Молчащие анти-cd28-антитела и их применение

Молчащие анти-cd28-антитела и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к анти-CD28-антителам, дефектным по митогенной активности, и их применениям.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Иммунные реакции, в частности отторжение органных трансплантантов, главным образом, приписывается активации Т-лимфоцитов. Данная активация Т-клеток индуцируется сигналом от антигенпрезентирующих клеток (АРС). Сигнал от АРС включает первый сигнал, опосредуемый Т-клеточным рецептором (TCR), и второй сигнал (костимуляторный сигнал), опосредуемый костимуляторными молекулами. Первый сигнал происходит от главного комплекса гистосовместимости (МНС), где АРС представляет антиген Т-клеток через TCR. Второй сигнал опосредуется несколькими костимулирующими молекулами, примеры которых включают В7 (В7-1 (CD80) и В7-2 (CD86)), известные в качестве лигандов на АРС и CD28, CTLA-4 и т.п. в качестве рецепторов на Т-клетках. Лиганд В7 представляет гликопротеин, относящийся к надсемейству иммуноглобулинов и экспрессирующийся в В-клетках и т.д., которые относятся к группе антигенпрезентирующих клеток. Как CD28, так и CTLA-4, которые распознают В7 как общий лиганд, являются трансмембранными гликопротеинами, относящимися к надсемейству иммуноглобулинов. Таким образом, активация Т-клеток регулируется одновременной передачей первого сигнала через TCR и второго сигнала, например, от В7 и CD28/CTLA-4. Известно, что сигнал от В7 на CD28 стимулирует, в то время как сигнал от В7 на CTLA-4 ингибирует активацию Т-клеток [Waterhouse et al., Science, 270:985-988 (1995)].

До настоящего времени для индукции иммуносупрессии или толерантности предпринимались попытки блокировать сигнал B7-CD28 введением CTLA-4Ig, анти-B7-1-антител/анти-В7-2-антител, анти-CD28-антител или тому подобного. Например, CTLA-4Ig связывается с B7, нарушая тем самым взаимодействие между В7 и CD28, и, как следствие, блокирует сигнал от CD28 с проявлением иммуносупрессорной активности. Однако, поскольку одновременно также ингибируется взаимодействие между В7 и CTLA-4, сигнал от CTLA-4, отрицательно воздействующий на активацию Т-клеток, также подавляется таким образом, что в итоге желаемая толерантность не достигается [Kirk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:8789-8794 (1997)]. Также были получены анти-В7-антитела, и сообщалось, что они подавляют активацию Т-клеток, но, как и в случае с CTLA-4Ig, они также подавляют CTLA-4-сигнал. В опыте in vitro было установлено, что анти-CD28-антитела оказывают митогенное действие в отношении Т-клеток, а сочетание стимуляции под воздействием данных антител и анти-CD3-антител способствует росту и активации Т-клеток и усиливает продукцию цитокинов [WO 90/05541, Eur. J. Immunology, 16, 1289-1296 (1986), и т.д.] Кроме того, митогенная стимуляция СD28-рецептора Т-клеток под действием анти-CD28-антител, стимулированная in vivo, приводила к генерации Т-активирующего сигнала, аналогичного второму сигналу от В7 на CD28 [Yin et al., J. Immunology, 163:4328-4334 (1999)]. Данные Т-активирующие функции позволяют предположить, что анти-СD28-антитела можно использовать в качестве иммунопотенциатора при лечении злокачественных опухолей и СПИДа (WO 90/05541).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Анти-СD28-антитела, полученные обычными способами, проявляют митогенное действие в отношении Т-клеток. Несмотря на то, что данная митогенная активность не полностью понятна, полагают, что возможной причиной является связывание Fc-области анти-CD28-антитела с Fc-рецептором антигенпрезентирующей клетки [Cole et al., J. Immunology, 36:159 (1997)]. Следовательно, используя генно-инженерную технологию, авторы ввели мутации в связывающий сайт Fc-рецептора анти-CD28-антител для модификации антител с тем, чтобы они не обладали митогенной активностью. Авторы настоящего изобретения получили одни такие антитела, TN228 IgG2M3, в которых IgG2M3 имеет две замены аминокислот в гене IgG. Кроме того, авторы показали, что полученные молчащие анти-CD28-антитела не обладают митогенной активностью, что чрезвычайно применимо для индукции Т-клеточной толерантности.

Следовательно, настоящее изобретение относится к анти-CD28-антителам, не обладающим митогенной активностью (в последующем относится к молчащим анти-CD28-антителам), и способам подавления иммунных реакций, особенно отторжения трансплантантов, и индукции иммунотолерантности с использованием указанных антител.

