Способы и составы для измерения уровня содержания вторичных продуктов обмена веществ в растениях

Способы и составы для измерения уровня содержания вторичных продуктов обмена веществ в растениях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка представляет собой частичное продолжение патентной заявки США №09/012453 с притязанием на приоритет предварительной заявки №60/072156.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение включает в себя способы и составы для модификации соединений, получаемых в результате вторичных процессов обмена веществ в растениях. Также настоящее изобретение включает в себя клетки растений с модифицированным уровнем содержания вторичных продуктов обмена веществ и семена растений с модифицированным уровнем содержания вторичных продуктов обмена веществ. В одном из вариантов осуществления изобретения изменяется содержание вторичных продуктов обмена веществ, нежелательных с точки зрения питательных свойств, в растениях, клетках растений и семенах растений. В другом варианте осуществления изобретения изменяется уровень содержания продуктов, входящих в фенилпропаноидные и сахарно-спиртовые процессы обмена веществ в растениях, клетках растений и семенах растений. Помимо этого настоящее изобретение включает в себя генетические конструкции и векторы, которые могут быть использованы для изменения содержания вторичных продуктов обмена веществ в клетках и семенах растений. Дополнительно настоящее изобретение относится к кормовым смесям на основе модифицированных зерновых культур и корму для животных, содержащему модифицированные зерновые культуры, в частности к кормовым смесям на основе зерновых культур с уменьшенным или измененным содержанием вторичных продуктов обмена веществ.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В результате вторичных процессов обмена веществ в растениях вырабатываются разнообразные соединения. Несмотря на свое общепризнанно малое значение для обмена веществ в растениях, вторичные процессы обмена веществ приводят к образованию уникальных биохимических соединений, часть из которых считается нежелательными с точки зрения питательных свойств или даже токсичными. Вторичные процессы обмена веществ и соединения, получаемые в результате них, являются характерными признаками биологических индивидуумов или родов. Таким образом, управление вторичными процессами обмена веществ может быть использовано для получения новых комплексов биохимических соединений или растительных тканей с измененным содержанием вторичных продуктов обмена веществ. В частности, управление вторичными процессами обмена веществ с целью изменения содержания нежелательных с точки зрения питательных свойств или токсичных вторичных продуктов обмена веществ может найти уникальные варианты применения в пищевой и кормовой промышленностях.

В предпочтительном варианте управление вторичными процессами обмена веществ должно осуществляться без вмешательства в биохимические процессы, которые считаются важными для роста и жизнеспособности растительных клеток. Биохимические процессы и участвующие в них химические соединения, имеющие первоочередное значение для роста и жизнеспособности растений, рассматриваются как первичные процессы обмена веществ и их продукты. В общем случае считается, что первичные процессы обмена веществ включают в себя такие биохимические процессы, которые приводят к образованию первичных сахаров (например, глюкозы), аминокислот, жирных кислот, нуклеотидов и производных полимеров (полисахаридов, таких как крахмал, белки, липиды, РНК, ДНК и т.д.) (Yeoman, Yeoman, Tansley Review No. 90, Manipulating Secondary Metabolism in Cultured Plant Cells (Управление вторичными процессами обмена веществ в клетках культивируемых растений). New Phytologist, 134, стр.553-569, 1996).

Таким образом, считается, что первичными процессами обмена веществ являются те процессы обмена веществ, которые влияют на жизнеспособность и рост всех клеток растения, в то время как вторичные процессы обмена веществ могут быть определены как те биохимические процессы, которые не имеют значения для всех клеток растения. Например, вторичные процессы обмена веществ определяют такие свойства растения, как цвет, вкус, морфологию и т.п. Вторичные процессы обмена веществ также приводят к образованию различных химических соединений, которые распознаются насекомыми или участвуют в патогенной реакции растений. Некоторые из этих соединений могут быть полезны для жизнеспособности отдельных растений в условиях дикой природы, но при культивировании окажутся вредными для качества урожая или будут накладывать ограничения на спектр возможных применений такой растительной продукции. Некоторые вторичные продукты обмена веществ представляют собой уникальные соединения, которые вырабатываются отдельными растениями в результате особых биохимических процессов. Биохимические механизмы, задействованные во вторичных процессах обмена веществ, не столь разнообразны, как в случае первичных процессов обмена веществ, вследствие чего количество механизмов образования вторичных продуктов обмена веществ в растениях обычно также ограничено. Вторичные продукты обмена веществ, как правило, характерны больше для индивидуальных растений, чем универсальные биохимические соединения, участвующие в первичных процессах обмена веществ.

