Комплексы антител с несколькими цитокинами

Комплексы антител с несколькими цитокинами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данная заявка основана на приоритете заявки на патент США №60/147924, поданной 9 августа 1999 г., содержание которой включено сюда ссылкой на нее.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способам конструирования и экспрессии белковых комплексов с несколькими цитокинами и композициям с их участием. Более конкретно, изобретение относится к слитым белкам, составленным из нескольких цитокинов и адресующего компонента, и способам использования таковых в лечении заболеваний, таких как рак и вирусная инфекция.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Регуляторные цепи, контролирующие иммунную систему, основываются на секретируемых молекулах сигнальных белков, которые называются цитокинами, предназначенных для включения и выключения функций иммунных клеток и для регуляции их пролиферации. В этих реакциях в общем случае участвуют несколько цитокинов, которые для достижения необходимого биологического эффекта действуют согласованно. Некоторые цитокины, такие как интерлейкин-2 (IL-2), могут самостоятельно индуцировать пролиферацию иммунных клеток и могут активировать другие функции, в том числе секрецию вторичных цитокинов. Другой цитокин, интерлейкин-12 (IL-12) (см. Обзор: Trinchieri // Stood. 1994. Т. 84. С.4008-4027) может индуцировать пролиферацию определенных иммунных клеток и индуцировать другой иммуномодулятор - интерферон-γ (ИФН-γ). Эта индукция ИФН-γ является главной функцией IL-12, хотя IL-12 имеет и другие важные функции, не связанные с ИФН-γ. Поскольку сам IL-12 в случае инфекционного заболевания индуцируется на его ранней стадии, полагают, что он связывает врожденную и приобретенную иммунные системы.

Многочисленные исследования in vitro и на мышиных, и на человеческих иммунных клетках продемонстрировали важность комбинаций цитокинов в развитии оптимальных иммунных реакций. Например, большинство Т-клеток не экспрессируют рецепторы IL-12 (IL-12R) до тех пор, пока их не индуцируют митогенами или не культивируют в присутствии высоких концентраций IL-2 (Desai и др. // J. Immunol. 1992. Т. 148. С.3125-3132). Как только рецепторы экспрессированы, клетки становятся более восприимчивыми к IL-12. Кроме того, IL-12 индуцирует транскрипцию ИФН-γ, но мРНК ИФН-γ после этого быстро разрушается. В присутствии IL-2 мРНК стабилизируется, что приводит к резкому повышению продуцирования ИФН-γ (Спал и др. // J. Immunol. 1992. Т. 148. С.92-98). В других исследованиях было обнаружено, что комбинации цитокинов: IL-3 плюс IL-11 или IL-3 плюс фактор Стила обладают синергидным с IL-12 действием на пролиферацию ранних клеток-предшественников системы кроветворения (Trinchieri, 1994; цитировано выше). Комбинация интерлейкина-4 и гранулоцитного фактора стимуляции образования колоний макрофагами (granulocyte macrophage colony stimulating factor - GM-CSF) особенно полезна для стимуляции дендритных клеток (Palucka и др. // J. Immunology. 1998. Т. 160. С.4587-4595). Для стимуляции опосредованной клетками иммунной реакции полезно также комбинировать IL-12 с IL-18 - недавно открытым запускающим путь Тп1 лимфокином с некоторыми функциями, комплементарными к функциям IL-12 (Hashimoto и др. // J. Immunol. 1999. Т. 163. С.583-589; Barbulescu и др. // J. Immunol. 1998. Т. 160. С.3642-3647). Кроме того, IL-2 и ИФН-γ в некоторых ситуациях обладают синергидным действием (Palladino М.А. // Патент США №5082658).

Во многих таких исследованиях синергизма было обнаружено, что очень важно относительное содержание каждого цитокина. При том, что добавление IL-12 в присутствии субоптимальных количеств IL-2 синергидно действовало на индукцию пролиферации, цитолитическую активность и индукцию ИФН-γ, было показано, что комбинации IL-2 с IL-12 при высокой дозе одного из цитокинов давали антагонистический эффект (Perussia и др. // J. Immunol. 1992. Т. 149. С.3495-3502; Mehrotra и др. // J. Immunol. 1993. Т. 151. С.2444-2452). Подобная же ситуация обнаруживалась при комбинациях IL-12 и IL-7.

Исследования синергизма действия IL-12 и других цитокинов в порождении антиопухолевых реакций у мышей также дали неоднозначные результаты. В некоторых моделях при субоптимальных дозах каждого цитокина обнаруживался синергизм, а более высокие дозы давали повышенную токсичность. На других моделях комбинации IL-12 и IL-2 обладали очень слабым или вообще не обладали синергидным действием (см., например, Nastala и др. // J. Immunol. 1994. Т. 153. С.1697-1706). Эти результаты могут быть следствием того, что in vivo трудно объединить два потенциально синергидных агента, особенно если необходимо поддерживать фиксированное соотношение активностей двух агентов с различными фармакокинетическими свойствами, такими как время полужизни в кровотоке и распределение в организме.

