Лечение грибковой инфекции противогрибковыми препаратами из группы полиенов или ингибиторов -глюкансинтазы в комбинации с анти-hsp90-антителами

Лечение грибковой инфекции противогрибковыми препаратами из группы полиенов или ингибиторов -глюкансинтазы в комбинации с анти-hsp90-антителами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым композициям и препаратам, которые являются эффективными противогрибковыми агентами, и новому антителу, которое можно включать в композиции и препараты.

Грибковые инфекции являются важной причиной смертности пациентов в отделении интенсивной терапии и чаще всего у иммунологически «скомпрометированных» и ослабленных пациентов (Gold J.W.M., 1984, Am. J. Med. 76: 458-463; Klein, R.S. et al., 1984, N. Engl. J. Med. 311: 354-357; Burnie J.P., 1997, Current Anaesthesia & Critical Care 8: 180-183). Наличие и устойчивость грибковых инфекций могут быть отнесены за счет избирательного воздействия противогрибковых препаратов широкого спектра действия, часто длительного пребывания пациентов в таких условиях, как отделение интенсивной терапии, проблем при диагностике инфекций и отсутствия эффективности противогрибковых агентов, используемых при лечении. Несмотря на то что строгий гигиенический контроль может привести к некоторой профилактике грибковых инфекций в больнице или другой среде, вспышки инфекций остаются серьезной проблемой и нуждаются в обращении к ним.

Системные грибковые инфекции, такие как инвазивный кандидоз и инвазивный аспергиллез, могут вызываться различными грибковыми патогенами, например вирулентными видами Candida, С. albicans, С. tropicalis и С. krusei, и менее вирулентными видами С. parapsilosis и Torulopsis glabrata (последний в некоторых источниках относят к Candida glabrata). Несмотря на то что С. albicans ранее представлял наиболее распространенный изолят грибков, получаемый из отделений интенсивной терапии, в недавних исследованиях было показано, что С. tropicalis, С. glabrata, С. parapsilosis и С. krusei в настоящее время составляют примерно половину таких изолятов (Pfaller М.А. et al., 1998, J. Clin. Microbiol. 36: 1886-1889; Pavese P. et al., 1999, Pathol. Biol. 46: 579-583). Возрастание видов, не относящихся к albicans, означает появление видов Candida, устойчивых к обычной противогрибковой терапии (Walsh T.J. et al., New Eng. J. Med. 340: 764-771).

Обнаружение и диагностика грибкового патогена, ответственного за инфекцию, являются критическими для последующей терапии, поскольку противогрибковые агенты могут быть более эффективными против определенных штаммов. В GB2240979 и ЕР0406029 (здесь полностью включены для сведения) раскрыты грибковый стрессовый белок и антитело к нему, которые можно использовать в чувствительном и высокоспецифичнсм тесте для обнаружения грибковых патогенов.

Традиционно С. albicans, С. tropicalis и С. parapsilosis лечат противогрибковым препаратом амфотерицином В, считающимся «золотым стандартом» системной противогрибковой терапии (Burnie J.P., 1997, выше). К сожалению, амфотерицин В сам по себе является высокотоксичным, и его применение ограничивается в результате проявления побочных эффектов, включая озноб, лихорадку, миалгию или тромбофлебит. Другие противогрибковые агенты включают азоловые препараты для перорального введения (миконазол, кетоконазол, итраконазол, флуконазол) и 5-фторцитозин. Однако такие виды грибков, как С. karusei и Т. glabrata, являются резистентными к флуконазолу, и часто эти виды присутствуют у пациентов, которым данный препарат вводили в профилактических целях. Кроме того, сообщалось о резистентных к флуконазолу штаммах С. albicans (Opportunistic Pathogens, 1997, 1: 27-31). Таким образом, несмотря на недавние достижения, сделанные в области лечебных препаратов таких, как флуконазол, итраконазол и системные липосомальные варианты амфотерицина В (Burnie J.P., 1997, выше), остается актуальной потребность в эффективных лекарственных препаратах для лечения грибковых инфекций.

Настоящее изобретение направлено на вышеуказанную потребность в новой композиции, которая представляет значительное усовершенствование по сравнению с противогрибковыми агентами предшествующего уровня для лечения грибковых инфекций у человека и животных, и также нового антитела, которое можно включить в композицию. Композиция по настоящему изобретению включает антитело, которое может связываться с одним или более эпитопом грибкового стрессового белка, в комбинации с известными противогрибковыми препаратами. Заявители с удивлением обнаружили, что эффективность противогрибковых препаратов против грибковых инфекций значительно повышается, что дает возможность проводить лечение в более низких дозах или осуществлять более эффективное лечение в той же дозе, позволяя снизить проявление нежелательных побочных эффектов. Кроме того, композиция по настоящему изобретению позволяет эффективно лечить грибковые инфекции, которые в своей основе резистентны к противогрибковому агенту, использованному в композиции.

