Слитый белок, обладающий биологической активностью интерферона-альфа, димерный слитый белок, фармацевтическая композиция, их содержащая, молекула днк (варианты) и способ адресования интерферона-альфа в ткани печени

Слитый белок, обладающий биологической активностью интерферона-альфа, димерный слитый белок, фармацевтическая композиция, их содержащая, молекула днк (варианты) и способ адресования интерферона-альфа в ткани печени

Иллюстрации

Показать все

Реферат

СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка основана на приоритете предварительной заявки на патент США №60/134895, поданной в Патентное ведомство США 19 мая 1999 г., содержание которой включено сюда ссылкой на нее.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Раскрываемое в данной заявке изобретение относится к системам экспрессии слитых белков, усиливающим продуцирование белков - членов класса интерферонов-альфа. Конкретнее, настоящее изобретение относится к обеспечению высокого уровня экспрессии в клетках млекопитающих и секреции слитых белков с фрагментом иммуноглобулина Fc, таких как слитый белок состава Fc-фрагмент иммуноглобулина - интерферон-альфа, и к их различным структурным формам и применениям.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Было установлено, что семейство белков интерферонов-альфа (IFN-альфа) может быть использовано в лечении различных заболеваний. Например, интерфероны альфа-2а и 2b (торговые наименования соответственно Роферон - Roferon и Интрон А - Intron А) были применены для лечения хронических гепатитов В, С и D (опасные для жизни вирусные болезни печени), condylomata acuminate (генитальные бородавки), связанной со СПИД саркомой Капоши, лейкемии ворсинчатых клеток, злокачественной меланомы, карциномы базальных клеток, множественной миеломы, карциномы почечных клеток, герпеса I и II, ветрянки/герпеса зостер и фунгоидной гранулемы. Была также изучена эффективность лечебных схем с участием интерферона-альфа при раке простаты и хронической миелогенной лейкемии.

Семейство человеческих интерферонов-альфа является наибольшим и наиболее сложным семейством интерферонов. Члены семейства интерферонов-альфа имеют подобные аминокислотные последовательности, что определяет отличие этой группы от других интерферонов; например, эти белки обычно имеют при типичном линейном выравнивании (alignment) последовательностей степень идентичности аминокислотной последовательности не менее 35%. В банке данных SwissProt содержатся многие белки интерферонов-альфа человека, в том числе белки, называемые иначе интерферон-дельта и интерферон-омега. Эти белки обычно синтезируются с лидирующей последовательностью из примерно 23 аминокислот, а зрелые белки обычно имеют молекулярный вес приблизительно 19 кДа. Из-за схожести этих белков при получении и тщательной очистке интерферона-альфа, происходящего из человека или другого млекопитающего, часто получают смесь подвидов с различной биологической активностью [Georgiades и др. Патент США №4732683]. Подобным же образом и кДНК, кодирующие эти белки, имеют достаточно близкие размеры и свойства, так что для операций с ними в целях конструирования плазмид можно использовать один и тот же набор приемов. Поэтому могло бы оказаться полезным иметь способ эффективного продуцирования и очистки одиночных видов интерферонов-альфа, происходящих из млекопитающих.

Благодаря своему относительно малому размеру - около 19 кДа (Lawn и др. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. Т.78. С.5435) интерферон-альфа может фильтроваться почками. Однако при фильтровании интерферон-альфа обычно адсорбируется и метаболизируется трубчатыми клетками почек и поэтому обычно не выделяется из организма. В современной клинической практике интерферон-альфа в составе лекарственных средств вводят внутримышечной инъекцией, после чего его содержание в сыворотке снижается с временем полужизни около 5 ч для интерферона-альфа-2а и 2-3 ч для интерферона-альфа-2b (Physicians Desk Reference, 50^th edition. 1996. С.2145-2147 и 2364-2373).

Более того, из-за малого размера интерферонов-альфа необходимы их множественные, частые инъекции (обычно ежедневно или 3 раза в неделю) и при этом могут быть значительные колебания в содержании интерферона-альфа у различных пациентов. Кроме того, вводятся большие дозы, варьирующие от приблизительно 50 микрограмм на дозу при лейкемии ворсинчатых клеток до 300 микрограмм на дозу при связанной со СПИД саркомой Капоши. Высокие уровни циркулирующего интерферона-альфа могут давать значительные побочные эффекты, в том числе токсичность для кожи и нервной, иммунной и эндокринной систем. Полагают, что малый размер интерферона-альфа позволяет ему проходить сквозь гематоэнцефалический барьер и проникать в центральную нервную систему, что объясняет некоторые из побочных неврологических эффектов. Поэтому было бы полезным повысить действенность и эффективное время жизни интерферона-альфа в сыворотке получивших его пациентов и в то же время снизить до минимума побочное действие.

