Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления днк вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (пцр)

Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления днк вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (пцр)

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, в частности инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС).

До настоящего времени основным способом диагностики ИРТ КРС, вызываемого вирусом герпеса крупного рогатого скота первого типа, является длительная процедура, основанная на выделении вируса в чувствительной культуре клеток и постановке реакции нейтрализации в той же культуре клеток с парными пробами сыворотки крови, отобранными от больных животных дважды с интервалом 21 день.

К недостаткам данного способа можно отнести длительность и трудоемкость.

Известен также способ выявления ДНК вируса при помощи метода молекулярной гибридизации, включающий клонирование Hind фрагмента ДНК вируса ИРТ КРС в вектор, в который затем вводится биотин. При этом в качестве вектора используют однонитиевую ДНК фага М13mp8, а в качестве метки используют биотин, который вводится в вектор путем химической модификации ДНК по цитозиновым звеньям. Чувствительность выявления ДНК вируса ИРТ КРС при этом составляет 10^4-5 ТЦД_50/мл. (RU 2054487, C 12 Q 1/68, опубл. 20.02.1996).

К недостаткам данного способа можно отнести длительную процедуру клонирования фрагмента ДНК вируса в векторную ДНК и мечения биотином, а также недостаточную чувствительность выявления ДНК вируса, равную 10^4-5 ТЦД_50/мл.

Также известен способ выявления ДНК вируса ИРТ КРС в сперме инфицированных быков-производителей, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий выделение ДНК вируса из спермы инфицированных быков-производителей, синтез олигонуклеотидных праймеров на ген гликопротеина gl, амплификацию ДНК вируса в гнездовой ПЦР, обнаружение амплифицированного фрагмента ДНК с помощью электрофореза в 4%-ном полиакриламидном геле и его рестрикции при помощи ферментов Smal, Ava и 1 Ddel для определения размера (М.А.Rocha, E.F.Barbosa, S.E.F.Guimaraes, E.Dias Neto, A.M.G.Gouveia, "A high sensitivitynetsted PCR assay for BHV-1 detection in semen of naturally infected bulls". Veterinary Microbiology, 1998, v.63. - pp.1-11).

К недостаткам данного способа можно отнести то, что он проводится методом гнездовой ПЦР, требующей синтез двух пар праймеров (внутренних и наружных) и, соответственно, проведения реакции в два раунда, необходимость проведения рестрикционного анализа для определения размера синтезируемых продуктов, который в 4%-ном полиакриламидном геле составляет 468 и 344 баз пар для наружных и внутренних праймеров, соответственно. Кроме того, данный способ разработан только для выявления ДНК вируса ИРТ КРС в пробах спермы инфицированных быков производителей.

Наиболее близким аналогом заявляемой группы изобретений является способ выявления ДНК вируса ИРТ КРС при помощи одноступенчатой ПЦР с использованием пары праймеров 5'-AGA CCC CAG TTG TGA TGA ATG C-3' и 5'-ACA CGT CCA GCA CGA ACA CC-3', комплиментарных высоко консервативной области генома вируса ИРТ КРС гена тимидинкиназы (tk) (Kibenge F.S. et al, "Amplification of strains of bovine herpesvirus 1 by use polymerase chain reaction with primers in the thymidine kinase region", American Journal of Veterinary Research, 1994, Sep; 55(9):1206-1212).

К недостаткам данного аналога можно отнести то, что за счет использования пары праймеров 5'-AGA CCC CAG TTG TGA TGA ATG C-3' и 5'-ACA CGT CCA GCA CGA ACA CC-3', специфичный ПЦР продукт выявляется методом Саузерн блот гибридизации после рестрикции продукта Sac II рестриктазой, а также длительное время проведения анализа.

Технической задачей изобретения является разработка новых синтетических праймеров и нового эффективного метода выявления вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (ИРТ КРС). Техническим результатом изобретения является повышение степени специфичности и чувствительности, а также сокращение времени проведения метода, за счет проведения ПЦР за один шаг, без последующего рестрикционного анализа, в пробах биоматериала от больных животных различного происхождения.

Сущность заключается в том, что создают синтетические праймеры, комплементарные высоко консервативной области генома вируса ИРТ КРС района гена тимидинкиназы (tk), имеющие следующий нуклеотидный состав:

5'-TGG TAC GGA CGC CTT AAGTGG-3'; и

5'-GTT GAT CTC GCG GAG GCA CTA-3'.

Сущность изобретения заключается также в том, что выявление вируса ИРТ КРС проводят методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), предусматривающим амплификацию ДНК вируса ИРТ на синтетических олигонуклеотидных праймерах, перенос продукта амплификации на гель и оценку проведения реакции.

