Способ отбора животных по признакам, наследуемым по механизму родительского импринтинга

Способ отбора животных по признакам, наследуемым по механизму родительского импринтинга

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способам отбора племенных животных или животных, предназначенных для убоя, на нужные генотипические или возможные фенотипические свойства, в частности ассоциированные с мышечной массой и/или отложением жира. До настоящего времени схемы разведения домашних животных были направлены на продуктивные признаки и качество туши. Это приводило к значительному улучшению таких признаков, как репродуктивность, молочная продуктивность, соотношение мяса/жира, плодовитость, интенсивность роста и эффективность использования кормов. Данные относительно простых тестов на продуктивность дают основу для указанных улучшений поголовья животных и предполагается, что на отобранные признаки влияет большое число генов, каждый из которых оказывает небольшое действие (бесконечно малая генная модель). В этой области уже достигнуты значительные изменения. Во-первых, помимо "традиционных" продуктивных признаков цель селекционной работы некоторых организаций по разведению племенных животных направлена на признаки мясного качества. Во-вторых, имеются данные, что современные и новые признаки селекционного отбора могут иметь относительно значительные эффекты (известные как мажорные гены) в противоположность бесконечно малой модели, которая использовалась до настоящего времени.

Современные ДНК-технологии дают возможность использовать такие мажорные гены, и этот способ является весьма перспективным для улучшения мясного качества, особенно, если прямая оценка мясного качества не может быть практически осуществлена для потенциальных племенных животных. Указанная современная ДНК-технология может оказаться очень эффективной также для других признаков, таких как отношение мяса/жира, плодовитость, интенсивность роста и эффективность использования кормов. Кроме того, эти признаки не всегда легко определить у живых животных.

Данные для некоторых мажорных генов были первоначально получены с использованием сегрегационного анализа, то есть без какой-либо информации о ДНК-маркерах. Затем были осуществлены молекулярные исследования для определения локализации этих генов на генетической карте. На практике, и за исключением аллелей с очень большим эффектом, исследования ДНК необходимы для анализа генетической природы большинства экономически важных признаков. ДНК-маркеры могут быть использованы для определения локализации генов или аллелей, ответственных за качественные признаки, такие как масть животного, и они могут быть также использованы для детекции генов или аллелей со значительным влиянием на количественные признаки, такие как интенсивность роста, IMF и др. В данном случае этот метод называется картированием QTL (локус количественного признака), где QTL включает по крайней мере часть нуклеиновокислотного генома животного, в котором находится генетическая информация, способная оказывать влияние на указанный количественный признак (в указанном животном или в его потомстве). Информация на уровне ДНК может не только оказать помощь в фиксации специфичного мажорного гена в популяции, но может быть также использована для отбора количественного признака, по которому уже был проведен отбор. Помимо фенотипических данных, информация на молекулярном уровне может повысить точность селекции, а следовательно и селективный ответ.

Повышение качества мяса и качества туши относится не только к изменению уровней признаков, таких как нежность или "мраморность" мяса, но также и к повышению неоднородности. Существование мажорных генов дает прекрасную возможность для улучшения качества мяса, поскольку оно позволяет значительно продвинуться в нужном направлении. Во-вторых, оно дает возможность снизить изменчивость, поскольку позволяет авторам настоящего изобретения встраивать исследуемые гены в полученные ими продукты. Другой аспект заключается в отборе на мажорные гены, который позволяет осуществлять дифференциацию для конкретных рынков сбыта. Исследования проводились на некоторых видах животных, а в частности, на свиньях, овцах, оленях и крупном рогатом скоте.

В частности, интенсивный отбор на мясную продуктивность привел к получению животных с большой мышечной массой с нежирным мясом у некоторых видов крупного рогатого скота. В последние годы стало возможно картировать и клонировать некоторые гены, ответственные за эти фенотипы, что открыло путь к более эффективной селекции с помощью маркеров, к разработке лекарственнных средств для направленной доставки (повышающих качество продуктов) и к трансгенезу. Было показано, что мутации в рецепторе рианодина (Fuji et al., 1991; MacLennan & Phillips, 1993) и в миостатине (Grobet et al., 1997; Kambadur et al., 1997; McPherron & Lee, 1997) вызывают гипертрофию мышц у свиней и крупного рогатого скота, в то время как гены, оказывающие большое влияние на мышечную массу и/или отложение жира, были, например, картированы по хромосоме 4 свиньи (Andersson et al., 1994) и по хромосоме 18 овцы (Cocket et al., 1996).