Объектом настоящего изобретения являются молчащие анти-СD28-антитела, где анти-CD28-антитела могут быть химерными антителами и/или гуманизированными антителами. Вариабельные области анти-CD28-антител могут включать аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 2, 4, 7 и 9, и полинуклеотиды, кодирующие такие аминокислотные последовательности. Например, такие полинуклеотиды включают SEQ ID NO: 1, 3, 6 и 8.

Другим объектом настоящего изобретения являются векторы и клетки-хозяева, включающие полинуклеотиды, которые кодируют анти-CD28-антитела.

Другим объектом настоящего изобретения являются способы получения молчащих анти-CD28-антител культивированием клетки-хозяина, включающей полинуклеотиды, которые кодируют анти-CD28-антитела в условиях, обеспечивающих экспрессию полинуклеотида, и выделением продуцируемых продуктов гена.

Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая одно или несколько молчащих анти-CD28-антител, предпочтительно, смешанных с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми ингредиентами.

Молчащие анти-CD28-антитела применимы для индукции Т-клеточной толерантности, иммуносупрессии и в качестве профилактического/терапевтического препарата против отторжения трансплантанта органа или ткани. Следовательно, настоящее изобретение относится к способам индукции Т-клеточной толерантности, иммуносупрессии и профилактической или лечебной терапии при отторжении трансплантанта органа или ткани введением одного или нескольких молчащих анти-CD28-антител млекопитающему. Предпочтительно, такие молчащие анти-CD28-антитела вводят в виде фармацевтической композиции, описанной здесь, и она может включать дополнительные подходящие лекарственные препараты/фармацевтические средства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1. Плазмидные конструкции для экспрессии антител ChTN228.

Гены V_L и V_H мышиных антител TN228 конструировали в виде миниэкзонов, фланкированных сайтами XbaI. Последовательность гена V_L включали в экспрессирующий вектор pVk, а последовательность гена V_H включали в экспрессирующий вектор pVg2M3.

Фиг.2. Нуклеотидные последовательности и выведенные аминокислотные последовательности легкой цепи ChTN228 в миниэкзонах. Сигнальные пептидные последовательности выделены курсивом. CDR подчеркнуты. Зрелая легкая цепь начинается с остатка аспарагиновой кислоты (жирный шрифт). Нетранслируемые и интронные последовательности приведены в нижнем регистре. (SEQ ID NO: 1 и 2).

Фиг.3. Нуклеотидные последовательности и выведенные аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи ChTN228 в миниэкзонах. Сигнальные пептидные последовательности выделены курсивом. CDR подчеркнуты. Зрелая тяжелая цепь начинается с остатка глутамина (жирный шрифт). Нетранслируемые и интронные последовательности приведены в нижнем регистре (SEQ ID NO: 3 и 4).

Фиг.4. Конкурентный анализ. Клетки P815/CD28^- инкубировали с 25 Нг MuTN228-FITC и двукратными серийными разведениями ChTN228 или MuTN228, как описано. Клетки P815/CD28⁺ также инкубировали с одним MuTN228-FITC, без какого-либо конкурента. Строили график зависимости среднего значения флуоресценции от концентрации конкурента.

Фиг.5. Ингибирующее действие TN228-IgG2m3 на первичную MLR(1) человека. Отдельно представлено ингибирование в процентах первичной MLR для четырех индивидуумов.

Фиг.6. Ингибирующее действие TN228-IgG2m3 на первичную MLR(2) человека. Отдельно представлено ингибирование в процентах первичной MLR для четырех индивидуумов.

Фиг.7. Действие TN228-IgG2m3 на вторичную MLR.

Данные по двум добровольцам представлены отдельно.

Поглощение [³H]-тимидина при вторичной MLR выражено в виде процента от числа распадов в минуту при стимуляции только Raji в первичной MLR, принятого за 100. TN228-IgG2m3: 0,1 мкг/мл.

Фиг.8. Плазмидные конструкции для экспрессии антител HuTN228. V_L и V_H гуманизированных TN228 конструировали в виде миниэкзонов, фланкированных сайтами XbaI. Последовательность гена V_L включали в экспрессирующий вектор pVk, а последовательность гена V_H включали в экспрессирующий вектор pVg2M3.

Фиг.9. Нуклеотидные последовательности и выведенные аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи HuTN228 в миниэкзонах. Сигнальные пептидные последовательности выделены курсивом. CDR подчеркнуты. Зрелая тяжелая цепь начинается с остатка глутамина (жирный шрифт) (SEQ ID NO: 6 и 7).

Фиг.10. Нуклеотидные последовательности и выведенные аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи HuTN228 в миниэкзонах. Сигнальные пептидные последовательности выделены курсивом. CDR подчеркнуты. Зрелая легкая цепь начинается с остатка аспарагиновой кислоты (жирный шрифт) (SEQ ID NO: 8 и 9).

