Способ получения рибофлавина, штамм bacillus subtilis - продуцент рибофлавина (варианты)

Способ получения рибофлавина, штамм bacillus subtilis - продуцент рибофлавина (варианты)

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится микробиологической промышленности, в частности, к способу получения рибофлавина. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения рибофлавина с использованием бактерий, принадлежащих к роду Bacillus.

Уровень техники

Рибофлавин (витамин В₂) является существенно важным соединением для высших животных, включая человека. Недостаток рибофлавина приводит к различным типам заболеваний, таким как облысение, воспаление кожных покровов и другие их повреждения, конъюнктивит, ухудшение зрения, задержка в росте и прочие.

Поэтому рибофлавин используют для приготовления коммерческих витаминных препаратов, используемых при дефиците витаминов, а также в качестве пищевой добавки. Кроме того, рибофлавин используют в качестве пищевого красителя, например, в майонезах, мороженом и других продуктах.

Рибофлавин получают как химическими, так и микробиологическими методами. В химических методах рибофлавин обычно получают как конечный продукт сложного многостадийного процесса, в котором используют достаточно дорогой исходный компонент, такой как D-рибоза.

Описано получение рибофлавина методом ферментации грибов, таких как Ashbya gossypii или Eremothecium ashbyii (The Merck Index, Windholz et al., eds. Merck & Co., page 1183, 1983). Также для продукции рибофлавина подходят дрожжи, такие как Candida или Saccharomyces (WO 93/03183, JP63098399A2, US Pat. 4,794,081). Кроме того, описаны грибы из рода Ashbya с увеличенной активностью изоцитратлиазы (ICL), обладающие способностью к продукции и накоплению рибофлавина (US Pat. 5,976,844).

Описаны мутанты Bacillus subtilis, полученные селекцией на аналогах пуринов, азагуанине и азаксантине, продуцирующие существенные количества рибофлавина (U.S. Pat. №3,900,368). В общем, обработка аналогами пуринов и рибофлавина позволяет получить мутанты с повышенным синтезом рибофлавина, так как эти мутации позволяют микроорганизму путем повышенной продукции рибофлавина вытеснять аналоги за счет конкурентного механизма (Matsui et al., Agric. Biol. Chem. 46:2003, 1982).

Было показано, что мутантные штаммы Bacillus subtilis, обладающие активностью по высвобождению фосфорной кислоты из 5'-гуаниловой кислоты не выше, чем 0.081 мкмоль/мин/(мг белка), способны к продукции рибофлавина (ЕР 0531708 В1).

Мутантные штаммы Bacillus subtilis, селектированные по устойчивости к розеофлавину и 8-азагуанину и содержащие мутацию в гене ribC, производят рибофлавин (патент СССР 908092). Такими штаммами являются штаммы Bacillus subtilis ВНИИГенетика-304 и 304а. Далее был получен штамм Bacillus subtilis 304/pMX45, содержащий плазмиду с rib опероном из Bacillus subtilis, обладающий повышенной способностью к продукции рибофлавина (до 3.5 г/л) (патент Франции 2546907).

Описан штамм Bacillus subtilis 62/pMX30ribO186, продуцирующий до 12.5 г/л рибофлавина в течение 42 часов ферментации (патент РФ 2081906). Штамм Bacillus subtilis 62/pMX30ribO186 был получен из штамма Bacillus subtilis RK6121 как мутант, устойчивый к 8-азагуанину, метионинсульфоксиду, диацетилу и псикофуранину и дополнительно содержащий плазмиду с мутантным (мутация в гене ribO) rib опероном из Bacillus subtilis.

Штаммы бактерий, полученные введением генов биосинтеза рибофлавина из Bacillus sublilis в хромосому этой бактерии, также продуцируют рибофлавин (US Pat. 5,837,528, 5,925,538 и 6,322,995). Наилучшим среди известных штаммов является штамм RB50::[pRF69]₆₀(Ade⁺), несущий транскрипционно модифицированный рибофлавиновый оперон, содержащий два промотора SPO1-15, продуцировал 13.0-14.0 г/л рибофлавина в течение 48 часов и 15 г/л рибофлавина в течение 56 часов (US Pat. 5,925,538) при выращивании на стандартных коммерческих средах и в стандартных коммерческих условиях.