По настоящему изобретению обеспечивается применение композиции, включающей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфические к одному или более эпитопов грибкового стрессового белка, и противогрибковый агент, включающий по меньшей мере один из группы, состоящей из полиенового противогрибкового агента и эхинокандинового противогрибкового агента, в способе производства лекарственного препарата для лечения грибковых инфекций, где грибок, вызывающий указанную грибковую инфекцию, является резистентным к указанному противогрибковому агенту per se.

Дополнительно по настоящему изобретению обеспечивается комбинированный препарат для одновременного, раздельного или последовательного применения при лечении грибковых инфекций, включающий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфические к одному или более эпитопов грибкового стрессового белка, и противогрибковый агент, включающий по меньшей мере один из группы, состоящей из полиенового противогрибкового агента и эхинокандинового противогрибкового агента, где грибок, вызывающий указанную грибковую инфекцию, является резистентным к указанному противогрибковому агенту per se.

Антитело может быть специфическим к белку теплового шока представителей родов Candida или Torulopsis (обычно рода Candida или Torulopsis считаются синонимами). В частности, антитело может быть специфическим к белку теплового шока, включающему hsp90 из Candida albicans, как описано в GB 2240979 и ЕР 0406029.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть специфическими к эпитопу, включающему последовательность SEQ ID NO:1.

Антитела, их производство и применение хорошо известны и раскрыты, например, у Harlow Е. и Lane D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999.

Антитела можно получать с использованием стандартных способов, известных в данной области. Примеры антител включают (но не ограничиваются) поликлокальные, моноклональные, химерные, одноцепочечные, Fab-фрагменты, фрагменты, полученные экспрессией Fab-библиотеки, и антигенсвязывающие фрагменты антител.

Антитела могут быть продуцированы рядом хозяев, например овцами, кроликами, крысами, мышами, людьми и другими. Их можно иммунизировать введением белка теплового шока из рода Candida, например hsp90 из С. albicans или его любыми фрагментами или олигопептидами, которые обладают иммуногенными свойствами. В зависимости от вида хозяина можно использовать различные адъюванты для усиления иммунологического ответа. Такие адъюванты включают, но не ограничиваются, адъювант Фрейнда, минеральные гели, такие как гидроокись алюминия, и поверхностно-активные вещества такие, как лизолецитин, плуроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин и динитрофенол. Среди адъювантов, используемых у людей, BCG (Bacille Calmette-Guerin) и Corynebacterium parvum являются особенно пригодными.

Моноклональные антитела к белку теплового шока из рода Candida, например hsp90 из С. albicans, или его любому фрагменту или олигопептиду можно получить с использованием любого способа, который обеспечивает продукцию антител стабильными клеточными линиями в культуре. Они включают, но не ограничиваются, гибридомный метод, метод с человеческой В-клеточной гибридомой и EBV-гибридомный метод (Koehler et al., 1975, Nature, 256: 495-497; Kosbor et al., 1983; Immunol. Today 4: 72; Cote et al., 1983, PNAS USA, 80: 2026-2030; Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., New York, pp.77-96).

Кроме того, можно использовать методы, разработанные для получения «химерных антител», сплайсинг генов мышиных антител в гены человеческих антител с получением молекулы с соответствующей антигенной специфичностью и биологической активностью (Morrison et al., 1984, PNAS USA, 81: 6851-6855; Neuberger et al., Nature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454). Альтернативно можно адаптировать способы, описанные для получения антител с одной цепью, с использованием известных в данной области методов для получения антител с одной цепью, специфической к белку теплового шока из Candida. Можно получить антитела с близкой специфичностью, но другого идиотипического состава, перестановкой цепи из рандомизированных комбинаторных библиотек иммуноглобулинов (Burton D.R., PNAS USA, 88: 11120-11123).

Можно также получить антитела за счет индуцирования образования их in vivo в популяции лимфоцитов или скринингом библиотек рекомбинантных иммуноглобулинов или с использованием реагентов с высокоспецифическим связыванием (Orlandi et al., 1989, PNAS USA, 86: 3833-3837; Winter G. et al., 1991, Nature, 349: 293-299).