Фиг.11. Конкурентный анализ с использованием FACS. В конкурентном анализе с проточной цитометрией определяли связывание FITC-меченых MuTN228 с клетками P815/CD28⁺ в присутствии различных количеств конкурентных антител MuTN228 или HuTN228, как описано в примерах.

Фиг.12. Конкурентный анализ с использованием ELISA. В конкурентном анализе с использованием ELISA определяли связывание биотинилированных MuTN228 с sCD28-Fc в присутствии различных количеств конкурентных антител MuTN228 или HuTN228, как описано в примерах.

Фиг.13. Конкурентный анализ с использованием I-125. В конкурентном анализе с использованием ¹²⁵I-меченных антител определяли связывание ¹²⁵I-меченных MuTN228 с клетками P815/CD28⁺ в присутствии различных количеств конкурентных антител MuTN228 или HuTN228, как описано в примерах.

Фиг.14. Плазмидные конструкции для экспрессии антител PV1-IgG3. V_L и V_H PV1 конструировали в виде миниэкзонов, фланкированных сайтами XbaI. Последовательность гена V_L включали в экспрессирующий вектор pMVk.rg.dE, а последовательность гена V_H - в экспрессирующий вектор pMVg3.D.Tt. Затем две плазмиды рекомбинировали с получением одной плазмиды, коэкспрессирующей тяжелую и легкую цепи PV1-IgG3.

Фиг.15А. Последовательности кДНК и выведенные аминокислотные последовательности легкой цепи и тяжелой цепи в миниэкзонах. CDR подчеркнуты. Зрелая легкая цепь начинается с остатка аспарагиновой кислоты (дважды подчеркнут) в положении 20 (SEQ ID NO: 10 и 11).

Фиг.15В. Последовательности кДНК и выведенные аминокислотные последовательности вариабельных областей PV1 в миниэкзонах. CDR подчеркнуты. Зрелая тяжелая цепь начинается с глутамина (дважды подчеркнут) в положении 20 (SEQ ID NO: 12 и 13).

Фиг.16. Анализ PV-1-IgG3 гель-хроматографией с использованием ВЭЖХ, как описано в разделе «Способы». Белок определяли по поглощению при 280 нм.

Фиг.17. Анализ SDS-PAGE мышиного контрольного изотипа IgG3 (полоса 1), PV1 (полоса 2) и PV1-IgG3 (полоса 3). Белки на фотоснимке А проходили в невосстанавливающих условиях, а на фотоснимке В - в восстанавливающих условиях. ММ означает маркеры молекулярной массы. Числа представляют стандарты ММ в кДа.

Фиг.18. Клетки EL4 окрашивали PV1 (А), 37.51 (В) или PV1-IgG3 (С) и анализировали по способу проточной цитометрии. Использованными вторичными антителами были: FITC-меченые ослиные антитела против IgG (H+L) армянского хомяка для PV1, FITC-меченые ослиные антитела против IgG золотистого хомяка для 37.51 и FITC-меченые козьи антитела против мышиной каппа-цепи для PV1-IgG3. На графиках сплошной линией представлены клетки, окрашенные только вторичными антителами. На графиках прерывистой линией представлены клетки, окрашенные как первичными, так и вторичными антителами, как описано в разделе «Способы». Мышиный контрольный изотип IgG3 не окрашивал клетки EL4 (данные не представлены).

Фиг.19. (А). Избыток PV1 или PV1-IgG3 конкурирует с R-PE-мечеными PV1 за связывание с клетками EL4. Тонкой сплошной линией в гистограмме проточной цитометрии представлены клетки без какого-либо окрашивания, жирной сплошной линией - клетки, окрашенные только R-PE-PV1, тонкой прерывистой линией - клетки, окрашенные R-PE-FV1 и избытком немеченых PV1, и тонкой двойной прерывистой линией - клетки, окрашенные R-PE-PV1 и избытком немеченых PV1-IgG3. Избыток мышиного контрольного изотипа IgG3 не оказывал воздействия на связывание R-PE-PV1 с клетками EL4 (данные не представлены). (В). Избыток 145.2С11 или 145.2С11-IgG3 конкурирует с R-PE-мечеными 145.2С11 за связывание с EL4. Тонкой сплошной линией представлены клетки без какого-либо окрашивания, жирной сплошной линией - клетки, окрашенные только R-PE-145.2C11, толстой прерывистой линией - клетки, окрашенные R-PE-145.2C11 и избытком немеченых 145.2С11, и тонкой двойной прерывистой линией - клетки, окрашенные R-PE-145.2C11 и избытком немеченых 145.2C11-IgG3. (С). Избыток PV1 конкурирует с PV1-IgG3 за связывание с клетками EL4. Клетки EL4 окрашивали PV1-IgG3 с и без избытка PV1. Клетки отмывали и окрашивали мышиными IgG3-специфическими, FITC-мечеными ослиными антителами против мышиного IgG3 (H+L). Тонкой сплошной линией представлены клетки, окрашенные только вторичными антителами, жирной сплошной линией - клетки, окрашенные PV1-IgG3 и вторичными антителами, и тонкой прерывистой линией - клетки, окрашенные PV1-IgG3 и избытком PV1, и вторичными антителами.