Однако, несмотря на достигнутые успехи в идентификации QTL, эти данные в настоящее время имеют ограниченное использование в коммерческих селекционных программах. Многие специалисты в данной области пришли к выводу о необходимости идентификации конкретных генов, составляющих указанный QTL. Такая идентификация представляет собой главную задачу, поскольку QTL-область является относительно большой и может содержать множество генов. Идентификация исследуемых генов из множества генов, которые могут присутствовать в данном локусе, является довольно трудной для сельскохозяйственных животных.

Настоящее изобретение относится к способу отбора домашних животных на нужные генотипические или потенциальные фенотипические свойства, предусматривающему тестирование указанного животного на присутствие подвергнутого родительскому импринтингу локуса качественных или количественных признаков (QTL). В этом случае, термин "домашнее животное" определяют как животное, отобранное по нужным генотипическим или потенциальным фенотипическим свойствам, или животное, происходящее от животного, отобранного по этим признакам.

Домашние животные имеют большой ресурс генетической и фенотипической изменчивости, при этом традиционное одомашнивание предусматривает отбор животного или его потомства по наличию желательных генотипических или потенциальных фенотипических свойств. За последнее столетие этот способ отбора был усовершенствован благодаря все возрастающему пониманию и применению законов менделевского наследования признаков. Одной из главных проблем, связанных с разработкой программ по разведению домашних животных, является негативная генетическая корреляция между репродуктивной способностью и продуктивными признаками. Это наблюдается, например, у крупного рогатого скота (высокая молочная продуктивность обычно приводит к истощению коров и быков), у домашней птицы (бройлерная линия имеет низкий уровень яйценоскости, а несушки обычно имеют очень низкий прирост мышечной массы), у свиней (очень плодовитые свиноматки имеют, обычно, много жира и сравнительно мало мяса) или у овец (в высокой степени плодовитые породы имеют низкое качество туши и наоборот). Настоящее изобретение позволяет по знанию характера родительского импринтинга различных признаков осуществлять отбор, например, отцовских линий, гомозиготных по унаследованному в результате родительского импринтинга QTL, например, сцепленному с признаками продуктивности или роста мышечной массы; при этом отбор на указанные признаки может быть менее строгим для материнской линии в пользу качества репродукции. Феномен генетического или родительского импринтинга никогда не использовался для селекции домашних животных и, при осуществлении селекционных программ, использование этого нестабильного генетического средства никогда не считалось возможным. Настоящее изобретение относится к селекционной программе, где знание характера родительского импринтинга нужного признака, как продемонстрировано в настоящем описании, позволяет разработать программу, например программу BLUP, с использованием модифицированного животного-модели. Это позволяет повысить точность оценки племенной ценности и эффективность селекции по сравнению со стандартными селекционными программами. До настоящего времени, при оценке стандартной программы BLUP эффект родительского импринтинга какого-либо признака считался пренебрежимо малым; однако, использование и понимание наследственного характера нужного признака, как показано в настоящем изобретении, позволяет осуществлять селекцию на основе родительского импринтинга даже без тестирования ДНК. Так, например, отбор генов, характеризующихся родительским импринтингом, дает возможность повысить однородность потомства; то есть (конечный) родитель, гомозиготный по "хорошему или желательному" аллелю, будет передавать их всему потомству, несмотря на другие родительские аллели, и все это потомство будет экспрессировать желательные родительские аллели. Это будет приводить к получению более однородного потомства. Представляющие интерес или являющиеся предпочтительными аллели от материнской линии часто являются аллелями, которые дают противоположные эффекты по сравнению с аллелями отцовской линии. Так, например, у мясных животных, таких как свиньи, аллели, сцепленные с признаками мясного качества, такими как внутримышечный жир или мышечная масса, могут быть фиксированы по материнской линии, тогда как аллели, сцепленные с признаком пониженного хребтового жира, могут быть фиксированы по отцовской линии. Другими желательными комбинациями являются, например, плодовитость и/или удои молока по женской линии, наряду с интенсивностью роста и/или мышечной массой по мужским линиям.