Можно также приготовить антигенсвязывающие фрагменты, например, F(ab')2-фрагменты, которые можно получить расщеплением пепсином молекулы антитела, и Fab-фрагменты, которые можно получить восстановлением дисульфидных мостиков F(ab')2-фрагментов. Альтернативно можно сконструировать библиотеки экспрессируемых последовательностей Fab для быстрой и простой идентификации моноклональных Fab-фрагментов с желаемой специфичностью (Huse et al., 1989, Science, 256: 1275-1281).

Для скрининга, с целью идентификации антител, обладающих желаемой специфичностью, можно использовать различные иммуноанализы. В данной области хорошо известны многочисленные методики для конкурентного связывания и радиоиммуноанализа с использованием поликлональных или моноклональных антител с установленной специфичностью. Такие иммуноанализы обычно включают регистрацию образования комплекса белка теплового шока из рода Candida, например hsp90 из С. albicans, или его любого фрагмента или олигопептида, с его специфическим антителом. Можно использовать двухстадийный иммуноанализ с моноклональными антителами с использованием моноклональных антител, специфических к двум не взаимодействующим эпитопам белка теплового шока, но также можно использовать метод конкурентного связывания (Maddox et al., 1983, J. Exp. Med., 158: 1211-1216).

Антитело может включать последовательность SEQ ID NO:2.

Полиеновый противогрибковый агент может включать, например, амфотерицин В, производное амфотерицина В или нистатин. Производные амфотерицина В включают такие композиции, как АмБисом (Ambisom) (например, поставляемый, NexStar Pharmaceuticals, Cambridge, Великобритания), липидный комплекс амфотерицина-В (абельцет (Abelcet)), коллоидную дисперсию амфотерицина-В (амфоцил (Amphocil)) и эмульсию внутрилипидного амфотерицина В (Burnie J.P., 1997, выше). Амфотерицин В можно применять в комбинации с другим противогрибковым агентом, таким как 5-фторцитозином (Burnie J.P., 1997, выше).

Эхинокандиновым противогрибковым агентом может быть, например, анидулафунгин (Anidulafungin) (LY303366; Eli Lilly & Co., Indianapolis, США). Эхинокандины представляют собой циклические липопептиды, которые ингибируют синтез β-1,3-глюкана в грибках (Redding J.A. et al., 1998, Antimicrob. Agents Chemo. Ther. 42(3): 1187-1194).

Грибковыми инфекциями, которые можно лечить композицией или комбинированным препаратом, могут быть мукоромикоз, бластомикоз, кокцидиоидомикоз или паракокцидиоидомикоз, или если возбудителем грибковой инфекции являлись Candida, Cryptococcus, Histoplasma, Aspergillus или Torulopsis. Термин «кокцидиоидомикоз» также относится к «кокцидиомикозу» и термин «паракокцидиоидомикоз» представляет синоним «паракокцидомикоза».

Грибковая инфекция может быть резистентной к противогрибковому агенту per se, т.е. грибковыми инфекциями, которые по своей природе не поддаются лечению специфическими агентами, поскольку специфический противогрибковый агент не эффективен при традиционном применении его одного.

Также представляется композиция или комбинированный препарат, как здесь описано, для применения в способе лечения грибковых инфекций человека или животного.

Также представляется способ производства лекарственного препарата для лечения грибковых инфекций человека или животного, отличающийся тем, что применяется композиция или комбинированный препарат, описанные в настоящей заявке. Способы производства лекарственных препаратов хорошо известны. Например, лекарственный препарат может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель (Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, США).

Также представляется применение композиции или комбинированного препарата, описанное в настоящей заявке, в способе производства лекарственного препарата для лечения грибковых инфекций. Грибковая инфекция может быть резистентной к противогрибковому агенту per se.

Также представляется способ лечения грибковых инфекций у человека или животного, включающий введение композиции или комбинированного препарата по настоящей заявке пациенту в случае необходимости. Точную дозу (т.е. фармацевтически приемлемую дозу) композиции или комбинированного препарата, которую следует вводить пациенту, может легко определить специалист в данной области, например, при использовании простых опытов «доза - ответная реакция». Композицию или комбинированный препарат можно вводить перорально.

Кроме того, настоящее изобретение представляет набор, включающий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфические к одному или более эпитопов грибкового стрессового белка, и противогрибковый агент, включающий любой один из группы, состоящей из полиенового противогрибкового агента или эхинокандинового противогрибкового агента, для применения при лечении грибковых инфекций. Набор можно использовать для лечения грибковых инфекций, где грибок, вызывающий грибковую инфекцию, является резистентным к противогрибковому агенту per se.

