрольной группой (р<0,05). В частности, в Тх-1-группе более высокие уровни CD4⁺-Т-лимфоцитов поддерживались в течение периода с 8 по 13 неделю после начала эксперимента (р<0,05).

Высокий уровень CD8⁺-Т-лимфоцитов обнаружен в Тх-2-группе на 3-й неделе после начала эксперимента (р<0,01), однако заметных различий по сравнению с контрольной группой не обнаружено, начиная с 8 недели эксперимента (р<0,05), что продемонстрировано на фиг.4.

Количество клеток, экспрессирующих антигены МНС класса II, главным образом макрофагов, в Тх-1-группе оказалось существенно увеличенным по сравнению с контролем к 11 неделе после начала эксперимента (р<0,05), а в Тх-2-группе - к 8 неделе после начала эксперимента, что продемонстрировано на фиг.2.

Количество «ни Т-»/«ни В-лимфоцитов» (N-лимфоцитов) в Тх-2-группе сохранялось на более высоком уровне, по сравнению с контрольной группой (р<0,01) с 3-й недели после начала эксперимента, что продемонстрировано на фиг.3, эти результаты свидетельствуют о возможном повышении как неспецифических, так и специфических иммунных защитных реакций. В период с 11 по 13 неделю после начала эксперимента количество «ни Т»/«ни В-лимфоцитов» сохранялось на существенно более высоком уровне в Тх-2-групе по сравнению с контрольной группой (р<0,01).

Сравнение групп, питающихся кормом с добавлением двух разных композиций BARODON®, позволило установить, что Тх-2-группа имеет выраженное преимущество по сравнению с Тх-1-группой в отношении количества клеток, экспрессирующих антиген МНС класса II, в течение периода с 3 по 8 неделю после начала эксперимента (р<0,05), что продемонстрировано на фиг.2. В Тх-2-группе через 3 недели после начала эксперимента выявлено несколько меньшее количество клеток, экспрессирующих CD4 и CD8, по сравнению с Тх-1-группой (р<0,1), что продемонстрировано на фиг.1 и 4. Для Тх-2-группы по сравнению с Тх-1-группой обнаружено заметное повышение количества «ни Т-»/«ни В-лимфоцитов» на 13 неделе после начала эксперимента, что продемонстрировано на фиг.3.

(4) Воздействие на активность лимфоцитов крови и лимфатических узлов

Для оценки активностей лимфоцитов крови и лимфатических узлов оценивали их пролиферативные реакции с помощью включения [³H]-тимида в свиные лимфоциты, полученные из периферической крови и мезентериальных лимфатических узлов после стимуляции конкавалином (Con A), фитогемаглютинином (ФГА), экстрактом корня лаконоса (PWM) и липополисахаридом (LPS).

При стимуляции PWM лимфоцитов, полученных из периферической крови Тх-2-группы через 8 недель после начала кормления содержащим BARODON® кормом, обнаружен более высокий уровень пролиферации, о чем свидетельствует более высокий индекс стимуляции (ИС) для Тх-группы по сравнению с контрольной группой (р<0,05). К 11 неделе после начала эксперимента для лимфоцитов, выделенных из периферической крови как Тх-1-группы, так и Тх-2-группы, обнаружены более выраженные пролиферативные реакции при стимуляции любым из стимуляторов ФГА, PWM и LPS по сравнению с реакцией лимфоцитов, выделенных из периферической крови контрольной группы, о чем свидетельствуют более высокие значения ИС (р<0,01), что продемонстрировано на фиг 5.

Для лимфоцитов, выделенных из мезентериальных лимфатических узлов, на 8 неделе после начала эксперимента были обнаружены значительно более высокие величины ИС по сравнению с контрольной группой в отношении реакции как Тх-1-группы, так и Тх-2-группы на стимуляцию ФГА (р<0,05) и PWM (р<0,01). На 11 неделе после начала обработки в Тх-1-группе были обнаружены более выраженные стимулированные Con А и ФГА лимфопролиферативные реакции по сравнению с контрольной группой (р<0,01), а для Тх-2-группы обнаружены более высокие значения ИС в ответ на стимуляцию Con А, ФГА и PWM (р<0,05), что проиллюстрировано на фиг.6.

(5) Воздействие на количественные соотношения субпопуляций CD4⁺- и CD8⁺-Т-лимфоцитов селезенки и лимфатических узлов

Для анализа соотношения Т-лимфоцитов использовали иммуногистохимический анализ. После иммунологического окрашивания с использованием АВС-метода (авидин-биотин-пероксидазный комплекс) количество CD4⁺ -, CD8⁺ - и CD4⁺ CD8⁺ - dpp-T-лимфоцитов в мезентериальных лимфатических узлах и селезенке определяли с помощью анализатора изображения (фирма Olympus, США.). Результаты иммуногистохимического анализа представлены в таблицах 5 и 6, ниже. Как видно из таблицы 5, в то время как повышение содержания CD4⁺-Т-лимфоцитов в селезенке обнаружено только в Тх-2-группе, содержание CD8⁺ - и CD4⁺ CD8⁺-Т-лимфоцитов в значительной степени увеличилось в обеих Тх-1-и Тх-2-группах (р<0,001). С другой стороны, в мезентериальных лимфатических узлах в обеих группах Тх-1 и Тх-2 значительно увеличилось содержание всех CD4⁺ -, CD8⁺ - и CD4⁺ CD8⁺ - dpp-Т-лимфоцитов (р<0,01), что продемонстрировано ниже в таблице 6. В частности более высокие уровни субпопуляций Т-лимфоцитов были обнаружены в Тх-2-группе (р<0,01).

Таблица 5
Группа	CD4+	CD8+	CD4+CD8+	dpp
Контроль	11±1	8±1	3±1
Тх-1	11±1	11±1	6±1
Тх-2	14±1	17±1	11±1
Таблица 6
Группа	CD4+	CD8+	CD4+CD8+	dpp
Контроль	32±5	29±2	10±1
Тх-1	35±4	39±4	32±3
Тх-2	40±4	47±5	35±4

(6) Воздействие на пр