Результатом многочисленных попыток управлять первичными процессами обмена веществ стало получение растительных клеток с измененным содержанием крахмала или масел (липидов). Однако серьезное вмешательство в первичные процессы обмена веществ может привести к отрицательным последствиям. Например, несмотря на то что изменение состава липидов может принести положительные результаты, полное удаление липидов, несомненно, отрицательно скажется на жизнеспособности растений. Управление первичными процессами обмена веществ не всегда оказывается успешным, поскольку результаты всех таких попыток могут быть сведены до минимума вследствие активизации альтернативных биохимических механизмов. Таким образом, первичные процессы обмена веществ в растениях редко поддаются управлению таким образом, чтобы результат вмешательства был предсказуемо полезным и заметным в условиях культивирования.

Существуют примеры успешного изменения первичных процессов обмена веществ, в результате чего были получены новые фенотипы, причем в этих случаях изменения касались биохимического состава, а не уменьшения или полного удаления отдельных веществ. Обычно такие результаты достигались путем эктопического изменения степени экспрессии растительного гена, например достижения избыточной экспрессии гена в определенных растительных тканях, нерегулируемой экспрессии гена, а также путем ингибирования отдельного гена с помощью антисенсибилизирующей РНК, рибозим или ко-супрессии. Однако результаты этих экспериментов были трудно предсказуемы заранее.

Степень экспрессии растительного фермента может быть изменена на большом количестве уровней, в том числе на уровне экспрессии его гена, трансляции, видоизменения белка, а также аллостерического управления активностью белка. Поэтому эктопическое изменение экспрессии растительного гена, участвующего в первичных процессах обмена веществ, может оказаться недостаточным для преодоления биохимических факторов регулирования этих процессов. Кроме того, разнообразие альтернативных механизмов первичных процессов обмена веществ также создает серьезные трудности на пути управления этими процессами, поскольку все эти процессы имеют первоочередное значение для роста и жизнеспособности растений. В силу вышеназванных причин попытки внести изменения в первичные процессы обмена веществ очень редко приводят к созданию желаемого фенотипа. Более того, наблюдение за такими генетически модифицированными растениями в полевых условиях или под влиянием разнообразных климатических условий чаще всего приводило к выводу о том, что предсказанное свойство растений не проявляется или же производительность культуры снижается. Таким образом, модифицирование первичных процессов обмена веществ с целью получения желаемых фенотипов требует тщательного анализа их механизмов или отдельных стадий этих процессов.

Управление вторичными процессами обмена веществ было затруднено вследствие слабого понимания биохимии происходящих процессов, недостаточной информации о генах, проявляющихся в ходе этих процессов, и общей сложности взаимосвязей между биохимическими механизмами.

Следует, однако, отметить, что изменение вторичных процессов обмена веществ может стать эффективным способом получения новых фенотипов, включая фенотипы с измененными уровнями содержания продуктов вторичного обмена веществ, например, тех продуктов, которые считаются нежелательными с точки зрения питательных свойств растений. Поэтому механизмы вторичных процессов обмена веществ являются важным направлением исследований по генетической модификации растений.

Объектами исследований, направленных на изменение уровней содержания конечных продуктов вторичных процессов обмена веществ, были два механизма, по которым эти процессы реализуются в растениях. Способы, использовавшиеся для управления этими механизмами, не принесли желаемых результатов. Например, фенилпропаноидный механизм участвует в образовании лигнина и считается вторичным процессом обмена веществ. Биосинтез лигнина является частью общего фенилпропаноидного процесса биосинтеза, в результате которого образуются, по крайней мере, три первичных фенольных предшественника, а именно кумаровая, феруловая и синапиновая кислоты, производные которых полимеризируются с образованием лигнина и прочих фенольных соединений (см. Фиг.2).