Фиг.20. Мышиные спленоциты, окрашенные PV1-IgG3 и 145.2С11. Клетки окрашивали контрольным мышиным изотипом IgG3 (А) или PVl-IgG3 (В), проводили контрастное окрашивание R-PE-мечеными козьими антителами против мышиного IgG3 и FITC-мечеными 145.2С11, и проводили анализ по способу двухцветной проточной цитометрии, как описано в разделе «Материалы и способы». Анализировали клетки только в окне лимфоцитов. PV1-IgG3-положительные клетки находились в верхних квадратах, и CD3-положительные клетки находились в правых боковых квадратах. Число в каждом квадрате представляет процент клеток в данном конкретном квадрате.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В контексте настоящего изобретения термин «молчащие анти-CD28-антитела» означает любые анти-CD28-антитела, дефектные по митогенной активности. Конкретнее, эти антитела, которые специфически связываются с антигенами CD28-рецептора на поверхности Т-клеток и не стимулируют рост или активацию Т-клеток при комбинированной стимуляции анти-СD3-антителами.

Молчащие анти-CD28-антитела могут быть сконструированы на основе анти-CD28-антител или продуцирующей анти-CD28-антитела гибридомы мутацией или модификацией агонистических анти-CD28-антител методом генной инженерии или химической модификацией. Например, выбрав использование технологии генной инженерии, аффинность связывания анти-CD28-антител для Fc-рецепторов может быть снижена или элиминирована введением мутации в аминокислотную последовательность Fc-домена антител. Например, молчащие анти-СD28-антитела можно получить выделением кДНК из гибридомных клеток, способных продуцировать моноклональные анти-CD28-антитела, и введением мутации(ий) в область последовательности, соответствующей Fc-домену, который играет важную роль в связывании с Fc-рецептором (WO 88/07089). Сайт мутации особым образом не ограничивается, при условии, что можно ингибировать связывание с Fc-рецепторами. Таким образов, в случае класса IgG-антител, например, предпочтительными являются аминокислотные остатки Н-цепи 234, 235, 236, 237, 318, 320 и 322, и молчащие анти-CD28-антитела можно сконструировать заменой, по меньшей мере, одной из данных аминокислот на другую аминокислоту.

Источник таких молчащих анти-CD28-антител может быть рассудительно выбран соответственно целевому животному, у которого используются антитела. Например, отличные от человеческих мококлональные антитела содержат аминокислотные последовательности, показывающие антигенность у людей весьма широкого спектра. Многие исследования показали, что иммунный ответ пациента на чужеродные антитела после введения антител является очень сильным, и само введение антител может вызвать у пациента тяжелое состояние или привести к потере у антител терапевтической применимости. Следовательно, рекомендуется заменить Fc-область таким образом, чтобы сделать антитела более гомологичными для подвергающегося лечению ими целевого животного, заменить каркасные участки вариабельных областей или использовать антитела, полученные от трансгенного животного, которому введен ген антитела целевого животного. Например, когда антитела предназначены для введения человеку, возможно применение химерных антител (ЕР 125023) с замененной Fc-областью, гуманизированных антител с замененным каркасным участком (ЕР 0239400, ЕР 045126) или человеческих антител (ЕР 546073, WO 97/07671), полученных от трансгенного животного, которому введен ген человеческого антитела. Митогенную активность антител можно уменьшить или элиминировать введением мутаций в данные антитела методами генной инженерии, такими как описаны выше, или химической модификацией.

В качестве конкретных примеров анти-СD28-антител, имеющих молчащие Fc-области, можно упомянуть не только антитела, описанные ниже в разделе «Примеры», но также антитела, полученные синтетическим путем с использованием гена константной области от подвергающего лечению целевого животного и полинуклеотидов вариабельной области, основанных на аминокислотных последовательностях вариабельных областей, представленных в SEQ ID NO: 2 и 4 или SEQ ID NO: 7 и 9. Примерами таких полинуклеотидов являются таковые с последовательностями SEQ ID NO: 1, 3, 6 и 8.

Более конкретными примерами данного изобретения являются HuTN228 и MuTN228, их Fab-фрагменты, их F(ab)'₂-фрагменты, их производные и т.д.

Как очевидно специалистам в данной области, в результате вырожденности триплетного кода почти любая аминокислота может быть представлена более чем одним триплетным кодоном в кодирующей нуклеотидной последовательности. Кроме того, изменения пары минорных оснований могут привести к изменению (консервативной замене) кодируемой аминокислотной последовательности без существенного изменения биологической активности продукта гена. Таким образом, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая белок или пептид, раскрытые здесь, можно несколько модифицировать (например, заменой нуклеотида в триплетном кодоне), и она по-прежнему будет кодировать соответствующий продукт гена с той же аминокислотной последовательностью.

