Выделенная молекула днк, кодирующая эритропоэтин человека, (варианты), экспрессирующий плазмидный или вирусный днк-вектор, гликопротеид эритропоэтин (варианты) и способ его получения, фармацевтическая композиция (варианты), линия клеток млекопитающего (варианты)

Выделенная молекула днк, кодирующая эритропоэтин человека, (варианты), экспрессирующий плазмидный или вирусный днк-вектор, гликопротеид эритропоэтин (варианты) и способ его получения, фармацевтическая композиция (варианты), линия клеток млекопитающего (варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное является частичным продолжением находящихся в процессе одновременного рассмотрения заявок на патент США №561024, поданной 13 декабря 1983 года; 582185, поданной 21 февраля 1984 года, и 655841, поданной 28 сентября 1984 года.

Предпосылки изобретения

Настоящее изобретение относится к манипуляции генетическими материалами и, в частности, к рекомбинантным методикам, позволяющим получить полипептиды, обладающие частично или полностью первичной структурной конформацией и/или одним или более из биологических свойств встречающегося в природе эритропоэтина.

А. Манипуляция генетическими материалами

Генетические материалы можно в широком смысле определить как те химические вещества, которые программируют и управляют производством компонентов клеток и вирусов и направляют ответы клеток и вирусов. Длинноцепочечное полимерное вещество, известное как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), содержит генетический материал всех живых клеток и вирусов, за исключением некоторых вирусов, программируемых рибонуклеиновой кислотой (РНК). Структурными звеньями в ДНК-полимерах являются четыре различных нуклеотида, каждый из которых состоит из пурина (аденин или гуанин) или из пиримидина (тимин или цитозин), связанных с дезоксирибозо-сахаром, к которому присоединена фосфатная группа. Присоединение нуклеотидов в форме линейного полимера происходит путем слияния 5'-фосфата одного нуклеотида с 3'-гидроксильной группой другого нуклеотида. Функциональная ДНК встречается в форме устойчивых двунитевых сообществ одиночных нитей нуклеотидов (известных как дезоксиолигонуклеотиды), чьи сообщества образуются путем водородной связи между пуриновыми и пиримидиновыми основаниями [т.е. "комплементарные" сообщества, существующие или между аденином (А) и тимином (Т), или между гуанином (G) и цитозином (С)]. По конвенции принято нуклеотиды называть по названиям составляющих их пуриновых или пиримидиновых оснований, а комплементарные сообщества нуклеотидов в двунитевой ДНК (т.е. А-Т и G-C) называть как "пары оснований". Рибонуклеиновая кислота представляет собой полинуклеотид, содержащий аденин, гуанин, цитозин и урацил (U), скорее, чем тимин, связанный с рибозой и фосфатной группой.

Короче говоря, программирующая функция ДНК осуществляется главным образом посредством процесса, в котором специфические последовательности нуклеотидов ДНК (гены) "транскрибируются" в относительно неустойчивые полимеры информационной РНК (мРНК). В свою очередь, мРНК служит в качестве матрицы для образования структурных, регуляторных и каталитических белков из аминокислот. Этот процесс "трансляции" мРНК включает функционирование мелких нитей РНК (тРНК), которые транспортируют и выравнивают индивидуальные аминокислоты вдоль нитей мРНК, разрешая образование нуклеотидов в надлежащих последовательностях аминокислот."Информация" мРНК, исходящая от ДНК и создающая основание для подачи тРНК и ориентации любой из двадцати аминокислот для "экспрессии" полипептида, находится в форме триплетных "кодонов" - последовательных группирований трех нуклеотидных оснований. В известном смысле, образование белка является окончательной формой "экспрессии" программированной генетической информации, обеспечиваемой нуклеотидной последовательностью гена.

"Промоторные" последовательности ДНК обычно "предшествуют" гену в ДНК-полимере и обеспечивают участок для инициирования транскрипции в РНК. "Регуляторные" последовательности ДНК обычно также "расположены выше по течению" (т.е. предшествуют) гена в данном ДНК-полимере, связывая белки, определяющие частоту (или скорость) транскрипционального инициирования. Совместно называемые как "промоторная/регуляторная" или "управляющая" последовательность ДНК, это такие последовательности, которые предшествуют отобранному гену (или ряду генов) в функциональном ДНК-полимере, способствуют определению того, произойдет ли транскрипция и, в конце концов, экспрессия гена. Последовательности ДНК, которые "сопровождают" ген в ДНК-полимере и обеспечивают подачу сигнала для окончания транскрипции в мРНК, называются как "терминаторные" последовательности транскрибирования.