В опытах в культурах клеток in vitro достаточно просто контролировать уровни содержания цитокинов, но in vivo на относительное распределение в организме и локализацию цитокинов может действовать много факторов, что влияет на их иммуностимулирующую способность. Наиболее важным из этих факторов является время полужизни. Время полужизни IL-2 в кровотоке после инъекции болюса составляет около 10 мин. В противоположность этому, было отмечено, что время полужизни IL-12 в кровотоке составляет более 3 ч у мышей (Wysocka и др. // Eur. J. Immunol. 1995. Т.25. С.672) и от 5 до 10 ч у людей (Lotze и др. // Ann NY Acad Sci. 1996. Т.795. С.440-454).

Полагают, что это различие связано с относительно малыми размерами IL-2 и GM-CSF (15-25 кДа против 75 кДа у IL-12), вследствие чего IL-2 и GM-CSF выводятся фильтрацией через почки. Обычно фильтрацией через почки выводятся белки с молекулярным весом менее 50 кДа. Почти все цитокины имеют молекулярный вес менее 50 кДа и подвергаются подобному быстрому выведению фильтрацией через почки. Если необходимо лечение такими двумя небольшими, быстро выводящимися цитокинами, достаточно просто вводить цитокины вместе. Однако для цитокинов с существенно различными временами полужизни совместное введение не является оптимальным.

Системное введение цитокинов затруднено из-за их вредных побочных эффектов. Например, значительное побочное действие наблюдается при введении больших количеств интерферона-альфа, в том числе токсичность для кожи, нервной, иммунной и эндокринной систем. Ожидается, что слияние нескольких цитокинов может дать особенно серьезные побочные эффекты.

Одна из стратегий для уменьшения побочного действия системного введения цитокинов состоит в слиянии цитокина со второй молекулой со способностью к целенаправленному адресованию. Слитые белки, в которых область Fc иммуноглобулина помещена на N-конце другого белка (называемые «иммунофузинами» или слияниями «Fc-X», где Х обозначает лиганд, такой как интерферон-альфа), обладают многими отчетливо выраженными полезными биологическими свойствами (Lo и др. // Патенты США №№5726044 и 5541087; Lo и др. // Protein Engineering. T. 11. С.495). В частности, такие слитые белки могут связываться с подходящими рецепторами для Fc на поверхности клеток. Однако при связывании лиганда со своим рецептором на клеточной поверхности ориентация области Fc меняется, и оказывается, что это препятствует действию последовательностей, которые определяют зависящую от антител опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC) и связывание комплемента. В результате область Fc в молекуле Fc-X перестает эффективно направлять ADCC и связывание комплемента. Цитотоксический эффект вследствие слияния N-концевого цитокина и С-концевой области Fc хорошо известен. Например, слияние IL-2 с N-концом области Fc дает молекулу, способную в результате связываться с клетками, имеющими рецептор для IL-2, связывать комплемент и лизировать клетки (Landolfi N.F. // Патент США №5349053, 1993 г.). Наоборот, слитые белки Fc-IL-2 не обладают таким свойством. Таким образом, ожидается, что слияния Fc-X будут иметь полезные качества - увеличенное время полужизни в сыворотке и преимущественное концентрирование в печени без нежелательных эффектов в виде ADCC и связывания комплемента.

Было продемонстрировано, что с областью Fc в конфигурации Fc-X могут быть слиты многие разнообразные белки с коротким временем полужизни в сыворотке, и полученные слияния имеют значительно большее время полужизни в сыворотке. Однако времена полужизни в сыворотке двух различных слияний с Fc в общем случае не будут одинаковыми. Поэтому, если необходима доставка двух различных составляющих X, совместное введение двух различных слитых белков Fc-X в большинстве случаев не будет оптимальным.