Принимая во внимание необходимость высоких доз, низкую эффективность, малое время полужизни в сыворотке, трудности очистки и побочное действие интерферона-альфа, в данной области существует потребность в способах повышения продуцирования и улучшения фармакологических свойств этого терапевтического средства.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение описывает способы и композиции, пригодные для создания и применения слитых белков, содержащих интерферон-альфа. В частности, настоящее изобретение описывает нуклеиновые кислоты, например последовательности ДНК или РНК, кодирующие слитый белок состава Fc-фрагмент иммуноглобулина-интерферон-альфа, и способы экспрессии нуклеиновой кислоты для продуцирования таких слитых белков. Слитые белки могут обеспечить высокий уровень экспрессии биологически активного интерферона-альфа. Слитый белок может быть перед введением млекопитающему, например человеку, объединен с фармацевтически приемлемым носителем. При определенных обстоятельствах интерферон-альфа перед включением в лечебный состав и/или введением может быть отщеплен от слитого белка. В качестве альтернативы последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие содержащий интерферон-альфа слитый белок, могут быть объединены с фармацевтически приемлемым носителем и введены млекопитающему.

Цель изобретения - предложить новые последовательности нуклеиновой кислоты - например ДНК или РНК, которые способствуют продуцированию и секреции интерферона-альфа. В частности, настоящее изобретение предлагает (i) последовательности нуклеиновой кислоты, которые способствуют эффективному продуцированию и секреции интерферона-альфа; (ii) конструкции нуклеиновой кислоты для быстрого и эффективного продуцирования и секреции интерферона-альфа в различных клетках-хозяевах млекопитающих; и (iii) способы продуцирования, секреции и сбора рекомбинантного интерферона-альфа или его генно-инженерных вариантов, в том числе ненативных, биосинтетических или иным образом полученных искусственных белков интерферона-альфа, таких как белки, созданные рациональным способом конструирования.

Другая цель настоящего изобретения - предложить полинуклеотидные последовательности, которые при слиянии с полинуклеотидом, кодирующим интерферон-альфа, кодируют содержащий интерферон-альфа слитый белок, который может быть очищен с помощью общепринятых реагентов и методов. Следующая цель - поместить между кассетой секреции и кодируемым белком интерферона-альфа сайт протеолитического расщепления таким образом, чтобы кассету секреции можно было отщепить от домена интерферона-альфа, в результате чего интерферон-альфа может быть очищен независимо.

Поэтому в одном из аспектов настоящее изобретение предусматривает молекулы нуклеиновой кислоты, например молекулы ДНК или РНК, которые кодируют слитый белок состава «Fc-фрагмент иммуноглобулина - интерферон-альфа». Молекула нуклеиновой кислоты кодирует последовательно в направлении от 5' к 3' сигнальную последовательность, Fc-фрагмент иммуноглобулина и по меньшей мере один целевой белок, причем целевой белок представляет собой интерферон-альфа.

В предпочтительном осуществлении Fc-фрагмент иммуноглобулина содержит шарнирную область иммуноглобулина и предпочтительно содержит по меньшей мере один домен константной части тяжелой цепи иммуноглобулина, например домен 2 константной части тяжелой цепи иммуноглобулина (СН2), домен 3 константной части тяжелой цепи иммуноглобулина (СН3) и в зависимости от типа иммуноглобулина, используемого для формирования Fc-фрагмента, но не обязательно домен 4 константной части тяжелой цепи иммуноглобулина (СН4). В более предпочтительном осуществлении Fc-фрагмент иммуноглобулина лишен по меньшей мере домена 1 константной части тяжелой цепи иммуноглобулина (СН1). Хотя Fc-фрагменты иммуноглобулина могут иметь основой любой класс иммуноглобулинов, например IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, предпочтительными являются Fc-фрагменты иммуноглобулина на основе IgG.

Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть включена в функциональной связи в способный к репликации экспрессирующий вектор, который затем можно ввести в клетку-хозяин млекопитающего, подходящую (компетентную) для продуцирования слитого белка на основе интерферона-альфа. Получаемый в результате слитый белок на основе интерферона-альфа эффективно продуцируется и секретируется из клетки-хозяина млекопитающего. Секретированный слитый белок на основе интерферона-альфа может быть извлечен из культуральной среды без лизирования клетки-хозяина млекопитающего. Можно определить активность белка-продукта, и/или очистить его необходимым образом с помощью обычных реагентов, и/или отщепить его от слитого партнера, причем все процедуры выполняются с помощью обычных методов.