В фокусе микробиологической технологии последнего десятилетия находится попытка индустриального производства и фармацевтически важных веществ с использованием микроорганизмов, которые или первоначально не имеют генетически кодированной информации, относящейся к желаемому продукту, включенному в их ДНК, или (в случае с клетками млекопитающих в культуре) не выражают обычным путем хромосомный ген на заметном уровне. Проще говоря, ген, устанавливающий структуру желаемого полипептидного продукта, или выделяют от "донорного" микроорганизма, или химически синтезируют и затем устойчиво интродуцируют в другой микроорганизм, предпочтительно, самореплицирующийся одноклеточный микроорганизм, такой как бактерии, дрожжи или клетки млекопитающих в культуре. Существующее машинное оборудование для экспрессии генов в "трансформированных" или "трансфектированных" микробных клетках-хозявах работает для создания желаемого продукта с использованием экзогенной ДНК в качестве матрицы для транскрипции мРНК, которая затем транслируется в непрерывную последовательность аминокислотных остатков.

Данная область техники представлена широко в патентных и литературных публикациях, относящихся к методологиям "рекомбинантной РНК" для выделения, синтеза, очистки и амплификации генетических материалов, используемых при трансформации отобранных микроорганизмов хозяина. Патент США №4237224, выданном Cohen, et al., например, относится к трансформации одноклеточных микроорганизмов хозяина с "гибридной" вирусной или кольцевой плазмидной ДНК, включающей отобранные последовательности экзогенной ДНК. Методики патента Cohen, et al. впервые включают получение вектора трансформации посредством ферментативно отщепляющейся вирусной или кольцевой плазмидной ДНК для образования нитей линейной ДНК. Отобранные инородные ("экзогенные" или "гетерологические") нити ДНК, обычно включающие последовательности, кодирующие желательный продукт, получают в линейной форме путем использования сходных ферментов. Линейную вирусную или плазмидную ДНК инкубируют с инородной ДНК в присутствии сшивающих ферментов, способных осуществлять процесс восстановления, а "гибридные" векторы образуются содержащими отобранный сегмент экзогенной ДНК, "сплетенный" в плазмиду вирусной или кольцевой ДНК.

Трансформация совместимых одноклеточных микроорганизмов хозяина с гибридным вектором заканчивается образованием многократных копий экзогенной ДНК в популяции клеток-хозяев. В некоторых случаях желаемым результатом является просто амплификация инородной ДНК, и собранный, выращенный в культуре "продукт" представляет собой ДНК. Более часто целью трансформации является экспрессия, осуществляемая при помощи клеток-хозяев экзогенной ДНК в форме крупномасштабного синтеза выделяемых количеств промышленно важных фрагментов белка или полипептида, кодируемых инородной ДНК. См. также, например, патенты США №№4264731 (выданный Shine), 4273875 (выданный Manis), 4293652 (выданный Cohen) и Европейскую патентную заявку №093619, опубликованную 9 ноября 1983 года.

Развитие специфических последовательностей ДНК для сплетения в векторы ДНК достигается путем применения целого ряда технических приемов, зависящих в значительной мере от степени "инородности" "донора" по отношению к проектируемому хозяину, а также от размера полипептида, выражаемого в хозяине. Опасаясь чрезмерного упрощения, можно утверждать, что существуют три основных альтернативных способа: (1) "выделение" двунитевой ДНК-последовательности от геномной ДНК донора; (2) химическое получение ДНК-последовательности, создающей код для представляющего интерес полипептида, и (3) синтез in vitro двунитевой ДНК-последовательности посредством ферментативной "обратной транскрипции" мРНК, выделенной из донорских клеток. Указанные выше способы, которые включают образование ДНК-"комплемента" мРНК, обычно называют как "кДНК" способы.

Получение последовательностей ДНК часто является методом выбора, когда известна полная последовательность аминокислотных остатков желаемого полипептида. Методики получения ДНК, описанные в одновременно рассматриваемой заявке на патент США №483451, Alton, et al. (поданной 15 апреля 1983 года, и соответствующей заявке РСТ US 83/00605, опубликованной 24 ноября 1983 года под номером WO 83/04053), например, создают средства для достижения таких чрезвычайно желаемых результатов, как: предусмотрение наличия чередующихся кодонов, часто встречающихся в микроорганизме хозяина, отобранном для экспрессии (например, предусмотрение "предпочтительных" кодонов дрожжей или Е. coli); избежание присутствия нетранслированных "интронных" последовательностей (обычно находящихся в геномных ДНК-последовательностях млекопитающих и их мРНК-матрицах), которые не без труда обрабатываются прокариотическими клетками-хозяевами; избежание нежелательных "ведущих" полипептидных последовательностей, обычно кодируемых геномными ДНК и кДНК-последовательностями, однако, часто не легко отщепляемых от представляющего интерес полипептида при помощи бактериальных или дрожжевых клеток-хозяев; предусмотрение легкой вставки ДНК в подходящие экспрессивные векторы в сообществах с желаемыми промоторными/регуляторными и терминаторными последовательностями; и предусмотрение легкого построения генов, кодирующих полипептидные фрагменты и аналоги желательных полипептидов.