Сущность заключается также в том, что в случае положительной реакции синтезируется фрагмент, который в геле, подходящем для проведения электрофореза, например агарозе, соответствует размеру 298 п.н. Для определения размера фрагмента вносится маркер молекулярного веса pUC19, обработанный рестриктазой Mspl.

Существенным отличием заявляемого способа от аналога является то, что в качестве праймеров используются нуклеотидные последовательности гена тимидинкиназы (tk) 5'-TGG TAC GGA CGC CTT AAGTGG-3' и 5'-GTT GAT CTC GCG GAG GCA GTA-3'. ПЦР проводится без последующего рестрикционного анализа синтезированного фрагмента. Результаты реакции визуализируются в геле. В случае положительной реакции синтезируется фрагмент, который в геле соответствует размеру 298 п.н. Для определения размера фрагмента вносится маркер молекулярного веса pUC19, обработанный рестриктазой Mspl. Кроме того, предлагаемый способ эффективно выявляет ДНК Российских референтных штаммов и изолятов вируса ИРТ КРС, а также ДНК вируса в пробах различного биоматериала от больных и инфицированных животных.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Амплификация участка ДНК вируса ИРТ КРС, кодирующего тимидинкиназу.

Полимеразная цепная реакция. Инкубационная смесь конечным объемом 50 мкл содержит: 60 мМ Tris-Hcl (pH 8,5 при 25°С); 1,5 мМ MgCl; 25 мМ KCl; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0,1% Тритон Х-100; 5% ДМСО; 2,5мМ dNTP; 100 нг праймеров; 10 мкл ДНК матрицы (-0,1 мкг); 5 ед. Taq ДНК-полимеразы. Поверх смеси наслаивали 25 мкл минерального масла. Все манипуляции по приготовлению реакционной смеси осуществляли на тающем льду.

Температурный режим проведения ПЦР: денатурация при 95°С в течение 5 мин, 35 циклов: 95°С - 30 с, 64°С - 30 с, 72°С - 40 с. Завершающий синтез при 72°С в течение 5 мин.

После завершения ПЦР отбирают водную фазу и смешивают ее с равным объемом раствора, содержащего фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:25:1). После центрифугирования в центрифуге MPW 310 при 14000 об/мин в течение 30 с, водную фазу отбирают и осаждают ДПК этиловым спиртом с ацетатом натрия. Осадок растворяют в 20 мкл воды.

Пример 2. Определение размера продуктов ПЦР.

Маркер молекулярного веса состоит из продуктов расщепления ДНК плазмиды pUC19 эндонуклеазой рестрикции Mspl. Результат считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 298 нуклеотидных пар.

Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном трис-ацетатном буфере (рН 8,0).

10 мкл продукта ПЦР смешивают с 2 мкл буфера для нанесения образца и вносят в лунку агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 10 В/см длины геля до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (примерно 40-60 минут). Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор». Положительными считают пробы, полосы в которых располагаются в геле точно на таком же расстоянии от старта, что и полосы положительного контроля, что соответствует размеру фрагмента 298 н.п.

Чувствительность ПЦР при таком режиме составляет 10 ТЦД_50/мл.

Пример 3. Определение специфичности ПЦР на основе синтетических праймеров, синтезированных на ген тимидинкиназы.

Результаты опытов по определению специфичности реакции представлены в табл.1.

Таблица 1Оценка специфичности ПЦР
Вирус (штамм)	Амплификация с праймерами на регион tk
Герпесвирус КРС 1 типа (Оренбург)	+
Герпесвирус КРС 2 типа (М)	-
Герпесвирус КРС 4 типа (Movar-33/63)	-
Вирус болезни Ауески (Арский)	-
Аденовирус КРС 1 типа (BV-10)	-
Риновирус КРС 1 типа (SD-1)	-
ДНК культуры клеток MDBK	-
Примечание: «+» положительный результат;
«-» отрицательный результат

Пример 4. Выявление ДНК Российских референтных штаммов и изолятов вируса ИРТ КРС, типированных в реакции нейтрализации в культуре клеток.

К 250 мкл осветленной суспензии вируса добавляют 30 мкл 10-кратного ТЕ, 15 мкл протеиназы К (конц. 2 мг/мл), 30 мкл 10%-ного SDS. Инкубируют на водяной бане при 50-56°С в течение 1-2 часов. Затем добавляют равный объем (300 мкл) фенола, перемешивают и осаждают центрифугированием при 9000 об/мин в течение 10 мин. Отбирают супернатант в чистую пробирку, приливают по 0,5 объема фенола и хлороформа, повторяют центрифугирование. Отобранный супернатант смешивают с равным объемом хлороформа, центрифугируют при 9000 об/мин в течение 5 мин. К отобранному супернатанту добавляют 2,5 объема 96%-ного этанола и 0,1 объема 3М ацетата натрия и выдерживают при -20°С в течение 12 часов. После этого содержимое пробирки центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5 мин, сливают супернатант, а осадок промывают 2 раза 70%-ным и 1 раз 96%-ным этанолом и высушивают. Затем к осадку добавляют 30 мкл деионизованной воды и перемешивают. В качестве матрицы для проведения ПЦР используют 5 мкл полученной пробы.