Термин «эксгрессирующий вектор» относится к полинуклеотиду, который кодирует пептид по изобретению и содержит последовательности, необходимые для его экспрессии в выбранной клетке-хозяине. Как правило, экспрессирующие векторы включают промотор и терминатор транскрипции или обеспечивают условия для встраивания смежно с эндогенным промотором. Обычно экспрессирующие векторы представляют плазмиды, дополнительно включающие репликон и один или несколько селектируемых маркеров. Однако, альтернативно, экспрессирующие векторы могут быть вирусными рекомбинантами, предназначенными для инфицирования хозяина, или интегрирующими векторами, предназначенными для интеграции в предпочтительный сайт внутри генома хозяина. Примеры экспрессирующих векторов раскрыты в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook, Fritsch, and Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Подходящие клетки-хозяева для экспрессии молчащих анти-СD28-антител включают прокариоты, дрожжи, архебактерии и эукариотические клетки. В данной области хорошо известны соответствующие клонирующие и экспрессирующие векторы для использования таких хозяев как бактерии, грибы, дрожжи и клетки млекопитающих, например, описанные Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985). Предпочтительно, клетки являются клетками млекопитающих. Вектор может быть плазмидным вектором, одно- или двухцепочечным фаговым вектором или вирусным вектором с одно- или двухцепочечной РНК или ДНК. Подобные векторы можно ввести в клетки в виде полинуклеотидов, предпочтительно, ДНК, хорошо известными методами для введения ДНК или РНК в клетки. Векторы, в случае фаговых и вирусных векторов, также могут быть, предпочтительно, введены в клетки в виде упакованного или инкапсулированного вируса хорошо известными методами инфицирования и трансдукции. Вирусные векторы могут быть компетентными по репликации или дефектными по репликации. В последнем случае, как правило, размножение вируса будет иметь место только в соответствующих клетках-хозяевах. Можно также использовать бесклеточные трансляционные системы для получения белков с использованием РНК, полученной из настоящих ДНК-конструкций.

Молчащие анти-CD28-антитела/белки можно выделить способами выделения/очистки, используемыми для белков, хорошо известными в области белковой химии. Конкретнее можно упомянуть, например, экстракцию, перекристаллизацию, высаливание сульфатом аммония, сульфатом натрия и т.д., центрифугирование, диализ, ультрафильтрацию, адсорбционную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, нормальнофазовую хроматографию, обращеннофазовую хроматографию, гель-фильтрацию, проникающую гель-хроматографию, аффинную хроматографию, электрофорез, противоточное распределение и т.д. и их комбинации.

По настоящему изобретению очищенные антитела можно получить с использованием рекомбинантных экспрессирующих систем, описанных выше. Способ включает культивирование клетки-хозяина, трансформированной экспрессирующим вектором, содержащий последовательность ДНК, которая кодирует белок, в условиях, способствующих в достаточной мере экспрессии белка. Затем белок выделяют из культуральной среды или клеточных экстрактов в зависимости от используемой экспрессирующей системы. Как это известно специалистам в данной области, способы выделения рекомбинантного белка будут варьировать в зависимости от таких факторов, как тип используемых клеток-хозяев, а также от того, секретируется или нет рекомбинантный белок в культуральную среду.

Молчащие анти-СD28-антитела при включении в фармацевтическую композицию можно использовать при (а) отторжении трансплантантоз после трансплантации органов или тканей, таких как сердце, почки, печень, костный мозг, кожа, роговица, легкие, поджелудочная железа, тонкий кишечник, мышцы, нервы и т.д.; (b) реакциях трансплантант-против-хозяина при трансплантации костного мозга; (с) аутоиммунных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, системная красная волчанка, рассеянный склероз, тяжелая псевдопаралическая миастения, диабет типа I и т.д., и (d) иммунных заболеваний, таких как астма, атопический дерматит и т.д.

Тогда как ожидается, что молчащие анти-СD28-антитела может подавлять иммунные реакции и отторжение трансплантантов и индуцировать иммунотолерантность сами по себе, их также можно использовать в комбинации с другими препаратами. Среди таких других препаратов, которые пригодны для комбинирования с молчащими анти-CD28-антителами, находятся различные иммуносупрессоры, такие как рапамицин, дезоксиспергаулин, анти-СD40-антитела, анти-СD40L-антитела, програф, циклоспорин А, анти-IL-2-антитела, антитело против рецептора IL-2, анти-IL-12-антитела, антитела против рецептора IL-12 и MMF. Рапамицин, в частности, ингибирует передачу сигнала, относящегося к росту Т-клеток, среди сигналов от рецептора IL-2, но не ингибирует передачу сигнала, относящегося к апоптозу, так что ожидается, что его применение в комбинации со специфическим ингибитором сигнала CD28 будет полезным.