При некоторых ситуациях наилучший способ адресованно направить действие цитокина на антиген клеточной поверхности состоит в слиянии его с антителом (или полученным из него фрагментом), имеющим специфичность и сродство (аффинность) к этому антигену (Gillies // Патент США №5650150; Gillies и др. // Ргос. Natl. Acad. Sci. USA. T. 89. С.1428), или в соединении пептидной связью белкового антигена и стимулирующего цитокина в форме слитого белка (Hazama и др. // Vaccine. Т.11. С.629). Хотя антитела сами по себе могут увеличить время полужизни слитого с ними цитокина, между слияниями различных цитокинов с одним и тем же антителом могут еще существовать различия (см., например, Gillies и др. // Bioconjugate Chem. 1993. Т.4. С.230-235; Gillies и др. // J. Immunol. T.160. С.6195-6203), которые затрудняют их совместную локализацию на участке-мишени. Как обсуждалось выше, это может привести к дисбалансу в активностях цитокинов и к уменьшению желаемого синергидного действия. Кроме того, при использовании двух различных слитых белков необходимо испытать безопасность и параметры эффективности каждого слияния порознь, а затем провести испытания их смесей.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает комплексы или слияния двух или более различных цитокинов, полезные как для общей, так и адресованной иммунной терапии. Эти комплексы или слияния факультативно включают другие белковые составляющие. Одной из особенностей таких комплексов или слияний является то, что они обеспечивают заданное соотношение активностей цитокиновых компонентов.

В общем виде настоящее изобретение относится к белковым комплексам, содержащим по меньшей мере два различных цитокина. Цитокины могут находиться в одной и той же полипептидной цепи или же быть связанными ковалентной связью, такой как дисульфидная связь или связь, образованная путем химической сшивки. В качестве альтернативы, цитокины могут находиться в состоянии стабильной нековалентной ассоциации. В некоторых предпочтительных осуществлениях белковый комплекс содержит адресующую составляющую, такую как антитело или фрагмент антитела, которая адресованно направляет комплекс в определенное место (локус) млекопитающего.

В предпочтительном примере осуществления настоящее изобретение предусматривает белковый комплекс, объединяющий биологическую активность двухцепочечного цитокина, такого как IL-12, с биологической активностью второго цитокина. Цитокины могут быть ковалентно связаны (например, слиты) друг с другом. Цитокины могут быть также соединены при посредстве других составляющих. Например, полипептидная цепь, содержащая второй цитокин, может иметь связывающуюся составляющую, которая специфически связывается с IL-12, такую как антитело к IL-12 или рецептор для IL-12. В качестве альтернативы, связывающаяся составляющая может взаимодействовать со второй составляющей, которая ассоциирована с IL-12. Например, если полипептидная цепь, содержащая субъединицу IL-12, содержит также авидин, то полипептид, содержащий второй цитокин, может содержать также биотин как адресующую составляющую. В одном из предпочтительных примеров осуществления второй цитокин - это IL-2.

Настоящее изобретение предусматривает способы получения слитых белков, содержащих IL-12, которые имеют как активность IL-12, так и активность второго цитокина, и при этом обеспечивают более длительное, единое фармакокинетическое поведение, подобное поведению самого IL-12, в итоге увеличивая продолжительность активности второго цитокина и сохраняя баланс активностей двух цитокинов после инъекции животному.

В другом примере осуществления изобретения слитые белки содержат гетеродимерную форму IL-12, в которой субъединицы IL-12 р35 и р40 соединены дисульфидной связью и ковалентно присоединены ко втором цитокину либо на амино-конце, либо на карбоксильном конце субъединицы р35 или р40 IL-12, со следующей общей формулой слитого белка: IL-12-X или X-IL-12, где Х - второй цитокин.

В ином примере осуществления изобретения слитые белки содержат второй цитокин, присоединенный ковалентно либо к амино-концу, либо к карбоксильному концу одноцепочечной (single-chain - sc) формы IL-12, содержащей две полипептидные субъединицы, соединенные гибким пептидным мостиком, со следующей общей формулой слитого белка: sclL-12-X или X-sclL-12.

Еще в одном примере осуществления два цитокина дополнительно слиты с белком, способным образовывать димерную или мультимерную структуру, либо на амино-конце, либо на карбоксильном конце указанной белковой цепи. В предпочтительном варианте этого примера осуществления одна из форм слитого белка IL-12 со вторым цитокином далее слита с частью цепи иммуноглобулина (Ig), такой как область Fc, которая способна к димеризации. Другие примеры осуществления охватывают слияние по меньшей мере одной полипептидной цепи IL-12 на любом конце составляющей Ig и второго цитокина, присоединенного на другом конце.

В следующем примере осуществления два или более цитокина слиты с белком, имеющим адресующую способность в силу связывания со специфическим рецептором. Например, область Fc может связываться с рецепторами для Fc, которые в изобилии находятся в печени. Слияния области Fc с несколькими цитокинами иллюстрирует преимущества совмещения димеризации и адресования, однако в некоторых случаях полезно конструировать слияния с несколькими цитокинами, которые могут только мультимеризоваться или только быть адресантами, но не совмещают обе способности.