В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает слитые белки, содержащие интерферон-альфа. Слитые белки по настоящему изобретению проявляют улучшенные биологические свойства по сравнению с нативным интерфероном-альфа, такие как повышенную растворимость, более длительное время полужизни в сыворотке и повышенное связывание со своим рецептором. Эти свойства могут существенно повысить клиническую эффективность интерферона-альфа. В предпочтительном варианте осуществления слитый белок содержит в направлении от N-конца к С-концу Fc-фрагмент иммуноглобулина и интерферон-альфа вместе с другими участками, например сайтом протеолитического расщепления, помещенного (но необязательно) между Fc-фрагментом иммуноглобулина и интерфероном-альфа. Получаемый таким образом слитый белок предпочтительно синтезируется в клетке, которая гликозилирует Fc-фрагмент в нормальных местах гликозилирования, т.е. в местах, обычно существующих в исходных антителах.

В ином варианте осуществления слитый белок может содержать второй целевой белок, например зрелый интерферон-альфа полной длины или его биологически активный фрагмент. В этом типе конструкции первый и второй целевые белки могут быть одинаковыми или разными белками. Первый и второй целевые белки могут быть соединены вместе либо непосредственно, либо с помощью полипептидного мостика. В качестве альтернативы оба целевых белка могут быть соединены либо непосредственно, либо с помощью полипептидного мостика с Fc-фрагментом иммуноглобулина. В последнем случае первый целевой белок может быть присоединен к N-концу Fc-фрагмента иммуноглобулина, а второй целевой белок присоединен к С-концу Fc-фрагмента иммуноглобулина.

В другом варианте осуществления два слитых белка могут быть соединены или ковалентно, например, дисульфидной связью, пептидной связью или сшивающим агентом, или нековалентно с получением димерного белка. В предпочтительном варианте осуществления два слитых белка соединены ковалентно с помощью по меньшей мере одной, а предпочтительнее с помощью двух межцепных дисульфидных связей между остатками цистеина, предпочтительно расположенными внутри шарнирных областей иммуноглобулина, находящихся внутри Fc-фрагментов иммуноглобулина каждой из цепей.

Еще одна цель настоящего изобретения - обеспечить поливалентные и мультимерные формы слитых белков с интерфероном-альфа и их комбинации.

В другом аспекте настоящее изобретение предлагает способы продуцирования слитых белков, содержащих Fc-фрагмент иммуноглобулина и целевой белок. Способ включает этапы: (а) создания клетки млекопитающего, которая содержит молекулу ДНК, кодирующую такой слитый белок, вместе с сигнальной последовательностью или без нее, и (b) культивирования клетки млекопитающего для продуцирования слитого белка. Получаемый в результате слитый белок может быть собран, упорядочен (свернут) заново, если необходимо, и очищен с использованием обычных методов очистки, хорошо известных и используемых в данной области. Если допустить, что слитый белок содержит сайт протеолитического расщепления, расположенный между Fc-фрагментом иммуноглобулина и целевым белком, тогда целевой белок может быть отщеплен от слитого белка с помощью обычных протеолитических ферментов и при необходимости очищен перед использованием.

В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает способы лечения болезненных состояний, поддающихся облегчению с помощью интерферона-альфа или его активных вариантов, путем введения млекопитающему эффективного количества интерферона-альфа, производимого способом по настоящему изобретению, и/или слитой конструкции по настоящему изобретению. Настоящее изобретение предлагает также способы лечения болезненных состояний, поддающихся облегчению с помощью интерферона-альфа или его активных вариантов, путем введения имеющему такое состояние млекопитающему нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, например «голой ДНК» или вектора, содержащего ДНК или РНК по настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте осуществления конструкции по настоящему изобретению могут быть применены для лечения расстройства печени, причем интерферон-альфа благодаря Fc-фрагменту иммуноглобулина попадает в печень. Конструкции по настоящему изобретению могут быть особенно полезны в лечении расстройств печени, которые включают (но не ограничиваются ими) вирусные заболевания, такие как гепатит В, гепатит С или гепатит D, рак печени, а также другие типы рака, дающие локализованные в печени метастазы.

Вышеизложенное и другие цели, отличительные особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из нижеследующих описания, чертежей и формулы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1А -1С дают схематическую иллюстрацию неограничивающих примеров слитых белков, сконструированных согласно настоящему изобретению.