Антитело по изобретению может иметь диагностическое применение. Так, для диагностического применения антитело можно использовать для обнаружения того, присутствует ли стрессовый белок в организме хозяина, для подтверждения того, что у хозяина имеется определенная грибковая инфекция, например мукоромикоз, бластомикоз, кокцидиоидомикоз или паракокцидиоидомикоз, или инфекция, вызываемая Candida, Cryptococcus, Histoplasma, Aspergiilus или Torulopsis, или, например, при диагностике грибковых абсцессов, особенно печеночного кандидоза и/или для мониторинга результатов лечения таких инфекций. Диагностические способы данного типа образуют дополнительный аспект изобретения, и обычно при их постановке могут использоваться стандартные методики, например иммунологические методы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ, радиоиммуноанализ, метод латекс-агглютинации или анализ методом иммуноблоттинга.

Антитело по изобретению можно пометить детектируемой меткой или можно конъюгировать с молекулой-эффектором, например с лекарственным препаратом, например с противогрибковым агентом, таким как амфотерицин В или фторцитозин, или с токсином, таким как рицин, или с ферментом, с использованием обычных способов, и изобретение распространяется на такие меченые антитела или конъюгаты антител.

Также настоящее изобретение представляет применение антитела или антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению при получении диагностикума для диагносцирования одной или более грибковых инфекций. Диагностикум может представляться в наборе. Набор может содержать инструкции для применения при диагностике одной или более грибковых инфекций. Также по настоящему изобретению представляется диагностический набор, описанный здесь.

Если желательно, то можно использовать смеси антител для диагностики или лечения, например смеси двух или более антител, распознающих различные эпитопы грибкового стрессового белка по изобретению, и/или смеси антител различного класса, например смеси атител IgG и IgM, распознающих один и тот же или различный эпитоп(ы) по изобретению.

Содержание каждого из источников, обсуждаемых здесь, включая цитированные источники, полностью включено здесь для сведения.

Настоящее изобретение будет дополнительно понятно из последующего описания, которое покажет только в качестве примера конкретные воплощения композиции и экспериментирование с ней.

Экспериментальный раздел

В описанных ниже опытах исследовалось противогрибковое действие антитела против антигена hsp90 из Candida albicans, использованного в комбинации с противогрибковыми препаратами, такими как амфотерицин В или флуконазол. Результаты показывают, что в некоторых случаях комбинация антитела и противогрибкового агента приводит к повышенному противогрибковому действию по сравнению с каждым одним из соединений. Удивительно высокий синергитический эффект показан для амфотерицина В в комбинации с анти-Candida albicans hsp90-антителом против различных распространенных проблемных грибковых патогенов. Данный синергитический эффект обладает важным значением для лечения грибковых инфекций в клинике. В предварительных клинических исследованиях с участием четырех пациентов, страдающих от инфекций, вызванных Candida, была показана эффективность настоящего изобретения для людей.

Материалы и методы

Штаммы:

Использованные штаммы дрожжей, не относящиеся к Aspergillus (таблица 1), высевали на декстрозный агар Сабуро (Oxoid, Basingstoke, Великобритания) и инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Штаммы идентифицировали с использованием системы API 20C (BioMerieux, Marcy L'Etoile, Франция). Если было необходимо, проводили микроскопические исследования морфологии на агаре с кукурузной мукой для подтверждения идентификации.

Изоляты Aspergillus spp (таблица 1) росли на декстрозном агаре Сабуро (Oxoid, Basingstoke, Великобритания) при 35°С в течение 24 ч.

Инокулят:

Для штаммов, не относящихся к Aspergillus, готовили суспензии из отдельных колоний (диаметр ≥ 1 мм) в 5 мл стерильного 0,85% физиологического раствора с плотностью 1×10⁴ клеток/мл, что устанавливали при подсчете на сетке гемоцитометра. Для штаммов Aspergillus смотри ниже.

Противогрибковые агенты:

Амфотерицин В от Sigma (Poole, Dorset) закупали в виде лиофилизованного порошка для внутривенного введения (фунгизон). Флуконазол от Pfizer поставлялся в виде раствора для внутривенного введения (дифлукан). Амфотерицин В растворяли в диметилсульфоксиде с получением концентрации 1,2 мг/мл, а флуконазол растворяли в 0,85% физиологическом растворе также с получением концентрации 1,2 мг/мл. Маточные растворы хранили до использования при -70°С. Абельцет (липосомальный амфотерицин В) изготовлялся Bristol-Meyers Squib (США), и готовился согласно указаниям изготовителя для использования его в клинических исследованиях.