В настоящее время в ходе исследований, направленных на модификацию вторичного фенилпропаноидного процесса обмена веществ, гены многих ферментов, участвующих в образовании мономеров лигнина, рассматриваются в качестве возможных объектов воздействия с целью понижения уровня лигнина с помощью методов антисенсибилизирования или ко-супрессии (патенты США №№5451514 и 5633439, а также WO 93/05160 и WO 94/08036). К этим генам относятся гены, которые кодируют дегидрогеназу циннамилового спирта, оксиметилтрансферазу кофеиновой кислоты и лиазу фенилаланина аммония. Вышеуказанные методы направлены на снижение содержания лигнина, в результате чего предполагается достичь благоприятного эффекта с точки зрения технологических и пищевых свойств растений.

Однако снижение уровня содержания лигнина путем антисенсибилизирующего или ко-супрессивного воздействия на один из генов, участвующих в фенилпропаноидном механизме обмена веществ, может иметь ряд нежелательных последствий. Среди таковых могут быть повышенная склонность к болезням, замедление роста или снижение механической прочности растительных волокон, и, как следствие, снижение агрономической ценности растений. Исследования показали, что ингибирование фермента аммонийфенилаланинлиазы приводит к появлению большого количества нежелательных фенотипов (Elkind и др., Abnormal Plant Development and Down-Regulation of Phenylpropanoid Biosynthesis in Transgenic Tobacco Containing a heterologous Phenytalanine Ammonia Liase Gene (Аномалии развития и замедление фенилпропаноидного биосинтеза в трансгенном табаке, содержащем гетерологический ген аммонийфенилаланинлиазы), Proc. Natf. Acad. Sci. USA, 87, стр.9057-9061, 1990). Фермент аммонийфенилаланинлиазы воздействует на первичный продукт обмена веществ фенилаланин, являющийся аминокислотой. Результаты этих экспериментов показывают, что изменение вторичных процессов обмена веществ путем модификации одного из первичных продуктов обмена веществ, участвующих в одном из вторичных механизмов обмена веществ, может привести к появлению непредсказуемых и нежелательных фенотипов. Следовательно, выбор биохимической стадии (стадий) в пределах одного из вторичных процессов обмена веществ имеет принципиальное значение для получения растений с нормальным набором фенотипов, но пониженным уровнем содержания одного из вторичных продуктов обмена веществ. Кроме того, использование антисенсибилизирующей РНК или ко-супрессии может оказаться недостаточным для того, чтобы обеспечить промышленно приемлемое снижение содержания одного из вторичных продуктов обмена веществ или приемлемую избирательность такого снижения по отношению к нужному продукту. Наконец, ингибирование генов, кодирующих основные функции ферментов, может оказать влияние и на степень экспрессии связанных с ними генов. Поэтому исследования, направленные на уменьшение содержания фенольных соединений, считающихся нежелательными с точки зрения питательных свойств, и на уменьшение содержания лигнина с помощью антисенсибилизирующей РНК или путем ко-супрессии без вредных побочных эффектов, не привели к сколько-нибудь заметному прогрессу в данной области.

Другим примером неудачной попытки изменить механизм обмена веществ стала модификация биосинтеза глюкозинолаты в рапсе (canola). Были опубликованы сведения о попытках изменить содержание глюкозинолаты в продуктах, приготовленных из рапса, путем управления механизмом биосинтеза глюкозинолаты. Одним из предложенных способов модификации биосинтеза глюкозинолаты было создание нового дополнительного биомеханизма, также потребляющего серу, участвующую в образовании глюкозинолат, или снижение уровня триптофана, участвующего в образовании глюкозинолат, путем его трансформации в триптамин (Engineering Altered Glucosinolate Biosynthesis by Two Alternative Strategies (Две альтернативные стратегии биосинтеза искусственно модифицированной глюкозинолаты), авт. Ibrahim, Chavadej, De Luca, в сб. Genetic Engineering of Plant Secondary Metabolism (Генетическая модификация вторичных процессов обмена веществ в растениях), 1994, Plenum Publishing Corporation, New York, USA).