Хотя продукция рибофлавина была существенно улучшена путем выведения вышеуказанных микроорганизмов или улучшения процесса его получения, необходимо разрабатывать более эффективные процессы получения рибофлавина для того, чтобы удовлетворить растущие потребности в этом витамине.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности рибофлавина штаммами - продуцентами рибофлавина и предоставление способа получения рибофлавина с использованием таких штаммов.

Для увеличения продукции рибофлавина авторы настоящего изобретения сконструировали штамм, содержащий дерегулированный rib оперон из Bacillus amyloliquefaciens. Затем был получен мутантный штамм, обладающий способностью к утилизации глицерофосфата и устойчивый к ингибированию роста глиоксилатом.

Так было совершено настоящее изобретение.

Настоящее изобретение предоставляет бактерию, принадлежащую к роду Bacillus и обладающую способностью к продукции рибофлавина. В частности, настоящее изобретение предоставляет бактерию с повышенной способностью к продукции рибофлавина, обусловленной присутствием дерегулированного rib оперона из Bacillus amyloliquefaciens, способностью к утилизации глицерофосфата и/или мутацией, придающей устойчивость к глиоксилату.

Также настоящее изобретение предоставляет способ получения рибофлавина методом ферментации, включающий стадии выращивания вышеуказанной бактерии в питательной среде и выделения рибофлавина из культуральной жидкости.

Настоящее изобретение представляет собой следующее:

1. Бактерия Bacillus subtilis, обладающая способностью к продукции рибофлавина, содержащая гетерологичный rib оперон в хромосоме указанной бактерии, в которой указанным rib опероном является rib оперон из Bacillus amyloliquefaciens.

2. Бактерия Bacillus subtilis в соответствии с 1, в которой указанный rib оперон из Bacillus amyloliquefaciens дерегулирован.

3. Бактерия Bacillus subtilis. обладающая способностью к продукции рибофлавина и способностью к утилизации глицерофосфата.

4. Бактерия Bacillus subtilis, обладающая способностью к продукции рибофлавина и устойчивостью к ингибированию роста глиоксилатом.

5. Бактерия Bacillus subtilis, обладающая способностью к продукции рибофлавина и обладающая одной или несколькими из следующих характеристик:

- содержит rib оперон из Bacillus amyloliquefaciens в хромосоме этой бактерии;

- обладает способностью к утилизации глицерофосфата и

- обладает устойчивостью к ингибированию роста глиоксилатом.

6. Способ получения рибофлавина, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с 1-5 в питательной среде и выделения рибофлавина из культуральной жидкости.

Более детально настоящее изобретение будет описано ниже.

(1) Бактерия согласно настоящему изобретению.

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия Bacillus sublilis, обладающая способностью к продукции рибофлавина, в которой продукция рибофлавина увеличена путем введения в хромосому бактерии гетерологичного rib оперона из Bacillus amyloliquefaciens.

Использованный здесь термин «бактерия, обладающая способностью к продукции рибофлавина» означает бактерию, способную к продукции и накоплению в питательной среде рибофлавина в количестве большем, чем природный или родительский штамм В.subtilis, такой как штамм В.subtilis 168, и, предпочтительно, означает, что указанный микроорганизм способен к продукции и накоплению в питательной среде не менее 0.5 г/л, более предпочтительно не менее чем 1.0 г/л рибофлавина.

Термин «бактерия Bacillus subtilis» означает бактерию, которую относят к виду Bacillus subtilis в соответствии с классификацией, известной для специалиста в области микробиологии. А термин «бактерия Bacillus amyloliquefaciens» означает бактерию, которую относят к виду Bacillus amyloliquefaciens в соответствии с классификацией, известной для специалиста в области микробиологии.

Термин «rib оперон» означает фрагмент хромосомы, содержащий гены, кодирующие белки, существенные для продукции рибофлавина, rib оперон в бактериях, принадлежащих к роду Bacillus, содержит следующие гены: ген ribO, кодирующий регуляторный элемент, ген ribG, кодирующий деаминаза/редуктазу, ген ribB, кодирующий рибофлавинсинтазу (α-субъединицу), ген ribA, кодирующий ГТФ-циклогидролазу/3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтазу, ген ribH, кодирующий лимазинсинтетазу, и ген ribT, кодирующий белок с неизвестной функцией (Морозов и др., Мол. Генет. Мик. Вирусол., 7:42, 1948). Нуклеотидные последовательности генов ribG, ribB, ribA, ribH и ribH из Bacillus subtilis представлены в базе данных GenBank под номерами gi:16079385, gi:16079384, gi:16079383, gi:16079382 и gi:16079381, соответственно (нуклеотиды с 2429492 по 2430577, с 2428834 по 2429481, с 2427623 по 2428819, с 2427126 по 2427590 и с 2426639 по 2427013 в последовательности NC_000964.1).