Когда полная последовательность аминокислотных остатков желаемого полипептида не известна, непосредственное получение последовательностей ДНК невозможно и выделение последовательностей ДНК, кодирующих полипептиды при помощи кДНК-способа, становится методом отбора, несмотря на возможные недостатки в легкости сборки векторов экспрессии, способных обеспечить высокие уровни микробной экспрессивности, указанной выше. Среди стандартных методик для выделения кДНК-последовательностей находится получение плазмидонесуших кДНК- "библиотек", происходящих от обратной транскрипции мРНК, часто встречающейся в донорских клетках, отобранных в качестве ответственных за экспрессию генов высокого уровня (например, библиотеки кДНК, происходящие от гипофизарных клеток, которые выражают относительно большие количества продуктов гормонов роста). Где известны значительные части аминокислотной последовательности полипептидов, там меченые, зондовые последовательности однонитевой ДНК, дуплицирующей последовательность, предположительно находящуюся в "плановой" кДНК, можно использовать в методиках ДНК/ДНК-гибридизации, проводимых на клональных копиях кДНК, которая была денатурирована в однонитевую форму. [См., главным образом, раскрытие и обсуждения данной области техники, представленные в патенте США 4394443, выданном на имя Weissman, et al. и последние показы использования длинных зондов олигонуклеотидной гибридизации, сообщенные в работах Wallace, et al., Nuc. Acids Res., 6, pp.3543-3557 (1979), Reyes, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 79, pp.3270-3274 (1982) и Jaye, et al., Nuc. Acids Res., 11, pp.2325-2335 (1983). См. также патент США №4358535, выданный на имя Falkow, et al., касающийся методик ДНК/ДНК-гибридизации при проведении диагностики; опубликованные Европейские патентные заявки №0070685 и №0070687, относящиеся к светоиспускающим меткам на однонитевых полинуклеотидных зондах; работу Davis, et al., "А Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1980) at pp.55-58 and 174-176, касающуюся методик гибридизации колоний и эпидемических заболеваний; и New England Nuclear (Boston, Mass.) брошюры по "Gene Screen" Hybridization Transfer Membrane materials, дающие руководства для переноса и гибридизации ДНК и РНК, Каталог №NEF-972].

Среди наиболее значительных последних достижений в методиках гибридизации для экранирования рекомбинантных клонов является использование меченых смешанных олигонуклеотидных зондов, каждый из которых потенциально является полным комплементом специфической последовательности ДНК в выборке гибридизации, включающей гетерогенную смесь однонитевых ДНК и РНК. Эти методики признаются особенно полезными при выявлении кДНК-клонов, получаемых из источников, которые создают крайне малые количества последовательностей мРНК для представляющего интерес полипептида. Короче говоря, использование строгих условий гибридизации, направленных на избежание неспецифического связывания, может позволить, например, авторадиографическую визуализацию специфического клона кДНК на исходе гибридизации плановой ДНК тому единственному зонду в смеси, который является ее полным комплементом. См., главным образом, Wallace, et al., Nuc. Acids Res., 9, pp.879-897 (1981); Suggs, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 78, pp.6613-6617 (1981); Choo, et al., Nature, 299, pp.178-180 (1982); Kurachi, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 79, pp.6461-6464 (1982); Ohkubo, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 80, pp.2196-2200 (1983); и Kornblihtt, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 80, pp.3218-3222 m(1983). Вообще, методики смешанных зондов в работе Wallace, et al. (1981) выше, были расширены различными разработчиками до момента, когда сообщалось о получении достоверных результатов в выделении кДНК-клонов с использованием 32-членного смешанного "пула" олигонуклеотидных зондов длиной в 16 оснований (16-mer) равномерно изменяющихся последовательностей ДНК вместе с одиночным 11-mer для выполнения двухпозиционного "положительного" подтверждения наличия кДНК, представляющей интерес. См. работу Singer-Sam, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 80, pp.802-806 (1983).