В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу отбора домашнего животного так, чтобы оно имело желательные генотипические или потенциальные фенотипические свойства, где указанный способ предусматривает тестирование образца нуклеиновой кислоты, взятого от данного животного, на присутствие локуса количественного признака (QTL), экспрессированного в соответствии с родительским импринтингом. Образец нуклеиновой кислоты может быть, в основном, получен из различных частей тела животного методами, известными специалистам. Традиционными образцами для тестирования нуклеиновой кислоты являются пробы крови или образцы тканей, взятых с поверхности кожи или мышц, но могут быть также использованы и образцы других тканей, а в частности, образцы спермы, образцы ооцитов или образцы эмбрионов. В таком образце присутствие и/или последовательность конкретной нуклеиновой кислоты, будь то ДНК или РНК, может быть определено методами, известными специалистам, такими как гибридизация или амплификация нуклеиновой кислоты, или методы секвенирования. Настоящее изобретение относится к способу тестирования такого образца на присутствие нуклеиновой кислоты, где QTL или сцепленный с ним аллель ассоциируется с феноменом родительского импринтинга; например, к способу тестирования, в котором определяют, способен ли отцовский или материнский аллель указанного QTL к преимущественной экспрессии в данном животном.

Целью селекционных программ для разведения крупного рогатого скота является повышение продуктивности животных путем улучшения их генетического состава. В основе такого улучшения лежит накапливание путем увеличения частоты встречаемости наиболее предпочтительных аллелей для генов, влияющих на нужные признаки продуктивности. Эти гены называются QTL. До начала девяностых годов генетическое улучшение достигалось применением биометрических методов, но без использования молекулярных данных, определяющих QTL.

Начиная с девяностых годов и благодаря последним достижениям в области геномики стало возможным идентифицировать QTL, определяющий представляющий интерес признак. Настоящее изобретение относится к идентификации и к использованию подверженного родительскому импринтингу QTL в целях отбора животных путем картирования локусов количественных признаков. К тому же, феномен генетического или родительского импринтинга никогда не применялся для селекции домашних животных и, при осуществлении селекционных программ, использование этого нестабильного генетического свойства никогда не считалось целесообразным. Так, например, Kovacs & Kloting (Biolchem.Mol. Biol.Int., 44: 399-405, 1998), в работе которых ничего не упоминается и не высказывается каких-либо предположений о родительском импринтинге, обнаружили сцепление определенного признака у крыс-самок, но не у крыс-самцов, которое навело на мысль о возможной специфичности по полу, ассоциированной с хромосомным участком, что, разумеется, исключает родительский импринтинг, то есть феномен, при котором ассоциированный с импринтингом признак одного родителя преимущественно, но не специфически по полу, экспрессируется в нем или в его потомстве.

Настоящее изобретение относится к предварительному определению локализации подвергнутого родительскому импринтингу QTL на данном геноме путем анализа на сцепление с генетическими маркерами и к точной идентификации подвергнутого(ых) родительскому импринтингу гена(нов) и его(их) каузальных мутаций. Молекулярные данные о таком подвергнутом родительскому импринтингу QTL позволяет более эффективно осуществлять селекционные программы. Применение молекулярных данных о подвергнутом родительскому импринтингу QTL в селекционных программах предусматривает: сегрегационный анализ с использованием маркеров для идентификации сегрегации функционально отличающихся подвергнутых родительскому импринтингу аллелей QTL в представляющих интерес популяциях; отбор с помощью маркеров (MAS), осуществляемый в линиях для усиления генетического ответа путем повышения точности отбора, интенсивности отбора или путем снижения интервала между поколениями с использованием информации о феномене родительского импринтинга; интрогрессию с помощью маркеров (MAI) для эффективного переноса представляющих интерес и переданных путем родительского импринтинга аллелей QTL от популяции-донора в популяцию-реципиента; генетическое конструирование идентифицированных родительских QTL и генетическую модификацию племенного поголовья с использованием трансгенной технологии; разработку повышающих продуктивность продуктов с использованием нужных лекарственных средств, разработанных на основе молекулярных данных относительно указанных QTL.