Термин «гетерологичный оперон», использованный здесь, означает, что указанный оперон был выделен из хромосомы организма, отличного от Bacillus sublilis. Бактерия, содержащая гетерологичный оперон в хромосоме, может быть получена стандартными методами рекомбпнантных ДНК, трансформацией, трансфекцией.

Термин «дерегулирован» означает, что уровень продукции рибофлавина выше, чем уровень продукции, наблюдаемый у бактерии с природной регуляторной системой синтеза рибофлавина (а именно, природной бактерией). Примерами бактерий, обладающими дерегулированным rib опероном, являются бактерии, устойчивые к различными аналогам пуринов и их антагонистам, или аналогам рибофлавина.

Дерегуляция регуляторной системы синтеза рибофлавина может быть осуществлена путем изменения регуляторного участка оперона, замены указанного регуляторного участка другим сильным участком с конститутивным уровнем экспрессии, инактивации гена, кодирующего репрессор, получением мутаций в белке - репрессоре и т.д. Указанная дерегуляция может быть осуществлена традиционными методами, такими как мутагенная обработка с использованием УФ излучения или обработкой нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-направленным мутагенезом, разрушением гена с использованием гомологичной рекомбинации и/или инсерционно-делеционным мутагенезом.

Термин «способность к утилизации глицерофосфата» означает способность метаболизировать глицерофосфат более эффективно, чем родительский штамм, например, способность штамма В.subtilis, используемого в настоящем изобретении, расти быстрее, чем родительский штамм, в случае, когда указанные штаммы выращиваются на среде, содержащей глицерофосфат в качестве единственного источника углерода. Более конкретно это означает, что штамм В.sublilis обладает способностью к утилизации глицерофосфата, если этот штамм растет быстрее, чем родительский штамм, в случае, когда указанные штаммы выращиваются в подходящих условиях на среде, содержащей глицерофосфат в качестве единственного источника углерода, например, в жидкой среде, содержащей 0.1% глицерофосфата. Более конкретно, можно говорить о том, что штамм В. subtilis обладает способностью к утилизации глицерофосфата, если этот штамм образует колонии в течение 2 дней при 37°С при выращивании этого штамма на агаризованной среде, содержащей глицерофосфат в качестве единственного источника углерода, например, на среде, содержащей 0.1% глицерофосфата и агар, в подходящих условиях. Термин «подходящие условия» относится к температуре, рН, доступу воздуха или необязательному присутствию необходимых питательных веществ и прочим условиям, необходимым для выращивания штамма В.subtilis.

Известно, что ферменты гликонеогенеза обладают уровнем активности, недостаточным для повторной утилизации продуктов гликолиза, таких как глицерофосфаты. Также известно, что штаммы В.subtilis растут очень плохо на средах, содержащих глицерофосфат в качестве единственного источника углерода. Исходя из этого было высказано предположение, что выделение мутантов, способных расти на среде, содержащей глицерофосфат в качестве единственного источника углерода, позволит получить мутанты с повышенным уровнем активности ферментов, вовлеченных в гликонеогенез, и, вследствие этого, повысить продукцию рибофлавина в ходе процесса ферментации на сахарозе.

Термин «бактерия обладает устойчивостью к ингибированию роста глиоксилатом» означает бактерию, полученную из родительского штамма путем модификации генетических свойств таким образом, что штамм становится способен к росту на питательной среде, содержащей глиоксилат. Конкретно, устойчивость к глиоксилату означает способность бактерии к росту на минимальной среде, содержащей глиоксилат в концентрации, при которой родительский штамм указанной бактерии не может расти, или способность бактерии расти быстрее на питательной среде, содержащей глиоксилат, чем природный или родительский штамм указанной бактерии. Например, бактерия, которая способна образовывать колонии при выращивании в течение 3-5 дней при 34°С на чашках с агаризованной средой, содержащей 0.5 мг/мл или более, предпочтительно 1.0 мг/мл или более глиоксилата, является устойчивой к глиоксилату.