Однако указанный способ оказался малоэффективным для уменьшения содержания глюкозинолаты в продуктах из семян рапса. Следовательно, этот способ непригоден для уменьшения негативного влияния глюкозинолат на питательные свойства рапса. Глюкозинолаты образуются в листьях растений и затем переходят в семена. Соответственно вышеуказанный метод был основан на предположении о том, что простым уменьшением доступного количества одного из первичных продуктов обмена веществ (серы и аминокислоты триптофана), участвующих в образовании глюкозинолат, можно уменьшить количество образующихся глюкозинолат. Однако первичные глюкозинолаты в семенах растений представляют собой алифатические глюкозинолаты, которые не используют аминокислоту триптофан для образования побочных цепочек. Кроме того, результаты этих экспериментов (например, Chavadej и др., Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 91, стр.2166-2170, 1994) показали, что трансгенные растения, содержащие фермент, который может изменить содержание первичной аминокислоты триптофана, не содержали восстановленных глюкозинолат в семенах, а содержание алифатических глюкозинолат в их семенах соответствовало или даже превышало уровень глюкозинолат в нетрансгенных растениях. По этой причине общий объем глюкозинолат, образовывавшихся в семенах растений, не уменьшался даже несмотря на то, что восстанавливалась даже второстепенная компонента (индоловые глюкозинолаты). Генетические исследования показали, что растения с пониженным уровнем глюкозинолат можно выводить обычными методами селекции и что существует большое количество локусов, ответственных за низкое содержание глюкозинолат в крестоцветных. Биосинтез глюкозинолаты включает в себя большое количество биохимических превращений, и для создания способа снижения общего количества глюкозинолат необходимо влиять на те стадии этого процесса, которые являются общими для всех или большинства механизмов образования глюкозинолат. Следовательно, общий метод подавления образования глюкозинолат в крестоцветных должен учитывать возможное присутствие разных ферментов и субстратов, участвующих в биосинтезе глюкозинолат.

Оказалось, однако, что ферменты, использующиеся для достижения такой модификации биохимического процесса, также оказывали влияние на первичные продукты обмена веществ (аминокислоту триптофан и минерал серу), вследствие чего любое заметное изменение содержания этих соединений в клетке растения могло привести к отрицательному эффекту. Соответственно предложенный метод оказался неспособен оказывать выборочное воздействие на процесс вторичного обмена веществ. Естественно, изменение содержания триптофана вполне ожидаемо приведет к большому числу нежелательных эффектов. Таким образом, модификация процесса на уровне первичных продуктов обмена веществ не привела к желаемому эффекту снижения уровня глюкозинолаты в рапсе, что лишний раз подтверждает сложность модификации первичных процессов обмена веществ.

Таким образом, для изменения биохимического состава растительных тканей будет необходим общий метод изменения вторичных процессов обмена веществ. Такое изменение может включать в себя, например, снижение содержания соединений, нежелательных с точки зрения питательных свойств, изменение профиля вторичных продуктов обмена веществ, изменение технологических качеств растительных тканей, изменение уровня содержания соединений, представляющих интерес для промышленности или фармацевтики, выведение растений с измененными вкусовыми качествами, структурой тканей или внешним видом, получение растений с измененным составом вторичных продуктов обмена веществ, ответственных за привлечение насекомых, устойчивость растения к болезням или иные биологические процессы, зависящие от вторичных продуктов обмена веществ, или получение растений, показатели роста которых выгодно отличаются от соответствующих показателей обычных растений благодаря измененному составу вторичных продуктов обмена веществ.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение представляет собой способ оказания воздействия на образование вторичных продуктов обмена веществ. Данный способ включает в себя изменение доступного количества субстрата, который необходим для реализации определенного механизма вторичного обмена веществ и для образования конечного продукта обмена веществ, в частности соединений, образующихся за 1-5 стадий биохимической реакции до образования конечного продукта. Оказание воздействия на субстраты за несколько стадий до образования конечного продукта реакции позволяет избежать проблем, связанных с модификацией продуктов обмена веществ, которые участвуют также и в первичных процессах обмена веществ, поскольку данное воздействие имеет место уже после вступления субстрата в первичный процесс обмена веществ. Таким образом, данный способ представляет собой новое средство для целенаправленного уменьшения или изменения состава вторичных продуктов обмена веществ за счет идентификации тех продуктов предыдущих реакций, принимающих участие во вторичных процессах обмена веществ, которые не служат субстратами для первичных процессов обмена веществ.