Молчащие анти-CD28-антитела по данному изобретению можно вводить перорально или парентерально, предпочтительно, внутривенным, внутримышечным или подкожным путем.

Молчащие анти-CD28-антитела по данному изобретению можно приготовить в форме раствора или лиофилизованного порошка и, где необходимо, можно включить их в состав композиции вместе с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как наполнитель, разбавитель, стабилизатор, изотонический агент и буфер. Предпочтительные добавки включают сахар, такой как мальтоза, поверхостно-активное вещество, такое как полисорбат, аминокислоту, такую как глицин, белок, такой как человеческий сывороточный альбумин, и соль, такую как хлорид натрия.

Также можно выбрать лекарственную форму в виде инъекционных препаратов (растворов, суспензий, эмульсий, твердых веществ для растворения перед использованием и т.д.), таблеток, капсул, гранул, порошков, жидкостей, включений в липосомы, мазей, гелей, порошков для наружного применения, спреев, порошков для ингаляций, глазных капель, глазных мазей, суппозиториев, пессариев и тому подобное, в зависимости от пути введения, и можно соответственно ввести в композицию пептид по настоящему изобретению. Составление композиций в основном описано в Chapter 25.2 of Comprehensive Medical Chemistry, Volume 5, Editor Hansch et al., Pergamon Press, 1990.

Доза фармацевтической композиции по данному изобретению зависит, среди других переменных, от конкретной композиции, типа заболевания, на которое направлено лечение или профилактика, пути введения, возраста и состояния пациента и продолжительности лечения. Однако в случае внутривенного, внутримышечного или подкожного введения взрослому человеку можно вводить 0,01-100 мг/кг, предпочтительно, 0,1-10 мг/кг в сутки.

Когда молчащие анти-CD28-антитела по данному изобретение используют для подавления отторжения трансплантанта или индукции иммунотолерантности при трансплантации органа или ткани, композицию можно вводить в дозе примерно 1 мг/кг/сутки непосредственно перед трансплантацией, сразу же после трансплантации и на 3, 7, 12, 18, 25, 35, 45 и 60 сутки после трансплантации внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекцией. Частота и доза введения могут быть адекватно повышены или понижены при контроле протекания реакции отторжения после трансплантации.

В то время как интервал между введениями зависит, среди прочих факторов, от использованного пути введения и состояния пациента, возможно не только непрерывное введение, но также прерывистое введение. Так, поскольку молчащие анти-СD28-антитела по данному изобретению представляет собой антитело, оно обеспечивает непрерывное действие так, что прерывистое введение может обеспечивать ожидаемый эффект. В отношении периода лечения, если состояние толерантности достигнуто, то данную толерантность можно поддерживать, даже если применение молчащих анти-CD28-антител прекращено. В данном отношении эти молчащие анти-CD28-антитела, несомненно, являются более эффективными по сравнению с иммуносупрессорным действием других иммуносупрессоров, эффект которых снижается после прекращения введения.

ПРИМЕРЫ

Описав в основном настоящее изобретение, подробнее понять его можно, обратившись к некоторым конкретным примерам, которые приводятся здесь только для целей иллюстрации и не предназначены для его ограничения, если не указано иначе. Приведенные ниже примеры осуществляются с использованием обычных методов, которые хорошо известны и обычны для специалистов в данной области, в противном случае некоторые из них описаны подробно.

Пример 1. Секвенирование аминокислотной последовательности мышиных антител против человеческого CD28

Гибридома, продуцирующая антитела против человеческого CD28 (клон: TN228, каппа-цепь мышиного IgGI), была любезно предоставлена Dr. Yagita (Juntendo University School of Medicine, Japan). Примерно 0,2 мг выделенных антител против человеческого CD28 (TN228) восстанавливали в 0,64 М гуанидин-HCl, 0,28 М Трис-HCl, рН 8,5, 0,055 М DT7 в течение 90 минут при 60°С (в атмосфере аргона), карбоксиметилировали добавлением йодуксусной кислоты до 0,13 М в течение 45 минут при комнатной температуре (в темноте) с последующим добавлением DTr до 0,32 М (для остановки реакции карбоксиметилирования) и сразу же проводили обмен на буфер в 0,1 М фосфате натрия, 0,002 М ЭДТА, рН 8,0 с использованием колонки PD-10 (каталог # 17-0851-01, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Элюат доводили до 0,005 M DTT, 0,02% глицерина, и одну треть раствора (примерно 0,35 мл) переносили в отдельную пробирку для N-концевого деблокирования тяжелой цепи. Пробу расщепляли 1800 мкЕ пироглутаматаминопептидазы (каталог #7334, Takara Shuzo Co., Ltd., Tokyo, Japan) в течение 24 часов при 45°С. N-концевые последовательности легкой и тяжелой цепей из деблокированной пробы определяли в 20 циклах автоматического расщепления по Эдману и РТН-анализом на белковом секвенаторе Модель 241 (Hewlett Packard, Palo Alto, CA). РТН-производные анализировали на колонке Hypersil ODS C18. Анализ на секвенаторе и ВЭЖХ проводили, следуя инструкциям изготовителя, с использованием реагентов, растворителей и колонок, полученных от Hewlett Packard.