Авторами настоящего изобретения были проведены два независимых эксперимента для оценки возможностей практического применения родительского импринтинга QTL.

В первом эксперименте, проведенном на ранее описанных интеркроссах "пьетрен × крупная белая", было подсчитано правдоподобие данных с использованием модели отцовского (экспрессировались только отцовские аллели) и материнского (экспрессировались только материнские аллели) импринтинга и это правдоподобие сравнивали с правдободобием данных, полученных с использованием модели стандартных "менделевских" QTL. Полученные результаты со всей очевидностью продемонстрировали, что действительно экспрессируются отцовские QTL, причем аллель QTL (пьетрен × крупная белая), унаследованный от свиноматки F1, не оказывает никакого влияния на качество мясной туши и на качество F₂-потомства. Было очевидно, что весьма значимые lod-величины (логарифмы величины отношения вероятностей) были получены при тестировании на присутствие экспрессированного отцовского QTL, тогда как при исследовании хромосом, передаваемых свиноматками, не было получено каких-либо свидетельств относительно сегрегации QTL. При этом, та же самая тенденция наблюдалась для всех признаков, что указывало на то, что один и тот же прошедший импринтинг ген ответственен за эффекты, наблюдаемые для разных признаков. В таблице 1 указано максимальное правдоподобие (ML) фенотипического среднего для F₂-потомства, отсортированного по унаследованному отцовскому аллелю.

Во втором эксперименте, осуществленном на интеркроссах "дикая свинья × крупная белая", QTL-анализы по признакам конституции животного, жирности, мясного качества и роста осуществляли по карте хромосомы 2 с использованием статистической модели тестирования на присутствие эффекта импринтинга. Было получено явное свидетельство того, что экспрессированный отцовский QTL локализован на очень дальнем конце 2р (фиг.2; таблица 1). Явная экспрессия отцовского QTL проиллюстрирована методом наименьших квадратов, которая разделяет последующую популяцию на два класса по унаследованному отцовскому аллелю (Таблица 1). Для данного, прошедшего отцовский импринтинг, QTL реализация сегрегационного анализа, селекция (MAS) и интрогрессия (MAI) с помощью маркера могут быть осуществлены с использованием генетических маркеров, которые сцеплены с QTL, генетических маркеров, которые находятся в неравновесном сцеплении с QTL, или с использованием реальных каузальных мутаций в QTL.

Понимание эффекта родительского происхождения, присущего QTL, позволяет оптимально использовать его в селекционных программах. Действительно, сегрегационный анализ с помощью маркера, проводимый на модели родительского импринтинга, дает лучшие оценки эффектов QTL-аллелей. Более того, это позволяет применять специфические селекционные схемы с учетом оптимального использования QTL. В одном из вариантов настоящего изобретения наиболее предпочтительные аллели QTL могут быть фиксированы в линиях племенных животных и, например, использованы для выращивания промышленных кроссбредных самцов путем отбора с помощью маркера (MAS, внутрилинейный) и интрогрессии с помощью маркера (MAI, межлинейный). В другом варианте осуществления изобретения наихудшие аллели QTL могут быть фиксированы в линиях животных, используемых для выращивания промышленных кроссбредных самок, с помощью MAS (внутрилинейное скрещивание) и MAI (межлинейное скрещивание).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанным животным является свинья. В качестве примера можно отметить, что настоящее изобретение дает представление о том, что в настоящее время половина потомства от широко распространенных промышленных кроссбредных хряков "пьетрен × крупная белая" наследует нежелательный по мышечной массе QTL крупной белой породы, что приводит, как показано в настоящем изобретении, к значительной потере массы, и настоящее изобретение, например, дает возможность проводить отбор лучшей половины популяции по этому признаку. Однако, имеется также возможность отбора промышленных линий свиноматок, обогащенных аллелями, нежелательными для хряков, что позволяет наделять свиноматок другими аллелями, которые, например, являются более благоприятными для репродуктивных целей.

В предпочтительном варианте осуществления способа настоящего изобретения указанный QTL локализован в положении, соответствующем QTL, локализованному в хромосоме 2 свиньи.