Антитело:

Последовательность ДНК предшествующего антитела, специфического в отношении эпитопа hsp90 из Candida albicans, раскрытого в GB 2240979 и ЕР 0406029, генетически модифицировали оптимизацией кодона для экспрессии в Escherichia coli (Operon Technologies Inc., Alameda, CA, США) и вставляли в экспрессирующий вектор Е.coli. Аминокислотная последовательность анти-hsp90-антитела по настоящему изобретению включает последовательность SEQ ID NO:2 (включает домены тяжелой цепи, легкой цепи и спейсер). Антитело по настоящему изобретению распознает эпитоп, включающий последовательность SEQ ID NO:1.

Анти-hsр90-антитело экспрессировали в хозяине Escherichia coli и затем очищали аффинной хроматографией и в обменной колонке с имидазолом до чистоты 95%. Использовали стандартные методики молекулярной биологии (смотри, например, Harlow & Lane, выше; Sambrook J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Sambrook J. & Russell D., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).

Композиции микограба (Mycograb) (RTM) готовили следующим образом: ампулу, содержащую 10 мг чистого анти-hsp90-антитела, 150 мг мочевины фармацевтической чистоты (Ph Eur) и 174 мг L-аргинина (Ph Eur), восстанавливали в 5 мл воды.

Среда для анализа:

Бульон RPMI готовили из бульонной среды RPMI 1640 (Sigma R7880) с добавлением 0,3 г глутамина на литр, забуферивали за счет 34,6 г морфолинпропансульфоновой кислоты (MOPS) на литр и рН доводили до 7,0.

Тест микроразведения в бульоне:

Готовили двукратные разведения (от 40 до 0,024 мг/мл для амфотерицина В и от 400 до 0,4 мг/мл для флуконазола) в бульоне RPMI, начиная с двух маточных растворов. 100 мл суспензии инокулята, разбавленного 1 к 10 (эквивалентно 1×10³ КОЕ), вносили в планшеты для микротитрования. К этому добавляли 50 мкл противогрибкового препарата и затем 50 мкл антитела. Антитело было либо без разведения (0,4 мг/мл), либо разведенным до 1/10 или 1/100. Когда антитело отсутствовало, объем до 50 мкл доводили RPMI. Общий объем в каждой лунке составлял 200 мкл. Конечными концентрациями антитела в опытах были: 100 мкг/мл (без разведения), 10 мкг/мл («антитело в разведении 1/10») или 1 мкл/мл («антитело в разведении 1/100»).

Планшеты инкубировали при 37°С в течение ночи и минимальную ингибирующую концентрацию (MIC) определяли по самой низкой концентрации, ингибирующей рост.

Проводили подсчет колоний в лунках, в которых имелось видимое на глаз торможение роста дрожжей. Данные представлены в виде колониеобразующих единиц на мл бульона (КОЕ/мл).

Опыты с Aspergillus:

Готовили изоляты Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus и Aspergillus niger на среде RPMI 1640. Суспензии готовили с получением конечного инокулята 2×10⁴ конидий на мл и их разливали в аликвотах объемом 100 мкл в плоскодонные планшеты для микротитрования. Готовили серии двойных разведений амфотерицина В в пределах от 250 мкг/мл до 0,75 мкг/мл и разливали в соответствующие лунки. Микограб вносили в каждую лунку с конечной концентрацией 100 мкг/мл в приготовленном буфере. Готовили также контрольные серии для каждого изолята, который включал только приготовленный буфер. Затем планшеты инкубировали при 35°С (200 об/мин) в течение 48 ч и для каждого изолята определяли значения MIC по отсутствию или присутствию роста в лунках.

Синергия на животных:

Тридцати мышам CD1 (каждая массой 25 г) вводили 100 мкл штамма С. albicans, выделенного при вспышке инфекции (эквивалентно 1,5×10⁷ КОЕ), и через 2 ч мышей распределяли на три группы и им вводили:

(A) группа 1-100 мкл 10 мМ раствора ацетата аммония (ААТ; рН 9) с последующим введением 100 мкл амфотерицина В, что эквивалентно 0,6 мг/кг в 5% (мас./об.) растворе глюкозы;

(B) группа 2-100 мкл 10 мМ раствора ААТ (рН 9), содержащего 500 мкг анти-hsр90-антитела с последующим введением 100 мкл амфотерицина В, что эквивалентно 0,6 мг/кг в 5% (мас./об.) растворе глюкозы; и

(С) группа 3-100 мкл 10 мМ раствора ААТ (рН 9), содержащего 50 мкг анти-hsр90-антитела, с последующим введением 100 мкл амфотерицина В, что эквивалентно 0,6 мг/кг в 5% (мас./об.) растворе глюкозы.