Результаты N-концевого секвенирования деблокированных пироглутаматаминопептидазой TN228 были следующими:

номер остатка	аминокислота	номер остатка	аминокислота	номер остатка	аминокислота	номер остатка	аминокислота
1	D, Q	6	Q, E	11	L	16	G, Q
2	1, v	7	s	12	А, V	17	Q, S
3	V, Q	8	Р, G	13	V, А	18	R, L
4	L	9	А, Р	14	S, Р	19	A, S
5	Т, К	10	S, G	15	L, S	20	T, I

Пример 2. Клонирование кДНК вариабельной области

кДНК V-области легкой и тяжелой цепей TN228 клонировали из гибридомных клеток якорной полимеразной цепной реакцией (ПЦР) по способу, описанному Со et al. (Со M.S., N.M. Avadalovic, P.С. Caron, M.V. Avadalovic, D.A. Scheinberg and С. Queen, 1992. Chimeric and humanized antibodies with specificity for the CD33 antigen, J. Immunol., 148:1149-1154). Амплификацию проводили с кДНК с использованием 3'-праймеров, которые гибридизировали соответственно с С-областями мышиной каппа- и гамма-цепи, и 5'-праймеров, которые гибридизировали к добавленному G-хвосту кДНК. Для ПЦР гена V_L 3'-праймер имел последовательность (SEQ ID NO: 14):

5' TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC 3'

с остатками 17-46, гибридизированными с мышиной С_К-областыо. Для ПЦР гена V_H 3'-праймеры имели вырожденные последовательности (SEQ ID NO: 15, 16 и 17):

с остатками 17-50, гибридизированными с мышиным геном С_Н1 IgG. Негибридизированные последовательности в двух группах праймеров включали сайты рестрикции, использованные для клонирования. кДНК V_L и V_H субклонировали в вектор TOPOII Blunt (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA) для определения последовательности.

Несколько клонов легкой и тяжелой цепей секвенировали из двух независимых реакций ПЦР. Для легкой цепи установили две уникальные последовательности, гомологичные вариабельным областям мышиной легкой цепи. Одна последовательность гена V_L была нефункциональной за счет мутации со сдвигом рамки считывания, и ее идентифицировали как непродуктивную аллель. Другая последовательность гена V_L была типичной для функционального гена вариабельной области мышиной каппа-цепи. Для гена тяжелой цепи была идентифицирована уникальная последовательность, гомологичная гену вариабельной области типичной мышиной тяжелой цепи. Эти нуклеотидные последовательности и их выведенные аминокислотные последовательности вариабельной области представлены на фиг.2 и фиг.3.

Пример 3. Конструирование и экспрессия химерных TN228-IgG2M3

Способы

Гены V_L и V_H TN228 превращали с помощью ПЦР в сегменты миниэкзонов, фланкированные с сайгами XbaI, как описано Не et al. (He X.Y., Z. Xu, J. Melrose, A. Mullowney, M. Vasquez, С. Queen, V. Vexler, С. Klingbeil, M.S. Co and E.L. Berg, 1998, Humanization and pharmacokinetics of a monoclonal antibody with specificity for both E- and P-selectin, J. Immunol., 160: 1029-1035), и субклонировали в экспрессирующие плазмиды легкой цепи и тяжелой цепи (фиг.1). Каждый миниэкзон включал сигнальную пептидную последовательность, последовательность гена зрелой вариабельной области и вырезанную донорную последовательность, полученную из гена наиболее гомологичной мышиной J-цепи. Подобные вырезанные донорные последовательности использовали для сплайсирования экзона гена V-области с геном константой области человеческого антитела. Каждый миниэкзон секвенировали после его клонирования в экспрессирующем векторе для гарантии получения правильной последовательности и отсутствия ошибок при ПЦР. Экзоны генов константных областей в плазмидах, экспрессирующих легкую и тяжелую цепи, также подтверждали секвенированием.