Фиг.2 - график, показывающий кривые выживания для групп мышей SCID, которым путем инъекции были введены клетки Daudi и которые затем подвергались лечению слитым белком huFc-hulFN-alpha (составленным из Fc-фрагмента иммукоглобулина человека и интерферона-альфа человека). В день начала отсчета (день 0) мышам были инъецированы клетки Daudi. В дни 3-8 группам по 8 мышей инъецировали PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) (ромбики), 30 мкг huFc-hulFN-alpha (крестики) или 60 мкг huFc-hulFN-alpha (треугольники).

Фиг.3 - график, показывающий скорость роста подкожных опухолей, вызванных клетками Daudi у мышей SCID, которым вводили huFc-hulFN-alpha. Приблизительно за 4 недели до лечения мышам инъецировали подкожно клетки Daudi. После того как клетки Daudi прорастали с образованием опухолей размером 200-400 мм³, формировали группы по 8 мышей и вводили им в течение 6 дней PBS (ромбики), 30 мкг huFc-hulFN-alpha в PBS (квадраты) или 60 мкг huFc-hulFN-alpha в PBS (треугольники).

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ

ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Многие болезненные состояния могут быть облегчены введением интерферона-альфа. Например, как обсуждалось выше, интерфероны альфа-2а и 2b (торговые наименования соответственно Roferon и Intron А) могут быть полезны для лечения хронических гепатитов В, С и D, condylomata acuminata (генитальные бородавки), связанной со СПИД саркомой Капоши, лейкемии ворсинчатых клеток, злокачественной меланомы, карциномы базальных клеток, множественной миеломы, карциномы почечных клеток, герпеса I и II, ветрянки/герпеса зостер (опоясывающего) и фунгоидной гранулемы. Были также проведены исследования для оценки эффективности интерферона-альфа в лечении рака простаты и хронической миелогенной лейкемии.

Например, для лечения гепатита особенно полезным может быть наличие формы интерферона-альфа, которая концентрируется в печени. Таким путем концентрация интерферона-альфа в других тканях может быть сведена к минимуму, что уменьшает побочные эффекты. Ткань печени представляет собой первичный центр удаления растворимых иммунных комплексов, и макрофаги печени (клетки Купфера) богаты рецепторами для Fc (Benacerraf В. и др. // J. Immunol. 1959. Т.82. С.131; Paul W.E. // Fundamentals of Immunology, 3^rd ed. ch.5. С.113-116). Поэтому путем слияния интерферона-альфа с Fc-фрагментом иммуноглобулина молекулу интерферона-альфа можно направить предпочтительно в ткань печени, что нельзя сделать с такой же молекулой интерферона-альфа, лишенной Fc-фрагмента иммуноглобулина. Тип IgG антител, имеющий наибольшее сродство к рецепторам для Fc, - это lgG1. Однако в противоположность этому lgG4, например, имеет приблизительно в 10 раз более низкое сродство к рецептору I Fc-гамма (Anderson and Abraham // J. Immunol. 1980. Т.125. С.2735; Woof и др. // Mol. Immunol. 1986. Т.23. С.319). Фрагмент Fc-гамма 1 из lgG1 будучи помещен на С-конце лиганда может вызывать зависящую от антител опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC) по отношению к клеткам, экспрессирующим рецептор для этого лиганда. Кроме того, если Fc-гамма 1 находится на С-конце лиганда, он может участвовать в связывании C1q и фиксации (связывании) комплемента, выработанного против клеток, экспрессирующих рецептор для этого лиганда.

В противоположность lgG1 lgG4 не фиксирует комплемент достаточно эффективно. На этом основании сделано предположение, что N-концевой интерферон-альфа может быть слит с С-концевым Fc-фрагментом из lgG4 (Chang T.W. и др. Патент США №5723125). Однако, если Fc-фрагмент иммуноглобулина lgG4 отделен от Fab-фрагмента, Fc lgG4 фиксирует комплемент так же хорошо, как и Fc-фрагмент lgG1 (Isenman D.E. и др. // J. Immunol. 1975. Т.114. С.1726). На основании этого результата и близкого сходства последовательностей для Fc-фрагментов lgG1, не вдаваясь в теорию, сделано предположение, что фрагмент Fab lgG4 блокирует связывание C1q и фиксацию комплемента путем пространственного (стерического) запрета, так как шарнирная область, соединяющая фрагменты Fab и Fc иммуноглобулина lgG4, короче, чем шарнирная область lgG1. Предполагается, что если большой, громоздкий Fab-фрагмент иммуноглобулина lgG4 заменить небольшой молекулой, такой как молекула интерферона-альфа, и интерферон-альфа и Fc-фрагмент соединить гибким мостиком, такой слитый белок интерферон-альфа-Fc-гамма-4 будет фиксировать комплемент при связывании с клетками, имеющими рецепторы для интерферона-альфа.