Так, например, из данных сравнительного картирования хромосом свиньи и человека, включая "роспись" разнонаправленных хромосом, известно, что SSC2p является гомологичной HSAllpter-q13^11,12. Известно, что HSAllpter-q13 составляет кластер подвергнутых импринтингу генов: IGF2, INS2, Н19, МАН2, P57^KIP2, K_vLQTL1, Tapa/CD81, Orct12, Impt1 и Ip1. Кластер подвергнутых импринтингу генов, локализованных в HSAllpter-q13, характеризуется 8 экспрессированными материнскими генами H1 9, МАН2, P57^KIP2, K_vLQTL1, TAPA/CD81, ORCT12, IMPT1 и IР1, и двумя экспрессированными отцовскими генами IGF2 и INS. Однако, Johanson и др. (Genomic, 25: 682-690, 1995) и Reik и др. (Trends in Genetics, 13: 330-334, 1997) сообщили, что местонахождение этих локусов у различных животных пока неизвестно. Так, например, локусы HSA11 и MMU7 не соответствуют друг другу и локусы MMU7 и SSC2 не соответствуют друг другу, тогда как локусы HSA11 и SSC2, вероятно, соответствуют друг другу, и не имеется каких-либо указаний относительно того, в каком месте на хромосомах трех видов локализованы один или несколько, например, идентифицированных выше генов, экспрессированных в зависимости от того, каким родителем они были переданы.

Что касается других домашних животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, домашняя птица и рыба, имеющих аналогичные области в своем геноме, содержащем такой кластер прошедших импринтинг генов QTL, то, в этой связи, настоящее изобретение относится к использованию указанных ортологичных областей других домашних животных в селекционных программах с применением феномена родительского импринтинга. У свиней указанный кластер картирован приблизительно в положении 2р1.7 хромосомы 2, однако, способ, представленный в настоящем изобретении и предусматривающий использование (фрагментов) указанных экспрессированных материнских или отцовских ортологичных или гомологичных генов или QTL, предпочтительно применяют для других животных, а также в целях разведения и селекции. Так, например, представлен способ, где указанный QTL ассоциирован с потенциальной мышечной массой и/или отложением жира, предпочтительно с ограниченным влиянием на другие признаки, такие как качество мяса и ежедневный прирост массы указанного животного, либо где указанный QTL включает по крайней мере часть аллеля инсулин-подобного фактора роста 2 (IGF2). Reik et al. (Trends in Genetics, 13:330-334, 1997) объясняют, что этот ген у человека связан с синдромом Беквита-Видемана, который, очевидно, является синдромом, ассоциированным с родительским импринтингом и наиболее часто наблюдаемым в человеческом плоде, где данный ген играет важную роль в пренатальном развитии. При этом не было обнаружено какой-либо связи или не было высказано каких-либо предположений о связи с постнатальным развитием, относящимся к развитию мышечной массы или жирности (домашних) животных.

В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу отбора свиней на нужные генотипические или потенциальные фенотипические свойства, предусматривающему тестирование образца, взятого от указанной свиньи, на присутствие локуса количественного признака (QTL), локализация которого была определена при картировании хромосомы 2 Sus scrofa в положении 2р1.1. В частности, настоящее изобретение относится к использованию генетических маркеров для теломерного конца хромосомы 2р свиньи при отборе с помощью маркера (MAS) прошедшего родительский импринтинг локуса количественнных признаков (QTL), влияющего на количество и качество мясной туши у свиней. Кроме того, настоящее изобретение относится к использованию генетических маркеров, ассоциированных с локусом IGF2 в MAS у свиней, таких как полиморфизм и микросателлиты и другие указанные здесь характерные нуклеиновокислотные последовательности, такие как последовательности, представленные на фиг.4-10. В предпочтительном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к QTL, локализованному на дистальном конце хромосом 2 Sus scrofa и влияющему на различные уровни количества и качества мясной туши, а, в частности, мышечной массы и отложения жира.

В первом эксперименте анализ путем картирования QTL осуществляли на интеркроссах "дикая свинья × крупная белая" с оценкой 200 особей F₂. F₂-Животных умерщвляли либо при живом весе по крайней мере в 80 кг, либо при максимальном возрасте 190 дней. Затем собирали фенотипические данные по массе при рождении, росту, отложению жира, конституции животного, массе внутренних органов и качеству мяса; подробное описание фенотипических признаков приводится в работах Andersson et al.¹ и Anderssson-Eklund et al.⁴.