Глиоксилат является очень важным промежуточным соединением глиоксилатного шунта, необходимого для роста на таких источниках углерода, как ацетат или жирные кислоты, поскольку указанный путь позволяет впрямую конвертировать ацетил-СоА в промежуточные продукты метаболизма. Указанный путь включает три фермента. Два из них, изоцитратлиаза и малатсинтаза А, превращают некоторые интермедиаты цикла трикарбоновых кислот из изоцитрата в малат. Было показано, что, в отличие от Е.coli, активности ферментов глиоксилатного шунта в В.subtilis очень низкие. Кроме того, глиоксилат ингибирует рост природных клеток В.subtilis в концентрации 1 мг/мл. Для увеличения активности ферментов глиоксилатного шунта было решено получить мутанты, устойчивые к глиоксилату.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена из бактерии, уже обладающей способностью к продукции рибофлавина, путем придания ей устойчивости и/или способности к утилизации глицерофосфата. Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания способности к продукции рибофлавина бактерии, уже обладающей специфической устойчивостью и/или способностью к утилизации глицерофосфата.

Таким образом, любой известный штамм бактерии, принадлежащей к роду Bacillus, обладающей способностью к продукции рибофлавина, можно подвергнуть одной или нескольким вышеописанным мутагенным обработкам, а затем проверить полученные мутантные штаммы на соответствие вышеописанным требованиям настоящего изобретения, включающим утилизацию глицерофосфата и устойчивость к глиоксилату, и, следовательно, подходящим для использования в настоящем изобретении. Полученные штаммы проверяются путем выращивания в питательной среде, и штаммы, обладающие способностью к продукции рибофлавина с выходом большим, чем родительский штамм, отбираются и используются в настоящем изобретении.

В качестве родительских штаммов, которые могут быть улучшены с целью получения бактерии согласно настоящему изобретению, могут быть использованы штаммы бактерий, принадлежащих к роду Bacillus, - продуценты рибофлавина, такие как штаммы Bacillus subtilis ВНИИГенетика-304 и 304а (патент СССР 908092), штамм Bacillus subtilis 304/рМХ45 (ЦМПМ В-2694) (патент Франции 2546907), штамм Bacillus subtilis 62/pMX30riO186 (ВКПМ В-6797) (патент РФ 2081906), штамм Bacillus subtilis RB50::[pRF69]₆₀(Ade⁺) (патент США 5,925,538), штамм Bacillus subtilis FERM BP-3855 and FERM BP-3855 (Европейский патент ЕР 0531708В1) и подобные им.

(2) Способ получения рибофлавина

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения рибофлавина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде и выделения рибофлавина из культуральной жидкости.

В способе согласно настоящему изобретению выращивание бактерии, принадлежащей к роду Bacillus, выделение и очистка рибофлавина из культуральной жидкости могут быть осуществлены способом, подобным традиционным способам получения рибофлавина методом ферментации с использованием бактерии.

Питательная среда для продукции рибофлавина может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что она содержит источники углерода, азота, неорганические ионы и другие необходимые органические компоненты. В качестве источника углерода могут быть использованы сахариды, такие как глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза, арабиноза, мальтоза, ксилоза, трехалоза и гидролизат крахмала; спирты, такие как глицерин, маннитол и сорбитол; органические кислоты, такие как глюконовая, фумаровая, лимонная и янтарная кислоты, и подобные соединения. В качестве источника азота могут быть использованы неорганические соли азота, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония; органические соединения азота, такие как гидролизат соевых бобов; газообразный аммиак; водный раствор аммиака и подобные соединения. Желательно, чтобы витамины, такие как витамин B₁, другие необходимые соединения, например, нуклеиновые кислоты, такие как аденин и РНК, или дрожжевой экстракт и подобные соединения присутствовали в подходящих количествах в качестве органических питательных добавок. Кроме того, небольшие количества фосфата кальция, сульфата магния, ионов железа, марганца и подобных соединений могут быть добавлены, если это необходимо.

Выращивание осуществляют предпочтительно в аэробных условиях от 16 до 72 часов, и температуру в ходе выращивания поддерживают в пределах от 30 до 45°С, рН - в пределах от 5 до 8. рН поддерживают, используя неорганические и органические кислые и основные соединения, а также газообразный аммиак.

Рибофлавин может быть выделен из культуральной жидкости любым или комбинацией любых известных методов, таких как методики с использованием ионообменной хроматографии и осаждение,

Наилучший способ осуществления изобретения

Пример 1. Конструирование штамма Bacillus subtilis, содержащего рибофлавиновый оперон из Bacillus amyloliquefaciens в хромосоме.