Цитотоксический эффект вследствие слияния N-концевого цитокина с С-концевым Fc-фрагментом хорошо известен. Например, слияние цитокина - интерлейкина-2 (IL-2) с Fc-фрагментом дает молекулу, фиксирующую комплемент и приводящую к лизису клеток, имеющих рецептор для IL-2 (Landolfi N.F. Патент США №5349053).

Слияния, в которых Fc-фрагмент помещен на N-конце лиганда (названные "иммунофузинами" или слияниями "Fc-X", где Х обозначает лиганд, такой как интерферон-альфа), имеют много характерных, полезных биологических свойств (Lo и др. Патенты США №5726044 и №5541087; Lo и др. // Protein Engineering. 1998. Т.11. С.495). В частности, такие слитые белки могут сохранять способность к связыванию с соответствующими рецепторами для Fc на поверхности клеток. Но если лиганд связывается со своим рецептором на поверхности клетки, ориентация Fc-фрагмента меняется и оказывается, что последовательности, отвечающие за ADCC и фиксацию комплемента, становятся недоступными. В результате Fc-фрагмент в молекуле Fc-X не участвует эффективно в ADCC и фиксации комплемента. Поэтому ожидается, что слияния Fc-X будут иметь полезное свойство - увеличенное время полужизни в сыворотке и относительно более высокую концентрацию в печени с незначительными вредными проявлениями ADCC и фиксации комплемента.

Одно из свойств конструкций Fc-X настоящего изобретения состоит в концентрировании целевого белка - в данном случае интерферона-альфа в печени. Fc-фрагмент цепей гамма-1 и гамма-3 проявляет наивысшее сродство к рецептору для Fc, тогда как цепь гамма-4 имеет сниженное сродство, а цепь гамма-2 обнаруживает крайне низкое сродство к рецептору для Fc. Поэтому Fc-фрагменты, полученные из цепей гамма-1 или гамма-3, предпочтительно используются в конструкциях Fc-X по настоящему изобретению, так как они обладают наивысшим сродством к рецепторам Fc и поэтому могут адресовать интерферон-альфа преимущественно в ткани печени. Это отличает их от белка типа X-Fc, например от слитого белка интерферон-альфа-Fc, у которого потенциальное удобство концентрирования в печени должно уравновешиваться тем фактом, что этот слитый белок может быть посредником в эффекторных функциях, а именно в фиксации комплемента и ADCC, направленных против клеток, имеющих рецепторы для интерферона-альфа.

Таким образом, изобретение предусматривает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые белки, и аминокислотные последовательности, определяющие слитые белки, которые содержат Fc-фрагмент иммуноглобулина и по меньшей мере один целевой белок, который здесь определен как интерферон-альфа. На фигурах 1А-1С проиллюстрированы три типичных варианта осуществления белковых конструкций, воплощающих настоящее изобретение. Поскольку предпочтительны димерные конструкции, все эти проиллюстрированные случаи представляют собой димеры, сшитые парой дисульфидных связей между цистеинами смежных субъединиц. На чертежах изображены дисульфидные связи, соединяющие два Fc-фрагмента тяжелой цепи иммуноглобулина через шарнирные области, находящиеся в каждой из тяжелых цепей, и это характерно для нативных форм этих молекул. Хотя предпочтительными являются конструкции, содержащие шарнирную область Fc, и было показано, что они перспективны как терапевтические агенты, изобретение подразумевает, что при необходимости сшивки могут быть осуществлены в других положениях. Кроме того, в некоторых случаях димеры или мультимеры, пригодные в применении настоящего изобретения, могут быть получены путем нековалентного соединения, например с помощью гидрофобных взаимодействий. Поскольку гомодимерные конструкции являются важными вариантами осуществления настоящего изобретения, на чертежах приведены такие конструкции. Необходимо, однако, принимать во внимание, что гетеродимерные конструкции также пригодны для применения в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг.1А показана димерная конструкция, полученная в соответствии с принципами, указанными здесь далее (см., например, пример 1). Каждый мономер в гомодимере содержит Fc-фрагмент (1) иммуноглобулина, включая шарнирную область, домен СН2 и домен СН3. Непосредственно к С-концу Fc-фрагмента с помощью пептидной связи присоединен интерферон-альфа (2). Следует понимать, что Fc-фрагмент может быть присоединен к целевому белку через полипептидный мостик (не показан).