QTL (не оказывающий какого-либо значительного влияния на толщину хребтового жира) у точно не определенного локуса на проксимальном конце хромосомы 2, оказывающего умеренное влияние на мышечную массу и локализованного на расстоянии примерно 30 см от рассматриваемого здесь прошедшего родительский импринтинг QTL, был ранее описан авторами настоящего изобретения; тогда как QTL, рассматриваемый в данном описании, имеет очень большой эффект, что объясняется по крайней мере 20-30% дисперсией и благодаря чему QTL по настоящему изобретению приобретает особый коммерческий интерес, который еще более возрастает в том случае, если присутствующий QTL был подвергнут родительскому импринтингу. Маркерная карта хромосомы 2р была уточнена в процессе разработки настоящего изобретения путем добавления микросателлитных маркеров для схватывания всего плеча хромосомы. Были использованы следующие микросателлитные маркеры: Swc9, Sw2443, Sw2623 и Swr2516, все от дистального конца 2р⁷. QTL-анализы признаков конституции животного, жирности, качества мяса и роста осуществляли с использованием новой карты хромосомы 2. Было получено явное подтверждение того, что QTL локализуется на наиболее дистальном конце 2р (Фиг.1; Таблица 1). QTL оказывает очень сильное влияние на содержание постного мяса в окороке и объясняет неожиданную 30%-ную остаточную фенотипическую дисперсию в популяции F₂. Было также отмечено большое влияние на площадь самой длинной хребетной мышцы, на массу сердца и на толщину хребетного жира (подкожного жира). Было обнаружено умеренное влияние на признак качества мяса, коэффициент отражения. QTL не оказывал значимого влияния на брюшинный жир, массу при рождении, рост, массу печени, почек или селезенки (данные не приводятся). У свиней крупной белой породы аллель в этом QTL ассоциирован с большей мышечной массой и меньшей толщиной хребтового жира, что соответствует отличию этой породы от популяции дикой свиньи.

Во втором эксперименте картирование QTL осуществляли для интеркроссов "пьетрен × крупная белая", давших 1125 потомков F₂. Родительские породы крупная белая и пьетрен отличаются по ряду экономически важных фенотипов. Порода пьетрен известна своей исключительно высокой мышечной массой и постностью мяса¹⁰ (фиг.2), тогда как крупная белая порода известна своими сверхвысокими показателями роста. Для всего потомства F₂ были зарегистрированы двадцать один различный фенотип, определяющие показатель роста (5), мышечную массу (6), отложение жира (6) и качество мяса (4). Для картирования QTL, ответственного за генетические различия между этими породами, авторы настоящего изобретения предприняли сканирование целого генома с использованием микросателлитных маркеров в исходном образце 677 особей потомства F₂. Для анализа хромосомы 2 была использована карта нижеследующих микросателлитных маркеров: SW2443, SWC9 и SW2623, SWR2516-(0,20)-SWR783-(0,29)-SW240-(0,20)-SW776-(0,08)-S0010-(0,04)-SW1695-(0,36)-SWR308. Анализ хромосомы 2 свиньи с использованием многоточечного алгоритма максимального правдоподобия показал высокозначимые lod-величины (логарифма величины отношения вероятностей) (вплоть до 20) для трех из шести фенотипов, определяющих мышечную массу (% постной фракции мяса, % окорока, % спинной части туши) и для трех из шести фенотипов, определяющих отложение жира (толщину хребтового жира (BFT), % хребтового жира, % жировой фракции) на дистальном конце короткого плеча хромосомы 2 (фиг.1). Для остальных шести фенотипов, определяющих мышечную массу и жирность, в соответствующей области хромосомы были получены положительные lod-величины, однако экспериментально не был достигнут порог значимости (α=5%). Не существует каких-либо данных о влиянии соответствующего QTL на показатели роста (включая массу при рождении) или о зарегистрированных оценках качества мяса (данные не приводятся). Для подтверждения этого факта оставшийся образец от 355 F₂-потомков был генотипирован для четырех наиболее дистальных маркеров 2р, и анализ, проведенный на QTL для указанных признаков, дал наиболее высокие lod-величины в первом анализе. Lod-величины в диапазоне от 2,1 до 7,7 явно подтверждают присутствие мажорного QTL в данной области. В таблице 2 представлены соответствующие оценки максимального правдоподобия (ML) для трех генотипических средних, а также остаточная дисперсия. Данные, полученные в сегрегационном анализе с помощью маркеров, указывают на остаточную сегрегацию в этом локусе в популяции породы пьетрен.