В еще одном примере осуществления слитый белок, содержащий несколько цитокинов, дополнительно слит с амино- или карбоксильным концом представителя класса молекул с разнообразной адресующей способностью, такого как антитело или пептидный аптамер с наличием или без каркаса (Colas и др. // Proc NatI Acad Sci USA. 1998. Т.95. С.14272-14277). Конкретный пример осуществления - это слияние нескольких цитокинов по меньшей мере с частью антитела, которое способно связывать антиген, такого как интактное антитело, одноцепочечное антитело или одноцепочечная область Fv. Дополнительные примеры осуществления включают слияния по меньшей мере одной полипептидной цепи IL-12 с любым концом по меньшей мере части цепи антитела, способной связывать антиген, и со вторым цитокином, присоединенным на другом конце.

В соответствии с вышеприведенными описаниями, вообще предпочтительно конструировать слитые белки из нескольких цитокинов и слитые белки из нескольких цитокинов с антителом методом генетической инженерии, так что белковые компоненты соединены ковалентными связями, такими как амидные связи или дисульфидные связи. Однако можно для конструирования таких белковых комплексов использовать также химические сшивающие агенты. Такие методы хорошо известны в области химии белков. В качестве альтернативы, иногда достаточно создать белковые комплексы слиянием различных цитокинов с белками-партнерами, образующими стабильные нековалентные комплексы. Например, используют нековалентно связанный гетеродимерный белок-носитель: первый цитокин слит с одной из субъединиц гетеродимера, второй цитокин слит со второй субъединицей гетеродимера, и оба слитых белка смешаны при подходящих условиях. Например, в одной и той же клетке экспрессируют нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки с двухсубъединичным цитокином. Таким путем может быть сконструирован белковый комплекс с несколькими цитокинами, в котором цитокиновые компоненты могут быть связаны нековалентно, либо прямо, либо опосредованно. Чтобы соответствовать целям настоящего изобретения, такой комплекс должен быть достаточно стабилен, чтобы сохраниться при введении животному и обеспечить биологический эффект.

Настоящее изобретение предусматривает также нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, содержащие два или более цитокинов, где один из цитокинов - предпочтительно IL-12, а кодируемый нуклеиновой кислотой слитый белок факультативно содержит другие белковые составляющие. Предпочтительные примеры осуществления включают нуклеиновые кислоты, кодирующие слияния двух или более цитокинов с димеризующимся белком, таким как область Fc цепи антитела. Другой набор предпочтительных примеров осуществления составляют нуклеиновые кислоты, кодирующие слияния двух или более цитокинов с белком, имеющим адресующую способность, таким как антитело.

Настоящее изобретение предусматривает также способы конструирования слияний с двумя или более цитокинами, а также способы экспрессии таких слитых белков.

Изобретение предусматривает также способы лечения заболеваний и других болезненных состояний, в которых лечение включает подходящую комбинацию активностей двух или более белков. В одном из примеров осуществления по меньшей мере один из белков имеет короткое (например, менее 20 минут) или только умеренно длительное (например, менее 40 минут) время полужизни в сыворотке. Белки слиты методами генетической инженерии или другими методами и вводятся человеку или животному. Таким образом, активности двух белков наличествуют в заданном соотношении, и не требуется вводить два белка порознь с различными режимами дозировок. Кроме того, время полужизни в сыворотке слитого белка вообще более близко к времени полужизни белкового компонента с более длительным временем полужизни в сыворотке, что приводит к удлинению эффективного времени полужизни белка или белков с более коротким временем полужизни в сыворотке.

Конкретнее, изобретение предусматривает способы иммунотерапевтического лечения заболеваний, таких как рак или инфекционные заболевания, или иные заболевания, которые подвергаются лечению двухцепочечным цитокином, таким как IL-12, в комбинации со вторым цитокином. В предпочтительном примере осуществления IL-12 сливают с IL-2 или GM-CSF и вводят животному или человеку. В других предпочтительных примерах осуществления GM-CSF сливают с IL-4 и вводят животному или человеку. В ином примере осуществления IL-12 сливают с IL-18 и вводят животному или человеку. Такие приемы лечения могут быть использованы совместно с другими приемами лечения заболеваний. Кроме того, настоящее изобретение предлагает способы вакцинации против различных антигенов, которые могут быть использованы для профилактики или лечения различных заболеваний.

В иных примерах осуществления этих способов два различных цитокина сливают с димерной белковой составляющей, такой как область Fc антитела, и вводят животному или человеку. В предпочтительной форме этих способов цитокин IL-12 сливают с областью Fc вместе со вторым цитокином, который предпочтительнее представляет собой IL-2 или GM-CSF.

В некоторых других примерах осуществления этих способов два различных цитокина слиты с интактным антителом и водятся животному или человеку. В предпочтительной форме этих способов цитокин IL-12 сливают с антителом вместе со вторым цитокином, который предпочтительнее представляет собой IL-2 или GM-CSF. Настоящее изобретение предлагает также смеси слитых белков антитело-цитокин, пригодные для лечения заболеваний. В одном из примеров осуществления для лечения заболевания используют смесь слитого белка антитело-IL-2 и слитого белка антитело-IL-12. Например, лечат рак, вирусную инфекцию или бактериальную инфекцию.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Все вышеизложенное и другие задачи настоящего изобретения и его различные отличительные особенности могут быть более понятны из последующего описания, сопровождаемого прилагаемыми чертежами. На всех чертежах одинаковые номера обозначают одинаковые структуры.