Использование изолятов геномной ДНК является наименее распространенным из трех указанных выше способов развития специфических последовательностей для использования в рекомбинантных методиках. Это особенно верно в области рекомбинантных методик, направленных на обеспечение микробной экспрессивности полипептидов млекопитающих, и обусловлено, главным образом, сложностью геномной ДНК млекопитающих. Таким образом, хотя и существуют надежные методики для развития фаг-несущих библиотек геномной ДНК человека и других видов млекопитающих [см., например, работу Lawn, et al., Cell, 15, pp.1157-1174 (1978), относящуюся к методикам для генерирования геномной библиотеки человека, обычно называемой как "Библиотека Maniatis"; работу Karn, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 77, pp.5172-5176 (1980), касающуюся геномной библиотеки человека на основе методики альтернативного ограничения эндонуклеазной фрагментации; работу Blattner, et al., Science, 196. pp.161-169 (1977), описывающую построение бычьей геномной библиотеки], предпринято несколько относительно успешных попыток использования методик гибридизации в выделении геномной ДНК при отсутствии далеко идущего предвидения аминокислотных или ДНК-последовательностей. В качестве одного примера можно привести работу Fiddes, et al., J. Mol. and App. Genetics, 1, pp.3-18 (1981), где сообщается об успешном выделении гена, кодирующего альфа-субъединицу гипофизарных гликопротеидных гормонов человека из Библиотеки Maniatis путем использования "предельно длинного" зонда, включающего полный фрагмент 621 пары азотистых оснований предварительно выделенной кДНК-последовательности для альфа-субъединицы. В качестве другого примера, в работе Das, et al., Р.N.А.S. (U.S.А.), 80, pp.1531-1535 (1983) сообщается о выделении геномных клонов человека для HLA-DR человека с использованием синтетического олигонуклеотида со 175 парами оснований. И, наконец, в работе Anderson, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 80, pp.6838-6842 (1983) сообщается о выделении геномного клона для бычьего панкреатического трипсинового ингибитора (BPTI) с использованием одиночного зонда, имеющего 86 пар оснований в длину и построенного в соответствии с известной аминокислотной последовательностью BPTI. Авторы отмечают определение скромных перспектив для выделения мРНК, пригодной для синтеза кДНК-библиотеки, ввиду очевидных низких уровней мРНК в первоначально нацеленных источниках околоушной железы и тканей легкого. Выражая затем надежды на успех в зондировании геномной библиотеки с использованием смеси меченых зондов, они констатируют: "Большей частью, олигодезоксинуклеотидные зонды смешанных последовательностей применялись для выделения белковых генов неизвестной последовательности из библиотек кДНК. Такие зонды обычно представляют собой смесь 8-32 олигонуклеотидов и имеют длину 14-17 нуклеотидов, являясь типичными представителями каждой возможной комбинации кодонов для небольшого растяжения (5-6 остатков) аминокислотной последовательности. В жестких условиях гибридизации, которые ставят в худшее положение зонды с неправильно спаренными азотистыми основаниями, эти смеси способны локализовывать специфические последовательности генов в клональных библиотеках малой сложности. Тем не менее, ввиду их незначительной длины и неоднородности, смешанные зонды часто лишены специфичности, необходимой для зондирования таких сложных последовательностей, как геном млекопитающих. Это делает такой способ непрактичным для выделения белковых генов млекопитающих, когда соответственные мРНК недоступны." (Ссылки опущены).

Таким образом, в данной области техники продолжает оставаться необходимость в совершенствовании способов выполнения быстрого и эффективного выделения кДНК-клонов в тех случаях, когда мало что известно об аминокислотной последовательности и когда "обогащенные" источники ткани мРНК не очень доступны, чтобы их можно было использовать в построении библиотек кДНК. Такие усовершенствованные способы были бы особенно полезны, если бы они применялись для выделения геномных клонов млекопитающих, где доступна неплотная информация относительно аминокислотных последовательностей полипептида, кодируемого искомым геном.

В. Эритропоэтин как представляющий интерес полипептид

Эритропоэз, образование красных кровяных телец, осуществляется непрерывно на протяжении всей жизни человека для компенсации разрушенных клеток. Эритропоэз представляет собой чрезвычайно точно регулируемый физиологический механизм, позволяющий вырабатываться в крови достаточному количеству красных кровяных телец для правильной оксигенации ткани, но не настолько большому, чтобы клетки воспрепятствовали кровообращению. Образование красных кровяных телец происходит в костном мозге под контролем гормона, эритропоэтина.

Эритропоэтин, кислотный гликопротеид с молекулярным весом приблизительно 34000 Дальтон, может встречаться в трех формах: α, β и асиало. Формы α и β отличаются незначительно в углеводных компонентах, однако, имеют одинаковую потенцию, биологическую активность и молекулярный вес. Форма асиало представляет собой α или β-форму с отщепленным концевым углеводом (сиаловая кислота). Эритропоэтин присутствует в очень низких концентрациях в плазме, когда тело находится в здоровом состоянии, при котором ткани получают достаточную оксигенацию от существующего количества эритроцитов. Эта нормальная низкая концентрация достаточна для стимулирования замены красных кровяных телец, которые обычно теряются в процессе старения.