Следовательно, эти эксперименты со всей очевидностью свидетельствуют о существовании QTL, оказывающих большое влияние на качество и количество туши, и локализованных на теломерном конце плеча хромосомы 2р свиньи; при этом очевидно, что у этого QTL существуют аллельная серия, состоящая по крайней мере из трех аллелей: дикая свинья < крупная белая < пьетрен, и что, более вероятно, она дает наблюдаемую сегрегацию в породе пьетрен.

Влияние идентифицированного QTL на мышечную массу и отложение жира является действительно значительным, причем то же самое значение было получено для локуса CRC, хотя, вероятно, без ассоциированных с ним неблагоприятных воздействий на качество мяса. Авторами настоящего изобретения было установлено, что оба локуса вместе подтверждают примерно 50%-ное расхождение породы "пьетрен" и крупной белой породы по признакам мышечной массы и постности мяса. QTL оказывает очень большое влияние на содержание постного мяса в окороке и объясняет неожиданно обнаруженную 30% остаточную фенотипическую дисперсию в F₂-популяции. Было также отмечено большое влияние на площадь наиболее длинной спинной мышцы, на массу сердца и на толщину хребтового жира (подкожного жира). Наблюдалось умеренное влияние на один признак качества мяса, коэффициент отражения. QTL не оказывает большого влияния на брюшной жир, массу при рождении, рост, массу печени, почки или селезенки (данные не приводятся). Аллель в данном QTL крупной белой породы, по сравнению с аллелем дикой свиньи, ассоциирован с большей мышечной массой и меньшей толщиной хребтового жира, что соответствует различию между этой породой и популяцией диких свиней. Сильно выраженный эффект импринтинга, наблюдаемый для всех ассоциированных с ним признаков, свидетельствует об участии одного каузативного локуса. Плейотропное влияние на массу скелетной мышцы и размер сердца является, очевидно, адаптивным с физиологической точки зрения, поскольку большая мышечная масса требует большего сердечного выброса.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу отбора свиней, имеющих желательные генотипические или потенциальные фенотипические признаки, где указанный способ предусматривает тестирование образца от данной свиньи на присутствие локуса количественных признаков (QTL), локализованного на карте хромосомы 2 Sus scrofa в положении 2р1.7, где указанный QTL включает по крайней мере часть аллеля инсулин-подобного фактора-2 (IGF2) или близкородственной ему геномной области, такой как полиморфизмы и микросателлиты, и другие характерные нуклеиновокислотные последовательности, указанные в настоящем описании, такие, которые были показаны на фиг.4-10. Важная роль IGF2 в пренатальном развитии хорошо задокументирована с использованием анестезированных мышей, а также исходя из его каузативной роли в синдроме Беквита-Видемана. Настоящее изобретение продемонстрировало важную роль IGF2-области также для постнатального развития.

Для того чтобы показать роль IGF2, авторы настоящего изобретения провели следующие три эксперимента:

Клон геномного IGF2 выделяли путем скрининга библиотеки ВАС свиньи. В FISH-анализах с использованием данного ВАС-клона наблюдался сильный соответствующий сигнал на терминальной части хромосомы 2р.

Полиморфный микросателлит локализован в 3'UTR IGF2 у мышей (Genbank U71085), людей (Genbank S62623) и лошадей (Genbank AF020598). Возможное присутствие соответствующего свиного микросателлита исследовали путем прямого секвенирования 3'UTR IGF2 с использованием ВАС-клона. Комплексный микросателлит был идентифицирован на расстоянии примерно 800 п.н. ниже от стоп-кодона; при этом, сравнение последовательностей показало, что этот микросателлит был идентичен ранее описанному анонимному микросателлиту, Swc9⁶. Этот маркер был использован в предварительных исследованиях по картированию QTL и его локализация на генетической карте соответствует, по всей вероятности, QTL в родословных "пьетрен × крупная белая" и "крупная белая × дикая свинья".