Фиг.1А дает схематическую иллюстрацию слияния двух цитокинов в простейшем виде: один цитокин слит со вторым цитокином, факультативно через мостик. Фигуры с 1В по 1I показывают различные способы, которыми второй цитокин (обозначенный «cyt») может быть прикреплен к гетеродимерному цитокину IL-12. Конкретно, второй цитокин может быть слит с С-концом р40 (фиг.1В), N-концом р40 (фиг.1С), С-концом р35 (фиг.1D) или N-концом р35 (фиг.1Е). Кроме того, на фиг.1 показано, как второй цитокин может быть слит с одноцепочечным вариантом IL-12. Конкретно, одноцепочечные молекулы IL-12 могут иметь субъединицу р35, прикрепленную к N-концу субъединицы р40, со вторым цитокином на С-конце (фиг.1F) или на N-конце (фиг.1G). В качестве альтернативы, одноцепочечные молекулы IL-12 могут иметь р40 на N-конце р35, со вторым цитокином на С-конце (фиг.1Н) или на N-конце (фиг.1I).

На фигурах 2А-2С схематически показано, как слияния с несколькими цитокинами (заключенные в рамку), представленные на фиг.1, могут быть дополнительно слиты с областью Fc антитела, показанной здесь как шарнир (Н), домен СН2 и домен СН3 (овалы). Конкретно, каждая из восьми молекул фигуры 1 может быть слита либо с С-концом (фиг.2А), либо с N-концом (фиг.2В) области Fc. Кроме того, нет необходимости первый цитокин и второй цитокин (каждый заключен в рамку) соединять непосредственно друг с другом. Они могут быть соединены через область Fc (фиг.2С).

На фигурах 3А - 3G схематически показан набор путей, которыми слитый белок с несколькими цитокинами может быть дополнительно слит с интактным иммуноглобулином, таким как IgG. Область тяжелой цепи V представлена в виде овала, обозначенного V_н, область легкой цепи V представлена в виде овала, обозначенного V_L, а константные области представлены пустыми овалами. Слияние с несколькими цитокинами, показанное на фиг.1, может быть помещено на С-конце тяжелой цепи (фиг.2А), на N-конце тяжелой цепи (фиг.2В), на N-конце легкой цепи (фиг.2С), или на С-конце легкой цепи (фиг.2D). Кроме того, существует много способов, которыми первый и второй цитокины могут быть порознь прикреплены к N- и С-концам тяжелой и легкой цепей, три из них показаны на фигурах 3Е - 3G.

На фигурах 4А - 4С схематически показано, как первый и второй цитокины могут быть слиты с «одноцепочечным» антителом, у которого слиты вариабельная легкая и вариабельная тяжелая цепи, и белок экспрессируется в виде одиночного полипептида, который затем гомодимеризуется. Конкретно, слияние с несколькими цитокинами может быть помещено на С-конце (фиг.4А) или на N-конце (фиг.4В). Кроме того, нет необходимости первый цитокин и второй цитокин соединять непосредственно друг с другом. Они могут быть соединены через одноцепочечное антитело (фиг.4С).

На фигурах 5А - 5С схематически показано, как первый и второй цитокины могут быть слиты с одноцепочечной областью Fv, состоящей из слитых вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи. Конкретно, слияние первого цитокина со вторым цитокином может быть помещено на С-конце (фиг.5А) или на N-конце (фиг.5В). Кроме того, нет необходимости первый цитокин и второй цитокин соединять непосредственно друг с другом. Они могут быть соединены через одноцепочечную область Fv (фиг.5С).

Фигуры 6А и 6В показывают синергизм действия IL-12 и IL-2 в индукции ИФН-γ в одноядерных клетках периферической крови человека (peripheral blood mononuclear cells - PBMC) в ответ на добавление отдельных цитокинов или слитых белков. На фиг.6А, клетки обрабатывали человеческим IL-12 до (квадраты) или после (крестики) активации фитогемагглютинином, или же слитым белком IL-12-IL-2 до (ромбы) или после (треугольники) активации фитогемагглютинином. На фиг.6В представлен опыт, в котором клетки обрабатывали смесью IL-12 и IL-2, добавляемой при их молярном соотношении 1:1 (зачерненные ромбы), слитым белком (Fc человека)-IL-12-IL-2 (заштрихованные квадраты) и слитым белком (антитело человека)-IL-12-IL-2 (слегка заштрихованные треугольники). По оси Х указана концентрация IL-12 в пг/мл, присутствует ли он как интактный белок или в составе слитого белка. По оси Y указана концентрация ИФН-γ (в нг/мл), определенная методом ELISA.