Животных умерщвляли через 48 ч и проводили подсчет дрожжей на чашках со средой Сабуро в ткани печени, селезенки и почек.

Клинические исследования:

Открытое исследование по безопасности и фармакокинетике анти-пзр90-антитела (в виде микограба, смотри выше), с охватом четырех пациентов, страдающих инфекциями, вызванными Candida, проводили в Центральном госпитале Манчестера (Central Manchester Health Care Trust Hospital) и госпитале Витеншейва, (Wythenshawe), оба в Манчестере, Великобритания. Пациентов обследовали на признаки сепсиса вызванного Candida, включая:

положительные культуры С. albicans из многочисленных мест или внутренних областей; высокую или прыгающую температуру (пирексию); высокую частоту пульса (тахикардию) и высокое число лейкоцитов («WBC»).

После обычного лечения абельцетом (липосомальным амфотерицином В) и/или флуконазолом, пациентам дополнительно вводили различные дозы микограба, включая необязательную тестовую дозу (0,1 мг/кг) и терапевтическую дозу(ы) 1 мг/кг. За пациентами вели наблюдение на наличие клинических и лабораторных признаков инфекции (тестированные лабораторные показатели включали биохимию крови, гематологию и факторы свертывания крови) и определяли концентрации микограба в сыворотке крови и моче.

Результаты

Данные опытов in vitro, в которых исследовалось действие сочетания анти-Candida albicans hsр90-антитела («антитело») и противогрибковых агентов представлены в таблицах 2-18. Результаты опытов на животных приведены в таблице 19.

Опыты in vitro

Композиции, включающие антитело и флуконазол:

В таблице 2 приведены значения минимальных ингибирующих концентраций (MIC) флуконазола для испытуемых грибковых патогенов с или без присутствия анти-С. albicans hsp90-антитела в различных разведениях, что оценивали тестом микроразведения в бульоне. В присутствии антитела без разведения или антитела, разведенного в 10 раз, MIC для штамма, выделенного при вспышке инфекции, снижалось в четыре раза (от 1,56 мкг/мл до 0,39 мкг/мл флуконазола), в то время как 100-кратное разведение антитела приводило к двукратному снижению MIC флуконазола.

Незначительное уменьшение MIC флуконазола наблюдали для резистентного к флуконазолу штамма С. albicans и С. krusei в присутствии антитела без разведения. Однако при разведении 1/10 и 1/100 антитело не оказывало воздействия на значения MIC флуконазола для данных штаммов по сравнению с вариантом без антитела.

Для остальных штаммов грибков, т.е. С. tropicalis, С. parapsilosis и Т. glabrata, анти-С. albicans hsp90-антитело не оказывало заметного эффекта на значения MIC флуконазола.

Таблица 2MIC флуконазола
	Флуконозол без антитела	Флуконазол, антитело без разведения [100 мкг/мл]	Флуконазол, антитело в разведении 1/10 [10 мкг/мл]	Флуконазол, антитело в разведении 1/100 [1 мкг/мл]
MIC (мкг/мл)
Штамм С. albicans, выделенный при вспышке инфекции	1,56	0,39	0,39	0,78
Резистентный к флуконазолу штамм С. albicans	25	12,5	25	25
С. Krusei	100	50	100	100
С. tropicalis	3,125	3,125	3,125	3,125
Т. glabrata	1,56	1,56	1,56	1,56
С. parapsilosis	6,25	6,25	6,25	6,25

Были проведены дополнительные опыты, в которых количественно определяли число клеточных колоний, выживших при различных концентрациях флуконазола с различными разведениями анти-С. albicans hsр90-антитела, для каждого из штаммов грибков, данные приведены в таблице 2.

При исследованных концентрациях флуконазола выживаемость С. albicans (штамм, выделенный при вспышке инфекции) не снижалась при добавлении антитела без разведения или антитела, разведенного в 100 раз (таблица 3).