Количество эритропоэтина в кровообращении возрастает в условиях гипоксии, когда снижается перенос кислорода кровяными клетками при кровообращении. Гипоксия может вызываться потерей большого количества крови при кровотечении, разрушением красных кровяных телец вследствие радиоактивного облучения, снижением потребления кислорода из-за больших высот или продолжительного бессознательного состояния, а также различными формами анемии. Под влиянием тканей, подверженных гипоксическому стрессу, эритропоэтин начинает увеличивать образование красных кровяных телец путем стимулирования конверсии первичных предшествующих клеток в костном мозге в проэритробласты, которые впоследствии доводят до созревания, синтезируют гемоглобин и реализуются в кровообращении в качестве красных кровяных телец. Когда число красных кровяных телец в кровообращении больше, чем необходимо для нормальной потребности тканей в кислороде, эритропоэтин в кровообращении снижается.

См., главным образом, работы Testa, et al., Exp. Hematol., 8(Supp. 8), 144-152 (1980); Tong, et al., J. Biol. Chem., 256(24), 12666-12672 (1981); Goldwasser, J. Cell. Physiol., 110(Supp. 1), 133-135 (1982); Finch, Blood, 60 (6), 1241-1246 (1982); Sytowski, et al., Expt. Hematol., 8 (Supp. 8), 52-64 (1980); Naughton, Ann. Clin. Lab. Sci., 13 (5), 432-438 (1983); Weiss, et al., Am. J. Vet. Res., 44 (10), 1832-1835 (1983); Lappin, et al., Exp. Hematol., 11 (7), 661-666 (1983); Baciu, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 414, 66-72 (1983); Murphy, et al., Acta. Haematologica Japonica, 46 (7), 1380-1396 (1983); Dessypris, et al., Brit. J. Haematol., 56, 295-306 (1984); и Emmanouel, et al., Am. J. Physiol., 247 (1 Pt 2), F 168-76 (1984).

Так как эритропоэтин важен в процессе образования красных кровяных телец, гормон имеет потенциальное полезное применение как в диагностике, так и при лечении нарушений крови, характеризующихся низким или несовершенным образованием красных кровяных телец. См., главным образом, работы Pennathur-Das, et al., Blood, 63 (5), 1168-71 (1984) и Haddy, Am. Jour. Ped. Hematol./Oncol., 4, 191-196, (1982), касающиеся эритропоэтина в возможных терапиях серповидно-клеточных болезней, а также Eschbach, et al., J. Clin. Invest., 74 (2), pp.434-441, (1984), в которой описан терапевтический режим для уремической овцы на основании реакции in vivo на вливание плазмы, обогащенной эритропоэтином, и предложена дозировка 10 U ЕРО/кг в день в течение 15-40 дней как поправка анемии такого типа, который ассоциируется с хронической почечной недостаточностью. См. также работу Krane, Henry Ford Hosp. Med. J., 31 (3), 177-181 (1983).

Недавно было оценено, что наличие эритропоэтина в большом количестве позволит лечить каждый год анемии у 1600000 человек только в США. См., например, Morrison, "Bioprocessing in Space - an Overview", pp.557-571 in The World Biotech Report 1984, Volume 2:USA, (Online Publications, New York, N.Y. 1984). Последние исследования создали основание для предсказания эффективности эритропоэтиновой терапии в разнообразии состояний болезни, расстройств и состояний гематологического нарушения: Vedovato, et al., Acta. Haematol., 71, 211-213 (1984) (бета-талассемия); Vichinsky, et al., J. Pediatr., 105 (1), 15-21 (1984) (кистозный фиброз); Cotes, et al., Brit. J. Obstet. Gyneacol., 90 (4), 304-311. (1983) (беременность, расстройства менструаций); Haga, et al., Acta. Pediatr. Scand., 72, 827-831 (1983) (ранняя анемия преждевременности); Claus-Walker, et al., Arch. Phys. Med. Rehabil., 65, -370-374 (1984) (повреждение спинного мозга); Dunn, et al., Eur. J. Appl. Physiol., 52, 178-182 (1984) (космический полет); Miller, et al., Brit. J. Haematol., 52, 545-590 (1982) (острая потеря крови); Udupa, et al., J. Lab. Clin. Med., 103 (4), 574-580 и 581-588 (1984); и Lipschitz, et al., Blood, 63 (3), 502-509 (1983) (старение); и Dainiak, et al., Cancer, 51 (6), 1101-1106 (1983) и Schwartz, et al., Otolaryngol., 109, 269-272 (1983) (различные неопластические состояния болезни, сопровождаемые аномальным эритропоэзом).

Предыдущие попытки получить эритропоэтин с хорошим выходом выработки из плазмы крови или из мочи доказаны как относительно неудачные. Усложненная и утонченная лабораторная техника, неизбежно и, как правило, приводит к сбору очень малых количеств загрязненных и неустойчивых экстрактов, содержащих эритропоэтин.