Фигуры 1В и 1С изображают белковые конструкции по настоящему изобретению, включающие в качестве целевого белка несколько белков интерферона-альфа, расположенных в виде тандема и соединенных мостиком. На фиг.1В целевой белок содержит интерферон-альфа полной длины (2), полипептидный мостик, составленный из остатков глицина и серина (4), и активный вариант интерферона-альфа (3). Конструкция на фиг.1С отличается от конструкции на фиг.1В тем, что большая часть С-концевого домена белка представляет собой вторую копию полной длины интерферона-альфа (2). Хотя фиг.1А-1С показывают конструкции Fc-X, где Х обозначает целевой белок, подразумевается, что полезные белки настоящего изобретения могут быть также обозначены формулой X-Fc-X, где буквами Х могут быть обозначены одни и те же или различные целевые белки.

В том смысле, как он использован здесь, под термином «полипептидный мостик» понимают полипептидную последовательность, которая может соединять два белка, в естественных условиях не соединенные вместе. Полипептидный мостик преимущественно содержит множество аминокислот, таких как аланин, глицин и серин, или комбинации таких аминокислот. Предпочтительно полипептидный мостик содержит набор глициновых и сериновых пептидов длиной примерно 10-15 остатков (см., например, патент США №5258698). Предполагается, однако, что оптимальные длина мостика и его аминокислотный состав могут быть определены обычным экспериментальным путем.

В том смысле, как он использован здесь, термин «мультивалентный» относится к рекомбинантной молекуле, которая включает два или более биологически активных сегмента. Белковые фрагменты, образующие мультивалентную молекулу, могут быть соединены (но не обязательно) полипептидным мостиком, который присоединен к составляющим частям и позволяет каждой из них функционировать независимо.

В том смысле, как он использован здесь, термин «бивалентный» относится к мультивалентной рекомбинантной молекуле, имеющей конфигурацию Fc-X или X-Fc, где Х - целевая молекула. Fc-фрагменты иммуноглобулина могут быть соединены, например, межцепными дисульфидными связями, образуя конструкции типа показанной на фиг.1А. Если слитая конструкция по настоящему изобретению имеет конфигурацию Fc-X-X, получаемая в результате молекула с Fc показана на фиг.1С. Два целевых белка могут быть соединены пептидным мостиком. Конструкции типа показанных на фиг.1А могут иметь повышенное кажущееся сродство в связывании между целевой молекулой и ее рецептором.

В том смысле, как он использован здесь, термин «мультимерный» относится к стабильному соединению двух или более полипептидных цепей либо ковалентно, например, путем ковалентного взаимодействия, например, с помощью дисульфидной связи, или нековалентно, например, путем гидрофобного взаимодействия. Подразумевается, что термин «мультимер» включает как гомомультимеры, где субъединицы одни и те же, так и гетеромультимеры, где субъединицы различны.

В том смысле, как он использован здесь, термин «димерный» относится к специфической мультимерной молекуле, в которой две полипептидные цепи стабильно соединены с участием ковалентных или нековалентных взаимодействий. Такие конструкции схематически изображены на фиг.1А. Следует понимать, что образование димера типично для Fc-фрагмента, включающего по меньшей мере часть шарнирной области, домен СН2 и домен СН3. Известно, что многие белковые лиганды связываются со своими рецепторами в виде димеров. Если димеризация белкового лиганда Х естественна, часть Х в молекуле Fc-X будет димеризоваться в гораздо большей степени, поскольку процесс димеризации зависит от концентрации. Физическая сближенность двух частей X, соединенных Fc, превращает димеризацию во внутримолекулярный процесс, сильно сдвигая равновесие в сторону образования димера и усиливая его связывание с рецептором.

Понятно, что в том смысле, как он использован здесь, термин «интерферон-альфа» означает не только зрелый интерферон-альфа полной длины, например интерферон-альфа 1 человека (SEQ ID NO: 8), интерферон-альфа 2 человека (SEQ ID NO: 9), интерферон-альфа 4 человека (SEQ ID NO: 10), интерферон-альфа 5 человека (SEQ ID NO: 11), интерферон-альфа 6 человека (SEQ ID NO: 12), интерферон-альфа 7 человека (SEQ ID NO: 13), интерферон-альфа 8 человека (SEQ ID NO: 14), интерферон-альфа 10 человека (SEQ ID NO: 15), интерферон-альфа 14 человека (SEQ ID NO: 16), интерферон-альфа 16 человека (SEQ ID NO: 17), интерферон-альфа 17 человека (SEQ ID NO: 18), интерферон-альфа 21 человека (SEQ ID NO: 19), интерферон дельта-1 (SEQ ID NO: 20), II-1 (интерферон омега-1) (SEQ ID NO: 21); а также интерферон-альфа 1 мыши (SEQ ID NO: 22), интерферон-альфа 2 мыши (SEQ ID NO: 23), интерферон-альфа 4 мыши (SEQ ID NO: 24), интерферон-альфа 5 мыши (SEQ ID NO: 25), интерферон-альфа 6 мыши (SEQ ID NO: 26), интерферон-альфа 7 мыши (SEQ ID NO: 27), интерферон-альфа 8 мыши (SEQ ID NO: 28) и интерферон-альфа 9 мыши (SEQ ID NO: 29); но также и их варианты и биологически активные фрагменты. Известные последовательности интерферона-альфа можно найти в банке данных GenBank.