Таблица 3Число колоний (в КОЕ/мл) С. albicans (штамм, выделенный при вспышке инфекции) по сравнению с флуконазолом
	Концентрация флуконазола (мкг/мл)
0,09	0,19	0,39
Без антитела	3,6×105	1×105	5×104
Антитело без разведения [100 мкг/мл]	3,6×106	1,3×105	1,3×104
Антитело в разведении 1/100 [1 мкг/мл]	1×106	2,6×104	5,3×104
(Контроль 6×106 КОЕ/мл)

Для резистентного к флуконазолу штамма С. albicans наблюдали двукратное снижение выживаемости колоний при концентрации флуконазола 12,5 мкг/мл в присутствии антитела без разведения (таблица 4). Незначительное снижение выживаемости данного штамма отмечено при более низких концентрациях флуконазола в присутствии антитела без разведения, но никакого эффекта не было замечено при разведении антитела 1/100.

Таблица 4Число колоний (в КОЕ/мл) резистентного к флуконазолу штамма С. albicans по сравнению с флуконазолом
	Концентрация флуконазола (мкг/мл)
1,56	3,12	6,25	12,5
Без антитела	3×107	1,3×107	3×106	6×106
Антитело без разведения [100 мкг/мл]	2×106	4,3×105	5,6×104	6×103

Продолжение таблицы 4
Антитело в разведении 1/100 [1 мкг/мл]	3×107	1,1×107	1,1×107	6,3×106
(Контроль 2,6×107 КОЕ/мл)

Неразведенное или разведенное антитело не оказывало достоверного антигрибкового эффекта на С. krusei при тестированных концентрациях флуконазола (таблица 5).

Таблица 5Число колоний (в КОЕ/мл) С. krusei по сравнению с флуконазолом
	Концентрация флуконазола (мкг/мл)
25	50
Без антитела	3,2×107	1,6×107
Антитело без разведения [100 мкг/мл]	8,3×106	6×106
Антитело в разведении 1/100 [1 мкг/мл]	1,3×106	1,6×106
(Контроль 1×107 КОЕ/мл)

Для С. tropicalis не наблюдали заметного воздействия на выживаемость для каждой из испытанных концентраций флуконазола в присутствии или отсутствии антитела (таблица 6).

Таблица 6Число колоний (в КОЕ/мл) С. tropicalis по сравнению с флуконазолом
	Концентрация флуконаэола (мкг/мл)
0,09	0,19	0,39
Без антитела	5×105	6×103	6×102
Антитело без разведения [100 мкг/мл]	7×105	6,3×104	9×102
Продолжение таблицы 6
Антитело в разведении 1/100 [1 мкг/мл]	1×105	6×103	2×103
(Контроль 1,6×106 КОЕ/мл)

В таблице 7 показано, что присутствие или отсутствие антитела не оказывало влияния на выживаемость колоний Т. glabrata при каждой из тестированных концентраций флуконазола.

Таблица 7Число колоний (в КОЕ/мл) Т. glabrata по сравнению с флуконазолом
	Концентрация флуконазола (мкг/мл)
0,39	0,78	1,56
Без антитела	2×107	1×107	6×104
Антитело без разведения [100 мкг/мл]	1,5×107	1,2×107	9,3×105
Антитело в разведении 1/100 [1 мкг/мл]	2,3×107	1,9×107	2×105
(Контроль 4,3×107 КОЕ/мл)

Присутствие или отсутствие антитела не оказывало заметного эффекта на выживаемость колоний С. parapsilosis при концентрациях флуконазола, указанных в таблице 8.

Таблица 8Число колоний (в КОЕ/мл) С. parapsilosis по сравнению с флуконазолом
	Концентрация флуконазола (мкг/мл)
0,78	1,56	3,13	6,25
Без антитела	7×106	5,6×106	2,6×106	3×106
Антитело без разведения [100 мкг/мл]	8,6×106	2,3×106	1,6×106	1,6×106
Антитело в разведении 1/100 [1 мкг/мл]	4×105	3×106	2,3×106	5×106
(Контроль 1×107 КОЕ/мл)

Композиции с антителом и амфотерицином В:

В таблице 9 показаны минимальные ингибирующие концентрации (MIC) амфотерицина В против грибковых патогенов в присутствии и при отсутствии анти-С. albicans hsр90-антитела при различных разведениях, что оценивали в тесте микроразведения в бульоне.

В противоположность данным, полученным с флуконазолом (смотри таблицы 2-8, выше), во всех случаях тестирования штаммов имело место по меньшей мере четырехкратное снижение MIC амфотерицина В, когда добавляли неразведенное антитело в бульон при инкубации (таблица 9). Кроме того, во всех случаях при исследованиях штаммов имело место по меньшей мере двукратное уменьшение MIC амфотерицина В при добавлении в бульон при инкубации антитела, разведенного в 100 раз (конечная концентрация антитела: 1 мкг/мл).