В данном описании ChTN228 относится к химерным антителам, включающим вариабельные области V_L и V_H мышиных TN228, константную область человеческого IgG2M3 для тяжелой цепи и константную область человеческой каппа-цепи для легкой цепи. Константную область тяжелой цепи модифицировали (Cole M.S., С. Anasetti and J.Y. Tso, 1997, Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to Т cells, J. Immunol., 159: 3613-3621) из зародышевого человеческого геномного фрагмента 2, и легкую цепь получали из зародышевого человеческого геномного фрагмента К. Оба гена тяжелой и легкой цепи находятся под контролем раннего промотора и энхансера цитомегаловируса человека. Ген тяжелой цепи регулируется терминатором транскрипции, полученным из гена человеческого комплемента С2 (Ashfield R., P. Enriquez-Harris and N.J. Proudfoot, 1991, Transcriptional termination between the closely linked human complement genes C2 and factor B: common termination factor for C2 and c-myc? EMBO J., 10: 4197-4207). Селективный ген-маркер легкой цепи gpt (Mulligan R.C. and P. Berg, 1981, Selection for animal cells that express the Escherichia coli gene coding for xanthine-guanine phosphoribosyltransferase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072-2076) и селективный ген-маркер тяжелой цепи dhfr (Simonsen С.С. and A.D. Levinson, 1983, Isolation and expression of an altered mouse dihydrofolate reductase cDNA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2495-2499) находятся под контролем раннего промотора из SV40. Для экспрессии химерных TN228 проводили временную трансфекцию в клетки COS-7 (линия обезьяньих почечных клеток) с использованием липофектамина (каталог #13964-013, GIBCO BRL). Истощенные среды от временных трансфектантов анализировали на продукцию человеческого IgG2M3 с помощью ELISA с использованием специфических козьих антител против гамма-цепи человеческого IgG в качестве захватывающего реагента и HRP-меченых козьих антител против человеческой каппа-цепи в качестве развивающего реагента. Истощенные среды также тестировали на способность ChTN228 связываться с клетками P815/CD28⁺ (стабильно трансфицированная клетка с CD28 в Р815 (мышиная мастоцитома)) непрямым иммунофлуоресцентным окрашиванием и анализировали проточной цитометрией. Для получения стабильной клеточной линии химерные экспрессирующие плазмиды трансфицкровали в клеточную линию мышиной миеломы Sp2/0 электропорацией и отбирали трансфектанты с экспрессией gpt. Истощенные среды от стабильных трансфектантов анализировали ELISA, как в случае временной трансфекции.

Результаты

Клонированные гены V_L и V_H превращали в миниэкзоны с помощью ПЦР (фиг.2 и 3) и субклонировали в векторы, экспрессирующие легкую и тяжелую цепи, как описано выше и представлено на фиг.1.

Временная трансфекция клеток COS-7: химерные экспрессирующие векторы временно трансфицировали в линию обезьяньих почечных клеток COS-7 для получения химерных антител TN228⁺. Истощенную среду от трансфицированных клеток тестировали с помощью ELISA на продукцию химерных IgG2M3-антител и проточной цитометрией на связывание с клетками P815/CD28⁺. В обоих тестах истощенная среда давала положительную реакцию. Выход химерных антител в результате временной трансфекции составлял ˜0,9 мкг/мл. Антитела ChTN228 из временного супернатанта связывалось с клетками P815/CD28⁺ в зависимости от концентрации (данные не представлены).

Стабильная трансфекция клеток Sp2/0: химерные экспрессирующие векторы трансфицировали в клетки Sp2/0 для получения стабильной клеточной линии. Истощенные среды от нескольких трансфектантов тестировали на продукцию химерных антител TN228 и на связывание с клетками P815/CD28⁺, как в случае с временными трансфектантами. Большинство трансфектантов давали положительную реакцию в обоих тестах. Выбирали один трансфектант с более высокой продуктивностью антител и размножали в 5 л среды без сыворотки. ChTN228 выделяли из 5 л истощенной среды аффинной хроматографией. Выход выделенных антител составлял ˜25 мг.

Пример 4. Очистка белка химерных антител ChTN228

Один из трансфектантов с высокой экспрессией ChTN228 после стабильной трансфекции (клон 7Н) культивировали в 5 л среды без сыворотки для гибридом GIBCO (каталог % 12045-076, GIBCO BRL). Собирали истощенный культуральный супернатант, когда жизнеспособность клеток достигала 10% или ниже, концентрировали до 500 мл и наносили на колонку с белком А-сефарозой емкостью 5 мл с использованием насоса Pharmacia Pl (2-3 мл/минуту). Колонку промывали PBS перед элюированием антител 0,1 М глицином, 0,1 М NaCl, pH 2,7. Элюированный белок диализовали против 3 смен по 2 л PBS каждая и затем обессоливали на колонке PD-10, уравновешенной PBS, содержащим дополнительно 0,1 М NaCl. Раствор обессоленного белка фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм перед хранением при 4°С.

Пример 5. Определение чистоты гель-ВЭЖХ и SDS-PAGE

Г