Известно, что прямая гомологическая рекомбинация rib оперона из В.amyloliquefaciens в хромосому В.subtilis не приводит к успеху.

Чтобы клонировать гены биосинтеза рибофлавина, хромосомная ДНК штамма В.amyloliquefaciens A50 была обработана рестриктазой HindIII. Полученная смесь фрагментов ДНК была лигирована в вектор pACYC184 (NBL Gene Sciences Ltd., UK, GenBank/EMBL accession number X06403), предварительно обработанный этой же рестриктазой. Полученный продукт был использован для трансформации штамма Е.coli BSV821. Были отобраны трансформанты, способные к росту на питательной среде, содержащей хлорамфеникол. Из таких трансформантов была выделена плазмида и фрагмент, содержащий rib оперон, был переклонирован в вектор рСВ20. Полученную плазмиду назвали рВХ2. Плазмида рВХ2 комплементировала мутации во всех генах rib оперона, за исключением генов ribTD.

Для выведения мутантов с конститутивной экспрессией генов биосинтеза рибофлавина плазмида рВХ2 была обработана гидроксиламином в ходе стандартной процедуры мутагенеза. Лабораторный ауксотрофный штамм В.subtilis ribG850 был трансформирован мутантной ДНК плазмидой и была оценена способность полученных трансформантов производить рибофлавин. С помощью ПЦР было установлено, что продукция рибофлавина была обусловлена мутациями в гене ribO. Мутация ribO1 (замена Т на С в положении +87) была идентична известной мутации в опероне В.subtilis. Мутация ribO2 оказалась новой мутацией С на Т в положении +149. Плазмида, содержащая мутацию ribO2, была названа рВХ21. Штамм В.subtilis ribG850, трансформированный плазмидой рВХ21, производил до 65 мг/л рибофлавина при том, что тот же штамм, трансформированный плазмидой рВХ2, вообще не производил рибофлавин.

Бесплазмидный штамм Bacillus subtilis ВНИИГенетика-304 (патент СССР 908092) был использован в качестве родительского штамма для конструирования штамма Bacillus subtilis GM49, содержащего в хромосоме дерегулированный рибофлавиновый оперон из Bacillus amyloliquefaciens. Для интеграции дерегулированного рибофлавинового оперона из Bacillus amyloliquefaciens в хромосому штамма Bacillus subtilis 304 был сконструирован вектор для интеграции рЕК14 (Km^R, Ap^R, Rib⁺). Вектор рЕК14 состоит из E.coli плазмиды pUC19, гена канамицин нуклеотидилтрансферазы (kan) из плазмиды pUB110 и дерегулированного (мутация ribO2) рибофлавинового оперона Bacillus amyloliquefaciens из плазмиды рВХ21. Плазмида рЕК14 не способна к репликации в В.subtilis.

Для интеграции рЕК14 в хромосому был использован метод «случайной интеграции».

Сначала BamHI-фрагмент плазмиды рЕК14 был лигирован с BamHI-фрагментами хромосомной ДНК из штамма В.subtilis 168. Плазмида, содержащая участки, гомологичные геному В.subtilis, была способна к интеграции в хромосому посредством гомологичной рекомбинации. Затем, полученная после лигирования смесь фрагментов была использована для трансформации лабораторного ауксотрофного штамма В.subtilis rib G850. Были отобраны трансформанты с фенотипом Km^R, Rib⁺. Частота трансформации была около 100 на 1 γ ДНК. Было проанализировано 60 клонов с фенотипом Km^R, Rib⁺.Большинство интегрантов было нестабильными или ауксотрофными. Они теряли маркеры Km^R и Rib⁺ в процессе роста в питательной среде без антибиотиков. Был найден один стабильный интегративный клон, названный ВК53. Штамм В.subtilis BK53 ribG850 aab::рЕК14 (Rib_Bam+ Km^R) содержал рибофлавиновый оперон из В.amyloliquefaciens (Rib_Bam+) и ген устойчивости к канамицину Km^R (kan), интегрированные в хромосому В.subtilis в локус, называемый "aab".