Наибольший эффект композиции, включающей антитело и амфотерицин В, на снижение MIC амфотерицина В наблюдали на устойчивом к флуконазолу штамме С. albicans. Антитело без разведения приводило к десятикратному уменьшению MIC амфотерицина В, и даже при 100-кратном разведении антитела MIC амфотерицина В снижалось примерно на 25% (таблица 9).

Таблица 9MIC амфотерицина В
	MIC (мкг/кг)
Амфотерицин В без антитела	Амфотерицин В, антитело без разведения [100 мкг/мл]	Амфотерицин В, антитело в разведении 1/10 [10 мкг/мл]	Амфотерицин В, антитело в разведении 1/100 [1 мкг/мл]
Штамм С. albicans, выделенный при вспышке инфекции	0,156	0,039	0,039	0,078
Резистентный к флуконазолу штамм С. albicans	0,312	0,039	0,078	0,078
С. krusei	0,625	0,156	0,312	0,312
С. tropicalis	0,078	0,019	0,039	0,039
Т. glabrata	0,039	<0,009	<0,009	0,019
С. parapsilosis	0,625	0,156	0,313	0,313

Были проведены детальные опыты, в которых количественно определяли число колоний клеток, выживших при различных концентрациях амфотерицина В с различными разведениями анти-С. albicans hsр90-антитела для каждого из штаммов грибков, данные приведены в таблице 9.

В таблице 10 представлены данные по выживаемости штамма С. albicans, выделенного при вспышке инфекции, инкубированного с амфотерицином В в присутствии и отсутствие антитела. Имело место выраженное снижение (по меньшей мере в 10 раз) числа выживших колоний под воздействием антитела при всех тестированных концентрациях амфотерицина. Например, при концентрации 0,078 мкг/мл амфотерицина В выживаемость С. albicans (выделенного при вспышке инфекции) составляла 0,2% в присутствии антитела, разведенного в 100 раз, по сравнению с выживаемостью штамма без антитела. Ингибирующее действие антитела, разведенного в 100 раз, при концентрации 0,078 мкг/мл амфотерицина В было эквивалентно выживаемости данного штамма при концентрации 0,156 мкг/мл амфотерицина В (без антитела). Следовательно, даже очень разведенное антитело способно снижать количество амфотерицина В, необходимого для достижения степени специфической гибели у данного штамма.

Таблица 10Число колоний (в КОЕ/мл) выделенного при вспышке инфекции штамма С. albicans по сравнению с амфотерицином В
	Концентрация амфотерицина В (мкг/мл)
0,019	0,039	0,078	0,156
Без антитела	1×107	1,6×107	4,1×105	1,3×103
Антитело без разведения [100 мкг/мл]	5,3×105	6×103	3×102	4,3×102
Антитело в разведении 1/10 [10 мкг/мл]	5×105	1×l04	3,0×102	3×101
Антитело в разведении 1/100 [1 мкг/мл]	6,6×106	3,2×105	8,0×102	1×102
(Контроль 1×107 КОЕ/мл)

В таблице 11 представлены данные по выживаемости колоний С. albicans (штамма, устойчивого к флуконазолу) при различных концентрациях амфотерицина В и при различных разведениях антитела. Не было отмечено заметного воздействия антитела или амфотерицина В при более низких концентрациях противогрибкового агента. Однако при концентрациях амфотерицина В, приближающихся к MIC противогрибкового агента (смотри таблицу 9, выше) наблюдали, что антитело при 100-кратном разведении приводило к 0,1% выживанию данного штамма по сравнению с антителом.

Таблица 11Число колоний (в КОЕ/мл) резистентного к флуконазолу штамма С. albicans по сравнению с амфотерицином В
	Концентрация амфотерицина В (мкг/мл)
0,019	0,039	0,078
Без антитела	4,6×106	4,3×106	6×106
Антитело без разведения [100 мкг/мл]	5,3×105	3,0×103	3×103
Антитело в разведении 1/10 [10 мкг/мл]	2,2×106	6,3×104	1,6×103
Антитело в разведении 1/100 [1 мкг/мл]	3,4×106	1,6×105	5,3×103
(Контроль 1,6×107 КОЕ/мл)

Данные по выживаемости колоний С. krusei в присутствии амфотерицина В и различных количеств антитела приведены в таблице 12. Становится очевидным, что антитело является очень эффективным против данного штамма при более высоких испытанных концентрациях амфотерицина В. Даже при 100-кратном разведении число колоний С. krusei, обнаруженных в присутствии 0,312 мкг/мл амфотерицина В, составляло 0,01% от выживших без антитела.