Анализ кДНК скелетной мышцы и печени 10-недельного плода, гетерозиготного по трансверсии nt241 (G-A) во втором экзоне свиного гена IGF11 и SWC9, показал, что ген IGF11 также подвержен импринтингу в этих тканях у свиней и экспрессируется только отцовским аллелем.

Исходя из опубликованной кДНК-последовательности¹⁶ печени взрослой свиньи, авторами настоящего изобретения были сконструированы пары праймеров, позволяющие амплифицировать всю кодирующую последовательность Igfll, включающую 222 п.н. лидерной последовательности и 280 п.н. трейлерной последовательности в кДНК скелетной мышцы свиньи. Секвенирование продуктов полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), полученных от пород "пьетрен" и "крупная белая", показало, что кодирующие последовательности были идентичны друг другу для обеих пород и идентичны указанной опубликованной последовательности. Однако, в лидерной последовательности была обнаружена транзиция GА, соответствующая экзону 2 у самцов. В соответствии с общепринятой номенклатурой, этот полиморфизм был обозначен как nt241(G-A). Авторами настоящего изобретения был разработан тест-скрининг на указанный полиморфизм в одном нуклеотиде 9 (SNP) на основе реакции лигирования амплификации, что позволило определить генотип полученного авторами материала по родословной. На основании этих данных было показано, что IgfII ко-локализуется вместе с микросателлитным маркером SWC9 (θ=0%), а поэтому фактически совпадает, очевидно, с большинством положений QTL, а также находится в пределах 95% допустимого интервала для QTL. Последующие анализы последовательности показали, что микросателлитный маркер SWC9 действительно расположен в 3'UTR гена IgfII.

Как упоминалось ранее, информация об указанном QTL позволяет разработать способ селекции отбора животных, таких как свиньи, с улучшенной кондицией мясной туши. Рассматриваются различные варианты осуществления настоящего изобретения, включая сегрегационный анализ с помощью маркера для идентификации сегрегации функционально отличающихся аллелей QTL в представляющих интерес популяциях; отбор с помощью маркера (MAS), проводимый внутри линий для усиления генетического ответа путем повышения точности отбора, интенсивности отбора или путем уменьшения интервала между поколениями; интрогрессию с помощью маркера (MAI) для эффективного переноса предпочтительных аллелей QTL от популяции-донора в популяцию-реципиент и, тем самым, для усиления генетического ответа в популяции-реципиенте. Реализация вариантов сегрегационного анализа, отбора (MAS) и интрогрессии (MAI) с помощью маркера может быть осуществлена с использованием генетических маркеров, которые сцеплены с QTL, генетических маркеров, которые находятся в неравновесном сцеплении с QTL, или с использованием реальных каузальных мутаций в QTL.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к способу отбора свиней, имеющих желательные генотипические или потенциальные фенотипические признаки, где указанный способ предусматривает тестирование образца, взятого от данной свиньи, на присутствие локуса количественных признаков (QTL), локализованного на карте хромосомы 2 Sus scrofa в положении 2р1.7, где указанный QTL является отцовским экспрессированным QTL, то есть экспрессированным из отцовского аллеля. Известно, что у человека и мыши Igf2 является импринтабельным и экспрессируется в некоторых тканях исключительно из отцовского аллеля. Анализ кДНК скелетной мышцы свиней, гетерозиготных по SNP и/или SWC9, показал, что у этих свиней сохраняется тот же самый импринтинг. Понимание эффекта родительского происхождения, характеризующего QTL, как было показано в настоящем изобретении, отныне позволяет оптимально его использовать в селекционных программах. Действительно, в настоящее время половина потомства, полученного от наиболее распространенных промышленных кроссбредов "пьетрен × крупная белая", наследует нежелательный аллель, ответственный за значительные экономические потери. Использование способа настоящего изобретения позволяет избежать этой проблемы.

Настоящее изобретение также относится к выделенной и/или рекомбинантной нуклеиновой кислоте или к ее функционал