Термин «биологически активный фрагмент» относится к любому фрагменту белка интерферона-альфа, который имеет не менее 50%, более предпочтительно не менее 70% и наиболее предпочтительно не менее 90% биологической активности (определенной методом ингибирования пролиферации клеток по примеру 4) образцового белка интерферона-альфа человека с последовательностью SEQ ID NO: 2. Термин «варианты» включает виды и аллельные варианты, а также другие встречающиеся в природе или неприродные варианты, например, полученные методами генетической инженерии, которые имеют степень подобия не менее 70% или степень идентичности не менее 60%, более предпочтительно не менее 75% подобия или 65% идентичности, наиболее предпочтительно не менее 80% подобия или 70% идентичности со зрелым белком интерферона-альфа человека, представленным SEQ ID NO: 2.

Чтобы определить, имеет ли рассматриваемый белок необходимую процентную степень подобия или идентичности с референсным полипептидом, рассматриваемую аминокислотную последовательность и референсную аминокислотную последовательность вначале располагают параллельно с помощью алгоритма динамического программирования, описанного в работе Smith and Waterman // J. Mol. Biol. 1981. Т.147. С.195-197, в комбинации с матрицей замещений BLOSUM62, описанной на фиг.2 работы Henikoff and Henikoff. "Amino acid substitution matrices from protein blocks". // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. Т.89. С.10915-10919. В настоящем изобретении для недопустимости вставки в пробел (gap insertion penalty) принята величина 12, а для недопустимости расширения пробела (gap extension penalty) принята величина 4. Компьютерные программы, осуществляющие параллельные выравнивания (alignments) последовательностей с помощью алгоритма Смита-Уотермана (Smith-Waterman) и матрицы BLOSUM62, такие как программное обеспечение GCG (Oxford Molecular Group, Oxford, England), имеются в продаже и широко используются специалистами в данной области.

Осуществив параллельное выравнивание рассматриваемой и референсной последовательностей, можно вычислить значения процента подобия. Индивидуальные аминокислоты каждой последовательности последовательно сравниваются попарно с определением их подобия друг другу. Если значение в матрице BLOSUM62, соответствующее данной паре выровненных аминокислот, равно нулю или отрицательной величине, значение попарного подобия равно нулю; в ином случае значение попарного подобия равно 1,0. Общее значение подобия равно сумме значений попарного подобия выровненных параллельно аминокислот. Затем общее значение подобия нормализуют путем деления его на число аминокислот в более короткой из рассматриваемой и референсной последовательностей. Нормализованное общее значение подобия составляет процент подобия. В качестве альтернативы для вычисления процента идентичности снова попарно сопоставляют последовательно аминокислоты в каждой из выровненных параллельно последовательностей. Если аминокислоты не идентичны, значение попарной идентичности равно нулю; в ином случае значение попарной идентичности равно 1,0. Общее значение идентичности равно сумме значений идентичности выровненных аминокислот. Затем общее значение идентичности нормализуют путем деления его на число аминокислот в более короткой из рассматриваемой и референсной последовательностей. Нормализованное общее значение идентичности составляет процент идентичности. При вычислении процента подобия и идентичности вставки и делеции игнорируют. Поэтому значения недопустимости для просветов в этих вычислениях не используют, хотя они используются при первичном параллельном выравнивании.

Варианты могут также включать другие мутантные белки интерферона-альфа, имеющие подобную интерферону-альфа активность. Виды и аллельные варианты включают (но не ограничиваются ими) последовательности интерферона-альфа человека и мыши. Варианты интерферона-альфа человека представлены в последовательностях SEQ ID NOS: 8-21, а варианты интерферона-альфа мыши представлены в последовательностях SEQ ID NOS: 22-29.

Кроме этого, последовательность интерферона-альфа может представлять собой часть консенсусной последовательности или всю ее, представленную далее как SEQ ID NO: 7, где интерферон-альфа имеет не менее 50%, более предпочтительно не менее 70% и наиболее предпочтительно не менее 90% биологической активности (определенной методом ингибирования пролиферации клеток по примеру 4) зрелого белка интерферона-альфа человека с последовательностью SEQ ID NO: 2.