На фиг.7 представлен типичный биологический анализ IL-12, который позволяет отдельно измерить активность слитого белка и сравнить ее с активностью неслитой молекулы IL-12. Изображена стимуляция включения ^ЗH-тимидина человеческими PBMC в ответ на введение мышиного IL-12 (пустые кружки), смеси мышиных IL-12 и IL-2, добавленных в молярном соотношении 1:1 (зачерненные квадраты), мышиного IL-2 (пустые треугольники) и слитого белка, содержащего антитело, мышиный IL-12 и мышиный IL-2 (зачерненные ромбы). По оси Х указана концентрация (пМ) мономерного цитокина (цитокинов) в виде интактного белка или в составе слитого белка, по оси Y указано включение меченого тритием тимидина в количестве импульсов в минуту (имп/мин).

На фиг.8 представлен стандартный анализ биологической активности IL-2. График показывает стимуляцию пролиферации мышиных клеток CTLL в ответ на мышиный IL-2 (кружки), на слитый белок антитело-mu.IL-12-mu.IL-2 (ромбы) и мышиный IL-12 (квадраты). По оси Х указана концентрация (пМ) мономерного цитокина (цитокинов) в виде интактного белка или в составе слитого белка. Клетки инкубировали в среде, содержащей в течение 48 ч различные количества цитокина или слитого белка, после чего определяли количество жизнеспособных клеток с помощью теста MTT/MTS. По оси Y указано поглощение при 490 нм в единицах оптической плотности (ОП).

Фиг.9 показывает стимуляцию включения ³H-тимидина человеческими РВМС в ответ на мышиный IL-12 (пустые кружки), смесь мышиных IL-12 и IL-2, добавленных в молярном соотношении 1:1 (черные кружки), слитый белок (Fc мыши)-(одноцепочечный IL-12)-IL-2 (черные треугольники) и мышиный одноцепочечный IL-12, слитый с мышиным IL-2 (черные ромбы). По оси Х указана концентрация (пМ) мономерного цитокина (цитокинов) в виде интактного белка или в составе слитого белка, по оси Y указано включение меченого тритием тимидина в количестве импульсов в минуту (имп/мин).

Фиг.10 показывает стимуляцию включения ³H-тимидина человеческими РВМС в ответ на мышиный IL-12 (пустые кружки), смесь мышиного IL-12 с GM-CSF, добавленную при их молярном соотношении 1:1 (черные кружки), мышиный GM-CSF (черные треугольники) и слитый белок mu.Fc-mu.IL-12-GM-CSF (крестики). По оси Х указана концентрация (пМ) мономерного цитокина (цитокинов) в виде интактного белка или в составе слитого белка, по оси Y указано включение меченого тритием тимидина (имп/мин).

Фиг.11 демонстрирует эффект введения слитого белка антитело-цитокин-цитокин мышам Balb/C, имеющим подкожные опухоли, полученные из клеток СТ26 карциномы прямой кишки, которые вследствие геноинженерных манипуляций экспрессируют человеческий ЕрСАМ - антиген для KS-1/4. Черными ромбами показан средний объем опухолей у контрольных мышей, которым вводили PBS в дни: 0-й, 1-й, 2-й, 3-й и 4-й. Треугольниками показан средний объем опухолей у мышей, которым вводили 6 мкг KS-IL-12-IL-2. Квадратами обозначен средний объем опухолей у мышей, которым вводили 3,4 мкг KS-IL-2 и 5,3 мкг of KS-IL-12. Инъекции проводили внутрь опухолей. По оси Х указано время (дни), прошедшее после первой инъекции; по оси Y указан средний объем опухолей в кубических мм.

Фиг.12 демонстрирует эффект введения слитого белка антитело-цитокин-цитокин мышам SCID, имеющим подкожные опухоли, полученные из клеток СТ26 карциномы прямой кишки, которые вследствие геноинженерных манипуляций экспрессируют человеческий ЕрСАМ. Ромбами показан средний объем опухолей у контрольных мышей, которым вводили PBS в дни: 0-й, 1-й, 2-й, 3-й и 4-й. Треугольниками показан средний объем опухолей у мышей, которым вводили 6 мкг KS-IL-12-IL-2. Квадратами обозначен средний объем опухолей у мышей, которым вводили 3,4 мкг KS-IL-2 и 5,3 мкг of KS-IL-12. Инъекции проводили внутрь опухолей. По оси Х указано время (дни), прошедшее после первой инъекции; по оси Y указан средний объем опухолей в мм³.