Данный способ также может включать в себя изменение доступного количества субстрата в зависимости от конкретной растительной ткани, например, для того, чтобы изменить содержание определенного вещества только в семенах.

Таким образом, данный способ представляет собой новое средство для целенаправленного уменьшения или изменения состава вторичных продуктов обмена веществ за счет идентификации тех продуктов предыдущих реакций, принимающих участие во вторичных процессах обмена веществ, которые не служат субстратами для первичных процессов обмена веществ.

Один из вариантов осуществления изобретения представляет собой метод выведения генетически модифицированных растений, включающий в себя:

А) введение в клетку растения, пригодную для модификации и последующей регенерации, кассеты с последовательностью ДНК, которая содержит, помимо последовательности ДНК, необходимой для осуществления модификации и селекции в клетках растений, такую последовательность ДНК, которая осуществляет под контролем промотора, находящегося в растительных клетках, кодировку белка, способного модифицировать использование субстрата во вторичных процессах обмена веществ, причем данный субстрат не является первичным продуктом обмена веществ из группы, включающей в себя глюкозу, аминокислоты, жирные кислоты и нуклеотиды;

Б) регенерацию растения с измененным уровнем содержания, по крайней мере, одного из вторичных продуктов обмена веществ.

Другой вариант осуществления изобретения представляет собой способ выведения генетически модифицированных семян растений, включающий в себя выращивание растений, полученных в результате стадий А и Б вышеописанного способа, в условиях, благоприятных для развития семян.

Рекомбинантная ДНК вводится на хромосомном уровне в геном продуктивного растения таким образом, чтобы она могла передаваться последующим поколениям.

Дополнительные варианты осуществления изобретения представляют собой векторы, которые могут быть использованы для модификации растений, растения и семена, модифицированные в соответствии с вышеописанным способом, а также пищевые продукты на основе зерновых культур или производных продуктов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1: Схематическое представление общей схемы способа изменения произвольного механизма вторичного обмена веществ.

Фиг.2: Схематическое представление общего фенилпропаноидного механизма обмена веществ и образования синапина.

Фиг.3: Начало и развитие синтеза синапина в развивающихся семенах. Тонкослойная хроматофафия семян рапса (Brassica napus сорт Westar).

Фиг.4: Количественный анализ накопления синапина в развивающихся семенах методом жидкостной хроматографии высокого давления.

Фиг.5: Определение способности развивающихся семян синтезировать синапин путем введения радиоактивного холина через плодоножки удаленных стручков с введением радиоактивных индикаторов в синапин спустя от 7 до 43 дней после опыления.

Фиг.6: Определение способности развивающихся семян синтезировать синапин и инфильтрация изолированных семян с помощью радиоактивного раствора холина с введением радиоактивных индикаторов в синапин спустя от 43 до 64 дней после опыления.

Фиг.7: Накопление синтезированного синапина в семядоле, стержнях завязи и оболочки семени растущих семян в процентах от общего количества меченого синапина в семени.

Фиг.8: Содержание синапина в семядоле и стержнях завязи развивающихся семян в пересчете на единицу массы образца ткани.

Фиг.9: Определение содержания синапина в семядоле и стержнях завязи развивающихся семян в расчете на одно семя, т.е. либо стержень, либо пару семядолей.

Фиг.10А и 10Б: Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания оксидазы холина (SEQ. №3).

Фиг.11: Выведенная последовательность аминокислот открытой рамки считывания оксидазы холина (SEQ. №4).

Фиг.12: Диаграмма вектора трансформации растения pHS 731, содержащего ген СОХ, подконтрольный тканеизбирательному промотору.