Эти белки очень похоже ведут себя в процессе очистки и имеют другие сходные биологические свойства. В частности, манипуляции с ДНК, экспрессия слитого белка и свойства слитого белка в процессе очистки для белков Fc-интерферон-альфа чрезвычайно похожи. Например, интерферон-альфа-2а человека и интерферон-альфа-2b человека различаются только одной аминокислотой, причем интерферон-альфа-2а имеет остаток лизина в том положении, где интерферон-альфа-2b имеет остаток аргинина. Интерферон-альфа-2а человека и интерферон-альфа-2b человека имеют чрезвычайно похожие свойства и взаимозаменяемы при всех известных целях их использования.

Трехмерная пространственная структура интерферона-альфа была определена с помощью рентгеновской кристаллографии (Ramaswamy и др. // Structure. 1986. Т.4. С.1453). Аминокислотные последовательности белков интерферонов-альфа столь близки, что определенную структуру считают структурой всего семейства белков. Трехмерная структура интерферона-альфа, подобно структуре интерферона-бета, представляет собой димер с ионом цинка на поверхности димера. Однако в растворе интерферон-альфа ведет себя как мономер. На основании аналогии с цитокином IL-6 и другими белковыми лигандами было высказано предположение, что интерферон-альфа может димеризоваться при связывании с рецептором (Radhakrishnan R. и др. // Structure. 1996. Т.4. С.1453; Karpusas М. и др. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1997. Т.94. С.11813).

Димеризация лиганда может повышать кажущееся сродство в связывании между лигандом и его рецептором. Например, если один участок интерферона-альфа слитого белка Fc-Интерферон-альфа свяжется с рецептором клетки с определенным сродством (аффинностью), то второй участок интерферона-альфа того же самого слитого белка Fc-Интерферон-альфа может связаться со вторым рецептором той же клетки с гораздо большим стремлением к связыванию (avidity - кажущееся сродство). Причиной этого может быть физическое сближение второго участка интерферона-альфа с рецептором после того, как уже связался первый участок интерферона-альфа. В случае связывания антитела с антигеном кажущееся сродство может увеличиваться не меньше чем в 10 тысяч, т.е. в 10⁴ раз. Каждая белковая субъединица, т.е. "X", имеет свою собственную независимую функцию, так что в мультивалентной молекуле функции белковых субъединиц могут быть аддитивными или синергическими. Поэтому слияние естественно димерной молекулы Fc с интерфероном-альфа может усиливать активность интерферона-альфа. Соответственно конструкции типа показанных на фиг.1А могут повышать кажущееся сродство связывания между интерфероном-альфа и его рецептором.

Раскрываемые в данной заявке целевые белки экспрессируются в виде слитых белков с Fc-фрагментом иммуноглобулина. Как известно, каждая константная область тяжелой цепи иммуноглобулина содержит четыре или пять доменов. Домены последовательно имеют следующие обозначения: СH1-шарнир-СН2-СН3(-СН4). Нуклеотидные последовательности ДНК доменов тяжелой цепи имеют перекрестную гомологию в пределах классов иммуноглобулинов, например домен СН2 IgG гомологичен домену СН2 IgA и IgD и домену СН3 IgM и IgE.

Понятно, что термин «Fc-фрагмент иммуноглобулина» в том смысле, как он использован здесь, означает карбоксильно-концевую часть константной области цепи иммуноглобулина, предпочтительно константную область тяжелой цепи иммуноглобулина или ее часть. Например, Fc-фрагмент иммуноглобулина может содержать: (1) домен СН1, домен СН2 и домен СН3; (2) домен СН1 и домен СН2; (3) домен СН1 и домен СНЗ; (4) домен СН2 и домен СН3 или (5) комбинацию двух или более доменов и шарнирную область иммуноглобулина. В предпочтительном осуществлении Fc-фрагмент иммуноглобулина включает по меньшей мере шарнирную область иммуноглобулина, домен СН2 и домен СНЗ и предпочтительно лишен домена СН1.

Общепринятым предпочтительным классом иммуноглобулина, из которого происходит константная область тяжелой цепи, является IgG (Igγ) (γ подклассы 1, 2, 3 или 4). Нуклеотидная и аминокислотная последовательности Fc γ-1 человека приведены далее как последовательности ID №№3 и 4. Могут быть использованы другие классы иммуноглобулинов - IgA (Igα), IgD (Igδ), IgE (Igε) и IgM (Igμ). Выбор подходящих константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина подробно обсуждается