Результаты тестирования штаммов и изолятов вируса представлены в табл.2.

Таблица 2Амплификация ДНК штаммов и изолятов вируса ИРТ КРС в ПЦР с использованием праймеров на ген тимидинкиназы
№п/п	Наименование штаммов (изолятов)	Клиническая форма заболевания, источниквыделения	Амплификация в ПЦР
Штаммы
1	Оренбург	респираторная	+
2	4016	респираторная	+
3	ТК	респираторная	+
4	ТНЛ	респираторная	+
5	М-29	респираторная	+
6	М-40	генитальная	+
7	ТНЛ-2	респираторная	+
8	Щ	респираторная	+
9	ТК-А	аттенуированный	+
Изоляты
9-13	СП, СБ, СК, С3, МС	Сперма	+
14-20	И1,Кам,И1,С2,П,ВВ	Генитальная	+
21-28	Б,Я99,И2,К1,ПВ,Мт, Л, Я	респираторная	+
29	М	Конъюнктивит	+
30-31	У (абортплод), ПВМ	Мозг	+

Результаты показали, что ПЦР выявляет ДНК всех исследованных штаммов и изолятов вируса, выделенных в культуре клеток от больных и инфицированных животных и типированных в реакции нейтрализации. Результаты были сходными во всех повторностях.

Пример 5. Выявление ДНК вируса ИРТ КРС в пробах биологического материала, полученного от больных животных.

Образец биологического материала (пробы внутренних органов) весом 300-500 мг растирают в ступке со стеклянным порошком (100-200 мг) и готовят 10%-ные суспензии на физрастворе, которые осветляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. Для выделения ДНК используют по 250 мкл осветленного супернатанта.

К 250 мкл осветленной суспензии биоматериала добавляют 30 мкл 10-кратного ТЕ, 15 мкл протеиназы К (конц. 2 мг/мл), 30 мкл 10%-ного SDS. Инкубируют на водяной бане при 50-56°С в течение 1-2 часов. Затем добавляют равный объем (300 мкл) фенола, перемешивают и осаждают центрифугированием при 9000 об/мин в течение 10 мин. Отбирают супернатант в чистую пробирку, приливают по 0,5 объема фенола и хлороформа, повторяют центрифугирование. Отобранный супернатант смешивают с равным объемом хлороформа, центрифугируют при 9000 об/мин в течение 5 мин. К отобранному супернатанту добавляют 2,5 объема 96%-ного этанола и 0,1 объема ЗМ ацетата натрия и выдерживают при -20°С в течение 12 часов. После этого содержимое пробирки центрифугируют при 12000 об/мин в течение 5 мин, сливают супернатант, а осадок промывают 2 раза 70%-ным и 1 раз 96%-ным этанолом и высушивают. Затем к осадку добавляют 30 мкл деионизованной воды и перемешивают. В качестве матрицы для проведения ПЦР используют 5 мкл полученной пробы.

Пример 6. Выявление ДНК вируса ИРТ КРС в пробах спермы

Из проб спермы инфицированных быков-производителей готовят 5%-ные суспензии на физрастворе с последующим центрифугированием при 2000 об/мин 15 мин. Дальнейшая процедура согласно примерам 4 и 5.

Пример 7. Выявление ДНК вируса ИРТ КРС в пробах носовых и вагинальных выделений больных животных.

Из проб носовых и вагинальных выделений готовят 10%-ные суспензии, а если истечения очень густые, предварительно растирают в фарфоровых ступках с песком. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Дальнейшая процедура согласно примерам 4 и 5.

1. Синтетические праймеры, комплементарные высококонсервативной области генома вируса ИРТ КРС района гена тимидинкиназы (tk), используемые для выявления ДНК вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, имеющие следующий нуклеотидный состав:

5'-TGG TAC GGA CGC CTT AAGTGG-3'; и

5'-GTT GAT CTC GCG GAG GCA СТА-3'.

2. Способ выявления вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции (ПНР), включающий амплификацию ДНК вируса инфекционного ринотрахеита, на синтетических олигонуклеотидных праймерах по п.1, перенос продукта амплификации на гель и оценку проведения реакции, отличающийся тем, что праймеры имеют нуклеотидные последовательности:

5'-TGG TAC GGA CGC CTT AAGTGG-3'; и

5'-GTT GAT CTC GCG GAG GCA СТА-3';

в гель вносят маркер молекулярного веса - плазмиду pUC19, предварительно обработанную рестриктазой Mspl, а оценку проведения реакции осуществляют по размеру продукта ПЦР, при этом результат реакции считается положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 298 пар оснований.