В патенте США №3033753 описан способ частичной очистки эритропоэтина от плазмы крови овцы, что обеспечивает получение малых выходов общего беспримесного экстракта, содержащего эритропоэтин.

Первоначальные попытки выделить эритропоэтин из мочи привели к неустойчивым, биологически неактивным препаратам гормона. В патенте США №3865801 описан способ стабилизации биологической активности общего вещества, содержащего эритропоэтин, восстановленный из мочи. Получаемый препарат, содержащий эритропоэтин, сдерживает 90% активности эритропоэтина и является устойчивым.

Другой способ очистки эритропоэтина человека от мочи пациентов, страдающих апластической анемией, описан в работе Miyake, et al., J. Biol. Chem., Vol.252; №15 (August 10, 1977), pp.5558-5564. Эта семиэтапная методика включает ионообменную хроматографию, осаждение этанола, гель-фильтрацию, адсорбционную хроматографию и вырабатывает чистый эритропоэтин с потенцией 70400 единиц/мг белка при выходе 21%.

В патенте США №4397840, выданном Takezawa, et al., описаны способы получения "эритропоэтинового продукта" из образцов мочи здорового человека со слабо основными ионными изменениями и утверждается, что полученные продукты с низким молекулярным весом "не имеют ингибирующих действий против эритропоэтина".

В заявке на патент Великобритании №2085887, Sugimoto, et al., опубликованной 6 мая 1982 года, описан способ получения гибридных лимфобластоидных клеток человека и сообщается, что уровни продуцирования находятся в пределах от 3 до 420 единиц эритропоэтина на мл суспензии клеток (распределенных в культурах после размножения хозяином млекопитающего с содержанием до 10⁷ клеток на мл). На самых высоких уровнях продуцирования, которые, как утверждается, должны быть достигнуты, скорость продуцирования эритропоэтина может быть рассчитана, чтобы составить от 40 до 4000 единиц/10⁶ клеток/48 часов в культуре in vitro с последующим переносом клеток из систем размножения in vivo (См. также эквивалентный патент США №4377513). Были сделаны многочисленные предложения в отношении выделения эритропоэтина из тканевых источников, включающих неопластические клетки, однако выходы выработки были совершенно низкими. См., например, работы Jelkman, et al., Expt. Hematol., 11 (7), 581-588 (1983); Tambourin, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 80, 6269-6273 (1983); Katsuoka, et al., Gann, 74, 534-541 (1983); Hagiwara, et al., Blood, 63 (4), 828-835 (1984); и Choppin, et al., Blood, 64 (2), 341-347 (1984).

Другие технологии выделения, применяемые для получения очищенного эритропоэтина, включали в себя иммунологические методики. Поликлональное, являющееся производным сыворотки антитело, направленное против эритропоэтина, развивается путем инъецирования животного, предпочтительно, крысы или кролика, человеческим эритропоэтином. Инъецированный эритропоэтин человека распознается как инородное антигенное вещество иммунной системой животного и вызывает продуцирование антител против антигена. Различные клетки, реагирующие на стимулирование посредством антигенного вещества, продуцируют и высвобождают в кровообращении антитела, отличающиеся слегка от тех, которые продуцируются другими реагирующими клетками. Активность антител остается в сыворотке животного, когда его кровь экстрагирована. И хотя неочищенная сыворотка или препараты антител, очищенные как сывороточная фракция иммуноглобулина G, могут быть затем использованы в пробах для обнаружения комплексообразования с человеческим эритропоэтином, вещества испытывают главное неудобство. Это сывороточное антитело, состоящее из всех различных антител, продуцированных отдельными клетками, по природе является поликлональным и образует комплексы с компонентами в общих экстрактах иначе, чем одиночный эритропоэтин.

Интерес для предпосылок настоящего изобретения представляют последние достижения в области разработки целостных культур клеток, способных продуцировать одиночный вид антитела, который специфически иммунологически активен с одиночной антигенной детерминантой отобранного антигена. См., главным образом, работу Chisholm, High Technology, Vol.3, №1, 57-63 (1983). Предпринимались попытки употребить слияние клеток и методики гибридизации для развития "моноклональных" антител к эритропоэтину и применить эти антитела в выделении и количественном определении эритропоэтина человека. В качестве одного примера можно привести сообщение, появившееся в аннотированной форме в работе Lee-Huang, Abstract №1463 of Fed. Proc., 41, 520 (1982), в которой говорится об успешной разработке линий клеток гибридомы мышь-мышь, выделяющих моноклональные антитела к человеческому эритропоэтину. В качестве другого примера, подробное описание получения и использования моноклонального, противоэритропоэтинового антитела появилось в работе Weiss, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 79, 5465-5469 (1982). См. также работы Sasaki, Biomed. Biochim. Acta., 42 (11/12), 5202-5206 (1983); Yanagawa, et al., Blood, 64 (2), 357-364 (1984); Yanagawa, et al., J. Biol. Chem., 259 (5), 2707-2710 (1984); и патент США №4465624.