Фиг.13: Снижение содержания синапина в семенах рапса (Brassica sp.) путем повышения степени экспрессии гена СОХ.

Фиг.14: Диаграмма вектора трансформации растения pHS 981, содержащего ген BADH, подконтрольный тканеизбирательному промотору.

Фиг.15: Снижение содержания синапина в семенах Brassica sp. путем повышения степени экспрессии гена BADH.

Фиг.16: Изменение содержания фенолов в семенах Brassica sp. путем повышения степени экспрессии генов СОХ и BADH.

Фиг.17: Нуклеотидная последовательность гена декарбоксилазы феруловой кислоты синтетического В. pumulis, оптимизированного для экспрессии в растительных клетках (SEQ. №1).

Фиг.18: Выведенная последовательность аминокислот белка, закодированного открытой рамкой считывания декарбоксилазы феруловой кислоты синтетического В. pumulis (SEQ. №2).

Фиг.19: Рестрикционная карта вектора трансформации растения, содержащего ген декарбоксилазы феруловой кислоты, подконтрольный нерегулируемому промотору 35S.

Фиг.20: Рестрикционная карта вектора трансформации растения, содержащего ген декарбоксилазы феруловой кислоты, подконтрольный промотору напину селективному по отношению к семенам.

Фиг.21: Накопление фитиновой кислоты в процессе развития семян.

Фиг.22: Различия в накоплении фитиновой кислоты в различных тканях развивающихся семян.

Фиг.23: Процентное содержание усвоенного меченого мио-инозита во фракциях фитиновой кислоты, липидов, стенок клетки, растворимых в TFA, и отходов деления клеток.

Фиг.24: Последовательность амплифицированного фрагмента ДНК гена мио-инозит-оксиметилтрансферазы (SEQ. №5).

Фиг.25: Рестрикционная карта вектора pSIMTБ, содержащего кассету терминатора промотор 35S - IMT - GUS - Nos в pRD400 5.

Фиг.26: Рестрикционная карта вектора pNIMT, содержащего кассету терминатора промотор 35S - IMT - GUS - Nos в pRD400.

Фиг.27: PCR-анализ трансгенных растений, содержащих ген IMT.

Фиг.28: Northern blot-анализ растений с выраженным геном IMT.

Фиг.29: Гистограмма снижения содержания фитиновой кислоты в трансгенных растениях.

Фиг.30: Таблица, иллюстрирующая снижение содержания фитиновой кислоты в растениях F1, F2 и F3, выращенных в полевых условиях и содержащих вектор pSIMT.

Фиг.31: Таблица, иллюстрирующая снижение содержания фитиновой кислоты в растениях F1 и F2, выращенных в полевых условиях и содержащих вектор pNIMT.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на избирательном снижении или изменении содержания предшественников вторичных продуктов обмена веществ и отличным от первичных продуктов обмена веществ. Указанным образом можно избежать возможного негативного влияния изменения первичных процессов обмена веществ при получении равноценного результата. Таким образом, настоящее изобретение позволяет избежать управления образованием соединений, которые могут относиться к первичным продуктам обмена веществ.

В предпочтительном варианте использования настоящего изобретения доступное количество субстрата изменяется с помощью фермента, например, являющегося гетерологическим по отношению к указанной растительной клетке и способного оказывать воздействие на указанный субстрат, а также удаляющего нужный субстрат из доступного набора субстратов или изменяющего доступное количество данного субстрата в данном наборе. Обобщенное представление о способе в соответствии с настоящим изобретением и соотношении между первичными и вторичными процессами обмена веществ проиллюстрировано на Фиг.1. Использование гетерологического фермента для изменения потока продуктов реакций в процессе вторичного обмена веществ приводит к изменению нужного продукта вторичного обмена веществ. При этом уровень содержания конечных продуктов, получаемых в результате некоторых стадий ферментной реакции в процессе вторичного обмена веществ, понижается, в то время как на других стадиях процесса продукт накапливается в значительных количествах, что ингибирует ферменты, ответственные за образование данного продукта. Такое ингибирование по принципу обратной связи, в свою очередь, влияет на образование конечного продукта всего вторичного процесса обмена веществ. Таким образом, изменение уровней содержания продуктов отдельных вторичных процессов обмена веществ и связанных с ними процессов достигается за счет введения новых ферментов, которые изменяют величину потока биохимических веществ (например, субстратов и продуктов реакций) в процессе реакции. Повышение степени экспрессии гетерологических ферментов в растительных тканях привело к метаболической трансформации предшественников процессов обмена веществ в вещества, которые накапливаются в растительных клетках, не вызывая нежелательных эффектов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в результате образуются ценные продукты или вещества, оказывающие благоприятное воздействие на растительную клетку.