Фиг.13 показывает результаты сравнения действия введения слитого белка антитело-цитокин и антитело-цитокин-цитокин мышам, имеющим подкожные опухоли из клеток карциномы легких Льюиса (LLC), которые вследствие геноинженерных манипуляций экспрессируют человеческий ЕрСАМ. Ромбами показан средний объем опухолей у контрольных мышей, которым внутрь опухолей вводили PBS в дни: 0-й, 1-й, 2-й, 3-й и 4-й. Квадраты показывают средний объем опухолей у мышей, которым внутрь опухолей в дни: 0-й, 1-й, 2-й, 3-й и 4-й вводили 20 мкг KS-IL-2. Треугольниками показан средний объем опухолей у мышей, которым внутрь опухолей в дни: 0-й, 1-й, 2-й, 3-й и 4-й вводили 20 мкг KS-IL-12. Крестиками указан средний объем опухолей у мышей, которым внутрь опухолей в дни: 0-й, 1-й, 2-й, 3-й и 4-й вводили 20 мкг KS-IL-12-IL-2. По оси X указано время (дни), прошедшее после первой инъекции; по оси Y указан средний объем опухолей в мм³.

На фиг.14 показан эффект введения слитого белка антитело-цитокин-цитокин мышам, имеющим подкожные опухоли, происходящие из клеток карциномы легких Льюиса, которые вследствие геноинженерных манипуляций экспрессируют человеческий ЕрСАМ. Ромбами показан средний объем опухолей у контрольных мышей, которым внутрь опухолей вводили PBS в дни: 0-й, 1-й, 2-й, 3-й и 4-й. Треугольниками показан средний объем опухолей у мышей, которым вводили 20 мкг KS-IL-12-IL-2. Квадратами показан средний объем опухолей у мышей, которым вводили 11,5 мкг KS-IL-2 и 18 мкг KS-IL-12. Инъекции проводили внутрь опухолей. По оси Х указано время (дни), прошедшее после первой инъекции; по оси Y указан средний объем опухолей в мм³.

На фиг.15 показан эффект введения слитого белка антитело-цитокин-цитокин мышам, имеющим подкожные опухоли, происходящие из клеток карциномы легких Льюиса, которые экспрессируют или не экспрессируют человеческий ЕрСАМ. Черными квадратами показан средний объем опухолей у мышей, у которых опухоли были получены из клеток LLC/KSA. Черными ромбами показан средний объем опухолей у мышей, у которых опухоли были получены из клеток LLC. Мышам вводили 20 мкг KS-IL-12-IL-2 в дни: 0-й, 1-й, 2-й, 3-й и 4-й. Инъекции проводили внутрь опухолей. По оси Х указано время (дни), прошедшее после первой инъекции; по оси Y указан средний объем опухолей в мм³.

На фиг.16 показан эффект введения слитого белка антитело-цитокин-цитокин мышам, имеющим подкожные опухоли, происходящие из клеток карциномы легких Льюиса. В 0-й день вводили инъекцией подкожно приблизительно 10⁶ клеток. Ромбами показан средний объем опухолей у нативных мышей. Квадратами показан средний объем опухолей у мышей, которые до этого имели подкожные опухоли из клеток карциномы легких Льюиса (LLC), экспрессирующих вследствие геноинженерных манипуляций человеческий ЕрСАМ, и которые были избавлены от этих опухолей введением KS-IL-12-IL-2. По оси Х указано время (дни), прошедшее после инъекции; по оси Y указан средний объем опухолей в мм³.

На фигурах 17А и 17В показано влияние секреции опухолевыми клетками белка с одним цитокином или с несколькими цитокинами на способность клеток образовывать опухоли у животных с нормальной иммунной системой. На фиг.17А дано сравнение 4 групп мышей: мыши C57BL/6, которым подкожно вводили 1×10⁶ клеток опухоли LLC (черные ромбы); мыши C57BL/6, которым подкожно вводили 5×10⁶ клеток опухоли LLC (пустые ромбы); мыши C57BL/6, которым подкожно вводили 1×10⁶ опухолевых клеток LLC, экспрессирующих sclL-12 (черные треугольники); и мыши C57BL/6, которым подкожно вводили 5х10⁶ опухолевых клеток LLC, экспрессирующих sclL-12 (пустые треугольники). На фиг.17В дано сравнение мышей C57BL/6, которым подкожно вводили 1×10⁶ клеток опухоли LLC (черные ромбы); мышей C57BL/6, которым подкожно вводили 5х10⁶ клеток опухоли LLC (пустые ромбы); мышей C57BL/6, которым подкожно вводили 1×10⁶ клеток опухоли LLC, экспрессирующих sclL-12-IL-2 (крестики), и мышей C57BL/6, которым подкожно вводили 5×10⁶ клеток опухоли LLC, экспрессирующих sclL-12 (пустые кружки). По оси Х указано время (дни), прошедшее после инъекции опухолевых клеток. По оси Y указан средний объем опухолей в мм³.