Для предпосылок изобретения также представляют интерес сообщения об иммунологической активности синтетических пептидов, которые по существу дуплицируют аминокислотную последовательность, сохранившуюся в встречающихся в природе белках, гликопротеидах и нуклепротеидах. Более конкретно, полипептиды с относительно низким молекулярным весом показаны участвующими в иммунных реакциях, сходных по продолжительности и протяженности с иммунными реакциями физиологически важных белков, таких как вирусные антигены, полипептидные гормоны и тому подобное. Среди иммунных реакций таких полипептидов включено и провоцирование образования специфических антител в иммунологически активных животных. См., например, работы Lerner, et al., Cell, 23, 309-310 (1981); Ross, et al., Nature, 294, 654-656 (1981); Walter, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 77, 5197-5200 (1980); Lerner, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 78, 3403-3407 (1981); Walter, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 78, 4882-4886 (1981); Wong, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 78, 7412-7416, (1981); Green, et al., Cell, 28, 477-487 (1982); Nigg, et al., P.N.A.S. (U.S.A.), 79, 5322-5326 (1982); Baron, et al., Cell, 28, 395-404 (1982); Dreesman, et al., Nature, 295, 158-160 (1982); и Lerner, Scientific American, 248, №2, 66-74 (1983). См. также работу Kaiser, et al., Science, 223, pp.249-255 (1984), касающуюся биологической и иммунологической активности синтетических пептидов, которые приблизительно обладают вторичными структурами пептидных гормонов, однако, могут не обладать их первичной структурной конформацией. Вышеуказанные исследования касаются, конечно, аминокислотных последовательностей белков, иных, нежели эритропоэтин, вещество, для которого не было опубликовано существенной информации об аминокислотной последовательности. В совместной заявке на патент США №463724, поданной 4 февраля 1983 года J. Egrie, опубликованной 22 августа 1984 года как европейская заявка на патент №0116446, описана линия клеток гибридомы мышь-мышь (А.Т.С.С. № НВ8209), которая продуцирует крайне специфическое моноклональное, противоэритропоэтиновое антитело, которое является также специфически иммунонеактивным с полипептидом, содержащим следующую последовательность аминокислот:

NH₂-Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Glu-Ala-Lys-COOH.

Полипептидной последовательностью является та последовательность, которая закреплена за первыми двадцатью аминокислотными остатками созревшего эритропоэтина человека, изолированного в соответствии со способом, описанным в работе Miyake, et al., J. Biol. Chem., 252, 5558-5564 (1977), и над которой провели аминокислотный анализ посредством газофазового секвенсера (Applied Biosystems, Inc.) в соответствии с методикой Hewick, М., et al., J. Biol. Chem., 256, 7990-7997 (1981). См. также работу Sue, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 80, pp.3651-3655 (1983), касающуюся развития поликлональных антител против синтетического 26-mer на основе отличающейся аминокислотной последовательности, и работу Sytowski, et al., J. Immunol. Methods, 69, pp.181-186 (1984).

Хотя поликлональные или моноклональные антитела, как описано выше, располагают весьма полезными материалами для использования в иммуноиспытаниях для обнаружения и количественного определения эритропоэтина и могут быть пригодны в сродственной очистке эритропоэтина, кажется маловероятным, что эти материалы для крупномасштабного выделения могут обеспечить количества эритропоэтина млекопитающих источников, достаточные для проведения дальнейшего анализа, клинического обследования и возможного широконаправленного терапевтического использования вещества при лечении, например, хронической болезни почек, при которой пораженные ткани не в состоянии поддерживать продуцирование эритропоэтина. Поэтому предполагается, что наилучшие перспективы для полной характеристики эритропоэтина млекопитающих и создания больших количеств его для возможной диагностики и клинического применения содержит употребление рекомбинантных методик для осуществления крупномасштабного микробного синтеза соединения.