В одном из вариантов осуществления изобретения нужный предшественник впоследствии модифицируется путем добавления нового фермента. В предпочтительном аспекте изобретения предполагается выбор фермента, активность которого гетерологична растительной клетке, в которой он проявляется. Например, таким ферментом может быть фермент, который в обычных условиях связан с вторичным процессом обмена веществ в тканевых растительных клетках. Используемый фермент может быть растительного, животного или же бактериального происхождения и модифицирован для достижения нужной степени экспрессии в растительной клетке. Выбранный гетерологический фермент может быть использован для модификации предшественника с целью изменения его количества, доступного для образования вторичного продукта обмена веществ. Использование фермента, являющегося гетерологическим по отношению к клетке, в которой он проявляется, позволяет избежать влияния биохимических регулирующих факторов и модифицировать вторичные процессы обмена веществ предсказуемым образом. Особый интерес в настоящем изобретении представляет модификация продуктов вторичного процесса обмена веществ, относящегося к сахарным спиртам, а также фенилпропаноидного вторичного процесса обмена веществ.

Дополнительным примером использования способа в соответствии с настоящим изобретением является изменение уровней содержания модифицированных сахаров, таких как глюкоза и нежелательные с точки зрения питательных свойств сукрозилглюкозиды (например, стахиоза и рафиноза). Галактоза переводится в галактинол, являющийся одним из предшественников вышеуказанных глюкозидов сукрозила, нежелательных с точки зрения питательных свойств. Такая промежуточная форма галактозы представляет собой конъюгированную модификацию UDP-галактозы. В методе в соответствии с настоящим изобретением образование и накопление UDP-галактозы (и ее последующее превращение в галактинол) предотвращаются с помощью фермента, являющегося гетерологическим по отношению к растительным клеткам, который может быть использован для изменения уровня содержания UDP-галактозы. Фермент UDP-галактоза-4-эпимераза (gaLE) участвует в одном из основных стадий галактозного обмена веществ в живых системах. Он является катализатором превращения UDP-галактозы в UDP-глюкозу. Ген данного фермента может быть получен из организма человека, дрожжей или бактерий. В настоящем изобретении предполагается использование бактериальной кодировки фермента.

В результате экспрессии данного гетерологического фермента в растительной клетке доступное для реакции количество UDP-галактозы снижается, и образуется полезное соединение - UDP-глюкоза. Авторы изобретения полностью уверены в том, что экспрессия фермента UDP-галактоза-4-эпимераза приведет к уменьшению количества биологически синтезируемого галактинола, который является одним из предшественников гликозидов сукрозы, нежелательных с точки зрения питательных свойств. В дополнение к снижению скорости накопления нежелательных гликозидов сукрозы действие нововведенного фермента приведет к увеличению доступного для реакции количества UDP-глюкозы с последующим образованием сукрозы. Предполагается, что сукроза будет участвовать и усиливать интенсивность других процессов обмена веществ, в которых она необходима либо как источник углерода для увеличения производительности растений (например, содержания белков, липидов, повышенной урожайности и т.п.), либо сама по себе.

В рамках настоящего изобретения могут быть реализованы и другие варианты использования данного способа. В частности, с его помощью можно изменять уровни содержания различных производных сахаров, таких как глюкоза-1-фосфат и глюкоза-6-фосфат, используя фермент фосфоглюкомутазу (pgm). Этот фермент является катализатором взаимопревращения глюкоза-1-фосфата и глюкоза-6-фосфата (G-1-P и G-6-P) в процессе биосинтеза и потребления сукрозы. Этот фермент играет основную роль в биосинтезе и потреблении сукрозы, крахмала и гликогена и присутствует во всех организмах. Ген этого фермента может быть получен из различных эукариотических и бактериальных источников (например, Agrobacterium).