Интегрированный оперон В.amyloliquefaciens был перемещен в хромосому реципиентного бесплазмидного штамма В.subtilis 304 - продуцента рибофлавина из штамма В. subtilis BK53 ribG850 ааб::рЕК14 (Pib_Bam+ Km^R) методом трансдукции с использованием фага АR9. Ген устойчивости к канамицину, интегрированный в хромосому В.subtilis вместе с рибофлавиновым опероном из В.amyloliquefaciens, использовался в качестве селекционного маркера. Полученный штамм был назван GM49. Указанный штамм GM49 aab::рЕК14 (Rib_Bam+ Km^R) содержит два рибофлавиновых оперона в хромосоме: собственный оперон и оперон из В.amyloliquefaciens.

Способность штамма В.subtilis GM49 к продукции рибофлавина была проверена в колбах с питательной средой, описанной ниже в секции «Условия ферментации». Процесс ферментации ("batch" ферментация) проводили в колбах емкостью 850 мл. Объем культуры был 150 мл. Штамм GM49 производил 3 г/л рибофлавина за 72 часа.

Пример 2. Конструирование штамма Bacillus subtilis, содержащего как рибофлавиновый оперон из В.amyloliquefaciens в хромосоме, так и рибофлавиновый оперон из В. subtilis на плазмиде.

Штамм В.subtilis GM51/pMX45 был получен из бесплазмидного штамма В.subtilis GM49 - продуцента рибофлавина.

Сначала был получен штамм, дефицитный по системе рекомбинации.

Для получения штамма GM51 с инсерционной мутацией recE::cat в гене recE была использована плазмида рВТ69. Плазмида рВТ69, производная от плазмиды рВТ61, содержащей ген recE из Bacillus subtilis (Gassel M. and Alonso J.C., "Expression of the recE gene during induction of the SOS response in Bacillus subtilis recombination-deficient strains", Mol. Biology, 1989, 3(9), 1269-1276), содержала ген устойчивости к хлорамфениколу (cat), кодирующий хлорамфеникол ацетилтрансферазу. Плазмида рВТ69 была интегрирована в ген recE по участкам узнавания рестриктазы ClaI (recE::cat), присутствовавшим в гене. Мутантный ген recE::cat был интегрирован в хромосому штамма В.subtilis GM49 рекомбинацией двойным кроссинговером. Таким образом был получен штамм В. subtilis GM51 (aab::рЕК14 recE::cat (Rib_Bam+ Km^R Cm^R)).

Затем дефицитный по системе рекомбинации (recE::cat) Cm^R штамм В.subtilis GM51 был трансформирован плазмидой рМХ45, содержащей рибофлавиновый оперон из штамма В.subtilis ribO335. Указанная плазмида рМХ45 содержит большой (10 kb) фрагмент ДНК хромосомы В.subtilis. Плазмида рМХ45 является низкокопийной плазмидой (1-2 копии на клетку). Плазмида рМХ45 детально описана в патенте Франции 2546907.

Штамм GM51/pMX45 производил 5.8 г/л рибофлавина в течение 72 часов ферментации в колбах и 15 г/л рибофлавина в течение 70 часов ферментации в ферментерах (jar fermentors) объемом 1 л.

Пример 3. Выведение штамма Bacillus subtilis, способного к утилизации глицерофосфата в качестве единственного источника углерода.

Штамм В.subtilis GM41/pMX45 был получен из рибофлавинового продуцента В.subtilis GM51/pMX45 как спонтанный мутант, способный к утилизации глицерофосфата (0.1%) в качестве единственного источника углерода. Штамм В.subtilis GM41/pMX45 был получен селекцией на минимальной питательной среде Спицайзена, содержащей глицерофосфат (0.1%) вместо глюкозы. Штамм В.subtilis GM41/pMX45 был депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) в соответствии с Будапештской конвенцией 17 сентября 2002 под инвентарным номером ВКПМ В-8386.

Штамм В.subtilis GM41/pMX45 производил 8.8 г/л рибофлавина в течение 72 часов ферментации в колбах и 18 г/л рибофлавина в течение 70 часов ферментации в ферментерах (jar fermentors) объемом 1 л.

Пример 4. Выведение штамма Bacillus subtilis, устойчивого к глиоксилату.

Штамм В.subtilis GM44/pMX45 был получен из штамма В.subtilis GM41/pMX45 как спонтанный мутант, устойчивый к глиоксилату в концентрации 1 мг/мл. Штамм В.subtilis GM44/pMX45 был получен селекцией на минимальной питательной среде Спицайзена, содержащей 1 мг/мл глиоксилата и глицерофосфат (0.1%) вместо глюкозы.