Несмотря на то, что в попытке выделить последовательности ДНК, кодирующие эритропоэтин человека или других видов млекопитающих, были предприняты значительные усилия, ни одно из них не было успешным. Это обусловлено, главным образом, дефицитом тканевых источников, особенно человеческих тканевых источников, обогащенных в мРНК так, чтобы позволить построение кДНК-библиотеки, из которой посредством применения известных методик можно выделить последовательность ДНК, кодирующую эритропоэтин. Кроме того, мало что известно о непрерывной последовательности аминокислотных остатков эритропоэтина, а поэтому невозможно построить, например, длинные полинуклеотидные зонды, подходящие для надежного использования в скрининге ДНК/ДНК-гибридизации кДНК и особенно геномных библиотек ДНК. Иллюстративно последовательность двадцати аминокислот, применяемая для генерирования вышеуказанного моноклонального антитела, продуцированного А.Т.С.С. №НВ8209, не допускает построения однозначного 60-основного олигонуклеотидного зонда способом, описанным Andersen, et al., выше. Найдено, что человеческий ген для эритропоэтина может проявляться как "ген одиночной копии" в геноме человека, и так или иначе, генетический материал, кодирующий эритропоэтин человека, вероятно, составляет менее 0,00005% общей геномной ДНК человека, которая должна присутствовать в геномной библиотеке.

На сегодняшний день наиболее успешные из известных попыток в рекомбинантных способах для создания последовательностей ДНК, пригодных при использовании в микробной экспрессии изолируемых количеств эритропоэтина млекопитающих, далеко не достигли цели. В качестве примера можно привести работу Farber, et al., Exp. Hematol., 11, Supp. 14, Abstract 101 (1983), в которой сообщается об экстракции мРНК из почечных тканей бабуинов, обработанных фенилгидразином, и инъецировании мРНК в ооциты Xenopus laevis с довольно временным результатом получения in vitro смеси "трансляционных продуктов", которые имели проявляющиеся биологические свойства эритропоэтина. Совсем недавно Farber, et al., Blood, 62, №5, Supp. №1, Abstract, 392, at page 122a (1983) доложили о трансляции in vitro мРНК почки человека лягушечьими ооцитами. Полученная смесь продукта трансляции была оценена как содержащая порядка 220 mU продукта трансляции, имеющего активность эритропоэтина на микрограмм введенной мРНК. И хотя такие уровни трансляции in vitro экзогенной мРНК, кодирующей эритропоэтин, были признаны совершенно низкими (по сравнению даже с ранее сообщенными уровнями трансляции мРНК бабуина в искомый продукт), посчитали, что результаты подтверждают существование почки человека в качестве участка экспрессивности эритропоэтина, позволяющей построение кДНК-библиотеки обогащенной почки человека, из которой можно выделить желаемый ген. [См. также Farber, Clin. Res., 31 (4), 769A (1983)].

С тех пор как были поданы заявки на патенты США №№561024 и 582185, появилось единственное сообщение о клонировании и экспрессии того, что признано кДНК эритропоэтина человека в Е.coli. Короче говоря, целый ряд клонов кДНК был внесен в плазмиды Е.coli, и продукты слияния β-лактамазы были отмечены как иммунореактивные с моноклональным антителом к неустановленному "эпитопу" эритропоэтина человека. См. Lee-Huang, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 81, pp.2708-2712 (1984).

Краткое изложение

Предлагаются впервые новые очищенные и выделенные полипептидные продукты, имеющие частично или полностью первичную структурную конформацию (т.е. непрерывную последовательность аминокислотных остатков) и одно или более биологических свойств (например, иммунологические свойства и биологическая активность in vivo и in vitro) встречающегося в природе эритропоэтина, включая его аллельные варианты. Эти полипептиды также однозначно отличаются тем, что являются продуктом экспрессии прокариотического или эукариотического хозяина (например, бактериальными, дрожжевыми и клетками млекопитающих в культуре) последовательностей экзогенной ДНК, полученных путем геномного или кДНК-клонирования, или путем генного синтеза. Продукты микробной экспрессии в клетках позвоночных (например, млекопитающих и птиц) могут, кроме того, отличаться тем, что свободны от сообщества с белками человека или другими загрязнителями, которые могут ассоциироваться с эритропоэтином в его естественной для клеток млекопитающих окружающей среде или в экстрацеллюлярных текучих средах, таких как плазма крови или моча. Продукты типичных дрожжевых (например, Saccaromyces cerevisiae) или прокариотических (например, Е.coli) клеток-хозяев свободны от сообщества с любыми белками млекопитающих. В зависимости от применяемого хозяина предлагаемые полипептиды могут быть гликозилированы млекопитающими или другими эукариотическими углеводами, или могут быть негликозилированными. Предлагаемые полипептиды могут также включать аминокислотный остаток начального метионина (в положении - 1).

Предлагаемые новые гликопротеиновые продукты включают те, которые имеют первичную структурную конформацию, достаточно дуплицирующую конформацию встречающегося в природе (например, человеческого) эритропоэтина для того, чтобы дать возможность обладать одним или более из биологических свойств последнего, и те, которые имеют среднюю углеводную композицию, отличающуюся от композиции встречающегося в природе (например, человеч