G-6-P является основным исходным материалом для множества взаимопревращений между сахарами, в результате одного из которых образуется мио-инозит-1-Р, который является основным субстратом и одним из факторов образования соответственно фитиновой кислоты и нежелательных для питания сукрозилгликозидов. Экспрессия данного фермента, как ожидается, снизит уровень содержания G-6-P и, соответственно, уменьшит вышеуказанное негативное влияние на питательные свойства. Таким образом, в рамках настоящего изобретения могут быть осуществлены разнообразные модификации процессов обмена веществ.

Способ в соответствии с настоящим изобретением не ограничивается каким-либо конкретным вторичным процессом обмена веществ или каким-либо конкретным растением. Данный способ может быть использован для модификации вторичных процессов обмена веществ, которые являются общими для многих ценных культурных растений, в том числе однодольных и двудольных, но также может быть применен и к отдельному вторичному продукту обмена веществ, который важен только для одного конкретного вида.

Биохимической основой для способа в соответствии с настоящим изобретением является концепция регулирования активности фермента за счет манипуляции доступным количеством необходимого субстрата. В общем случае скорости ферментных реакций зависят от доступного количества субстрата. Иными словами, скорость образования продукта на основе фермента пропорциональна доступному количеству субстрата. Уменьшение концентрации субстрата приводит к снижению количества образующегося продукта. Кроме того, многие ферменты ингибируются конечным продуктом реакции, в результате чего избыток конечного продукта приводит к торможению ферментной реакции. Следовательно, изменение количества доступного субстрата или продукта ферментной реакции может быть использовано для регулирования общего количества вещества, образующегося в результате биохимической реакции.

Примерами вторичных процессов обмена веществ, которые могут быть изменены с использованием настоящего изобретения, являются изопреноидный биосинтез, алкалоидный биосинтез, терпеноидный биосинтез, фенольный биосинтез, сахарно-спиртовой биосинтез и прочие вторичные процессы обмена веществ, в результате которых образуются нежелательные для питания или промышленно ценные вещества. К вторичным продуктам обмена веществ, содержание которых может быть изменено с помощью настоящего изобретения, относятся нежелательные с точки зрения питательных свойств фенольные соединения, такие как синапин или глюкозинолаты в крестоцветных, продукты сахарного спирта, например фитиновая кислота или стахиоза и рафиноза, госсипол в хлопке, никотин, хлорогеновая кислота, конденсированные танины или иные нежелательные вторичные продукты обмена веществ. Хлорогеновая кислота присутствует в сое, хлопке, подсолнечнике и является производной от кофеиновой кислоты, которая образуется в фенилпропаноидном процессе обмена веществ. К другим соединениям, нежелательным для питательных свойств растений, относятся сапонины, которые присутствуют во многих растениях, включая люцерну. Сапонины представляют собой высокомолекулярные гликозиды, состоящие из сахарной компоненты, связанной с тритерпеном или стероидным агликоном. Известно, по крайней мере, три класса сапонинов, а именно гликозиды тритерпена, стероидные гликозиды и стероидные алкалоидные гликозиды. Одним из исходных материалов для биосинтеза сапонинов в растениях является сквален. Другие важные классы вторичных продуктов обмена веществ, таких как фитостерины, карденолиды, кукурбитацины, квассиноиды и лимониды, также являются производными сквалена. Избыток сапонинов в рационе питания животных связан с эффектом, известным как бомбаж.

Настоящее изобретение иллюстрируется на примере использования данного способа во многих не связанных вторичных процессах обмена веществ. Однако, поскольку для специалистов будет очевидна возможность использования данного способа для модификации любого конкретного вторичного процесса обмена веществ, ниже представлен только общий способ осуществления настоящего изобретения.

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения представляет собой способы и композиции ДНК, служащие для изменения содержания синапина и связанных с ним фенольных соединений в растениях. Другой вариант осуществления настоящего