На фиг.18 показано влияние секреции опухолевыми клетками белка с одним цитокином или с несколькими цитокинами на способность клеток образовывать опухоли у иммунодефицитного животного. Эта фигура показывает сравнение мышей SCID, которым подкожно вводили 1×10⁶ клеток опухоли LLC (черные ромбы); мышей SCID, которым подкожно вводили 1×10⁶ клеток опухоли LLC, экспрессирующих sclL-12 (черные треугольники), и мышей SCID, которым подкожно вводили 1×10⁶ клеток опухоли LLC, экспрессирующих sclL-12-IL-2 (пустые кружки). По оси Х указано время (дни), прошедшее после инъекции опухолевых клеток. По оси Y указан средний объем опухолей в мм³.

СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает белковые молекулы, в которых два или более различных цитокина слиты или образуют комплекс. Белковые комплексы или слитые белки могут факультативно включать дополнительные белковые составляющие, в том числе составляющие, способные к мультимеризации и адресованию, такие как области Fc и участки антител, содержащие сайты соединения с антигеном. Изобретение предлагает также нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки с несколькими цитокинами. Изобретение также предусматривает способы конструирования нуклеиновых кислот, кодирующих слитые белки с несколькими цитокинами, способы продуцирования слитых белков с несколькими цитокинами и способы применения слитых белков с несколькими цитокинами для лечения заболеваний и болезненных состояний.

В том смысле, как он использован здесь, термин «цитокин» относится к секретируемому белку или его активному фрагменту или мутантной форме, который модулирует активность клеток иммунной системы. Примеры цитокинов включают интерлейкины, интерфероны, хемокины, факторы некроза опухолей, стимулирующие образование колоний факторы для предшественников иммунных клеток и т.д.

В том смысле, как он использован здесь, термин «гетеродимерный цитокин» относится к цитокину, состоящему из двух различных белковых субъединиц. IL-12 является единственным известным до настоящего времени природным гетеродимерным цитокином. Однако могут быть сконструированы искусственные гетеродимерные цитокины. Например, можно объединить IL-6 и растворимый фрагмент IL-6R, получая гетеродимерный цитокин. То же самое можно сделать с CNTF и CNTF-Rα (Trinchieri // Blood. 1994. Т.84. С.4008).

В том смысле, как он использован здесь, термин «интерлейкин-12» (IL-12) обозначает двухсубъединичный цитокин, состоящий из субъединиц р35 и р40, или активное одноцепочечное слияние р35 и р40, или его разновидность, фрагмент или производное.

В том смысле, как он использован здесь, термин «интерлейкин-2» (IL-2) обозначает IL-2 любого млекопитающего, такой как человеческий IL-2, мышиный IL-2, или его активный видовой или аллельный вариант, фрагмент или производное.

В том смысле, как он использован здесь, термин «GM-CSF» обозначает цитокиновый белок млекопитающих - фактор стимуляции образования колоний гранулоцитов/моноцитов (Granulocyte/Monocyte-Colony Stimulating Factor), такой как человеческий GM-CSF, мышиный GM-CSF, или его активный видовой или аллельный вариант, фрагмент или производное.

В том смысле, как он использован здесь, термин «область Fc иммуноглобулина» означает карбоксильно-концевой участок константной области тяжелой цепи иммуноглобулина или его аналог или долю. Например, область Fc иммуноглобулина IgG может содержать по меньшей мере часть шарнирной области, домен СН2 и домен СН3. В предпочтительном примере осуществления область Fc включает по меньшей мере часть шарнирной области и домен СН3. В другом предпочтительном примере осуществления область Fc включает по меньшей мере домен СН2 и более предпочтительно включает также по меньшей мере часть шарнирной области.

В том смысле, как он использован здесь, термин «пептидный мостик» означает один или несколько пептидов, использованных для соединения вместе двух белков (например, белка и области Fc). Пептидный мостик часто представляет собой последовательность аминокислот, таких как, например, с преобладанием глицина и/или серина. Предпочтительно пептидный мостик представляет собой смешанную последовательность с преобладанием остатков глицина и серина длиной приблизительно 10-15 аминокислот.

В том смысле, как он использован здесь, термин «мультимерный» относится к стабильному соединению двух или более белковых субъединиц путем ковалентного или нековалентного взаимодействия, например путем соединения дисульфидными связями.

В том смысле, как он использован здесь, термин «димерный» относится к специфической мультимерной молекуле, в которой две белковые субъединицы стабильно соединены с участием ковалентных или нековалентных взаимодействий. Стабильный комплекс - это комплекс с такой скоростью