Штамм В.subtilis GM44/pMX45 был депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) в соответствии с Будапештской конвенцией 17 сентября 2002 под инвентарным номером ВКПМ В-8387.

Штамм В.subtilis GM44/pMX45 производил 9.6 г/л рибофлавина в течение 72 часов ферментации в колбах и 21 г/л рибофлавина в течение 70 часов ферментации в ферментерах (jar fermentors) объемом 1 л.

Секция: Условия ферментации

Посевную культуру (50 мл) получали путем выращивания штаммов в колбах на роторной качалке (200-220 об/мин) в течение 18 часов при 37°С.

Посевная среда:

Сахароза	20.0 г/л
Дрожжевой автолизат	10.0 г/л
MgSO4×6H2O	1.0 г/л
Эритромицин	10 γ/мл
рН перед стерилизацией	7.1-7.2

Процесс продукции рибофлавина проводили на лабораторном ферментере Marubishi емкостью 1 л с биопроцессором. Условия культивации были следующими:

перемешивание 1100 об/мин, температура 39°С, аэрация 1:1 (v/v), начальный объем - 300 мл, инокуляция посевным материалом - 10% начального объема среды для ферментации, рН поддерживали при 7.0±0.2 с помощью 6% водного раствора аммиака и 5% серной кислоты. Смеси сахаров добавляли в ходе ферментации вместе с подкормкой.

В ходе ферментации контролировали остаточные концентрации сахаров (фруктоза, глюкоза, сахароза и мальтоза). Обычно режим подкормки выбирали таким образом, чтобы общая концентрация сахаров не превышала 10 г/л.

Состав начальной среды:

Сахароза	30.0 г/л
Дрожжевой порошок	32.0 г/л
Зерновой экстракт	10.8 г/л
КН2PO4	3.0 г/л
К2HPO4	9.0 г/л
MgSO4×7Н2O	0.6 г/л
Мочевина	6.0 г/л

Состав подкормки:

Меласса (тип С)	227 г/л
Сироп VHM	227 г/л
Сахароза	419 г/л

Подкормка содержит примерно 720 г/л сахаров (глюкоза, сахароза, мальтоза и др.)

Приготовление начальной среды

Дрожжевой порошок для питательной среды стерилизовали в кипящей водяной бане в течение 40 мин. 9.6 г дрожжевого порошка растворяли в 100 мл стерилизованной воды при 45-55°С. Процедуру проводили в стерильных колбах. Суспензию выдерживали в кипящей водяной бане в течение 40 мин. Все остальные компоненты среды стерилизовали стандартным способом в автоклаве.

Начальный объем (AS)	300 мл
Посевной материал	30 мл
Подкормка (0-120 ч)	около 170 мл
Вода (28-48 ч)	90 мл
Водный аммиак 1:1	около 20-30 мл
Пеногаситель (20% раствор в воде)	если необходимо
Конечный объем (теоретический)	620 мл
(реальный)	550-570 мл
Подкормка:	1.2 мл/ч (7-24 ч)
	1.5 мл/ч (25-72 ч)

Продолжительность ферментации - до 120 часов.

Количество произведенного рибофлавина определяли спектрофотометрически при 464 нм и подтверждали обращенно-фазовой ВЭЖХ (элюент - 34% метанол).

1. Способ получения рибофлавина, включающий стадии выращивания бактерии Bacillus subtilis - продуцента рибофлавина и выделения рибофлавина из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве бактерии - продуцента рибофлавина используют бактерию Bacillus subtilis, обладающую, по крайней мере, одной из следующих характеристик:

содержит rib оперон из Bacillus amyloliquefaciens в хромосоме этой бактерии;

обладает способностью к утилизации глицерофосфата или

обладает устойчивостью к ингибированию роста глиоксилатом.

2. Штамм Bacillus subtilis GM51/pMX45, содержащий в хромосоме rib оперон из Bacillus amyloliquefaciens, - продуцент рибофлавина.

3. Штамм Bacillus subtilis GM41/pMX45 (ВКПМ В-8386), обладающий способностью к утилизации глицерофосфата, - продуцент рибофлавина.

4. Штамм Bacillus subtilis GM44/pMX45 (ВКПМ В-8387), обладающий устойчивостью к ингибированию роста глиоксилатом, - продуцент рибофлавина.