Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая лиганд cd86 кошки, диагностический олигонуклеотид, клонирующий вектор, вакцина, способы индукции или подавления иммунитета у кошки

Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая лиганд cd86 кошки, диагностический олигонуклеотид, клонирующий вектор, вакцина, способы индукции или подавления иммунитета у кошки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка имеет приоритет по патентной заявке США №09/071699, поданной 1 мая 1998 г., полное содержание которой включено в данную заявку в качестве ссылки. В тексте данной заявки ссылки на другие публикации приведены в скобках. Полную библиографию для этих ссылок можно найти в конце текста непосредственно перед списком последовательностей. Содержание этих публикаций в полном объеме включено в настоящую заявку в качестве ссылок с целью более полного описания состояния проблемы в той области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Предпосылки изобретения

В настоящее время отсутствуют эффективные вакцины для профилактики иммунодефицита кошачьих и инфекционного перитонита кошачьих у домашних кошек. Сейчас доступны вакцины против вируса лейкоза кошачьих, однако их эффективность остается сомнительной, а в ряде случаев они могут вызывать заболевание. Следовательно, в данной области техники имеется потребность в агентах и композициях, которые бы защищали от этих и других заболеваний, против которых пока нет вакцин или уже существующие и обычно применяемые вакцины против которых требуется улучшить. Кроме того, затруднена вакцинация котят из-за невозможности противостоять материнским антителам у них. Значит, также есть необходимость в безопасных и эффективных агентах для преодоления таких барьеров.

Стимуляция в организме активации и пролиферации Т-лимфоцитов в ответ на заболевание, как считается, определяется двумя взаимодействиями: распознаванием Т-клеточного рецептора (TCR) иммуногенными пептидами с участием молекул класса I главного комплекса гистосовместимости (МНС) и вторичное взаимодействие вспомогательных лигандов, таких как CD80 и CD86, с соответствующими им рецепторами - CD28 и (или) CTLA-4 - на поверхности Т-лимфоцита. Эффективное взаимодействие этих двух механизмов обусловливает активацию и пролиферацию и CD4-позитивных, и CD-8-позитивных Т-клеток и увеличение выработки иммунорегуляторных цитокинов типов Th1 и Th2. В отсутствие адекватной костимуляции Т-клеток может развиваться анергическое состояние, при котором Т-клетки не способны пролиферировать и выделять цитокины. В течение многих лет ключевыми регуляторами Т-клеточных ответов считались две молекулы - рецептор CD28 и его лиганды CD80 и CD86. CD28 является первичным Т-клеточным костимуляторным рецептором, который по связыванию с CD80 и CD86 усиливает пролиферацию Т-клеток и синтез цитокинов, предотвращая гибель Т-клеток. CTLA-4 (также обозначаемый как CD152), являющийся гомологом CD28, также играет важную роль в процессе костимуляции. Хотя это точно не определено, предполагается, что он подавляет костимуляторные Т-клеточные ответы. Взаимодействие между CD28, CTLA-4 и их лигандами CD80 и CD86 в процессе костимуляции является ключом к индукции и супрессии иммунных ответов на заболевание в организме в целом. Путем манипулирования этими четырьмя костимуляторными молекулами по-видимому можно регулировать Т-клеточный ответ по пути активации, подавления или изменения направления, можно усиливать желаемый иммунный ответ в отношении конкретного патогена или заболевания. В частности, они могут быть использованы для вакцинации против инфекционных заболеваний, для лечения инфекционных заболеваний и лечения опухолевых дегенеративных, аутоиммунных и иммунодефицитных состояний.

Т-лимфоциты иммунной системы млекопитающих выполняют и регуляторные, и эффекторные функции. Предшественники Т-клеток возникают в костном мозге из стволовых клеток и мигрируют в тимус. В тимусе происходят процессы созревания и селекции с образованием популяции наивных иммунокомпетентных клеток, которые способны распознавать антиген при его презентации в сочетании с главным комплексом гистосовместимости (МНС), но при этом не являются аутореактивными. После созревания в тимусе каждая Т-клетка несет клональный Т-клеточный рецептор (TCR), который определяет ее антигенную специфичность. Кроме того, Т-клетки двух основных подклассов, обнаруживаемых у большинства взрослых млекопитающих - CD4⁴⁺ и CD8⁺, несут TCR, составленный α- и β-субъединицами (Allison & Lanier, 1987).

Полипептидная и генная организация белка TCR сходна с таковой, характерной для молекул иммуноглобулина (Ig), и она проявляет многие сходные характеристики по сравнению с мембраносвязанными Ig В-лимфоцитов (Allison & Lanier, 1987). Как и молекула Ig, TCR потенциально должен распознавать огромное количество возможных антигенных последовательностей. С этой точки зрения организация и реаранжировка гена TCR сходна по своей сложности с таковыми в В-клетках (Davis & Bjorkman, 1988). Как и в случае с иммуноглобулинами В-клеток, образование идиотипического многообразия Т-клеток связано с наличием множественных копий генов вариабельных доменов (V) в линии половых клеток, происходящими случайным образом реаранжировками α- и β-субъединиц и с изменчивостью, обусловливаемой явлениями соединений и вставок (Davis & Bjorkman, 1988). Однако, в отличие от В-клеток, образование многообразия Т-клеток по-видимому не связано с соматическими мутациями, хотя потенциальный репертуар молекул TCR не уступает таковому молекул Ig (Lechler et al., 1990).

Молекула TCR хотя и отвечает за распознавание антигена, не способна к передаче сигнала (Allison & Lanier, 1987). Конформационные изменения TCR после связывания с участием антигена МНС, находящегося на антигенпрезентирующих клетках (АРС), обусловливает передачу сигнала через нековалентный комплекс поверхностных молекул, включающий CD3 и ζ-субъединицы (Clevers et al., 1988). Связывание на TCR обусловливает фосфорилирование СD3-комплекса, что косвенным образом приводит к внесению в клетку ионов кальция, в результате чего происходит инициация выработки IL-2 и IL-2R (Weiss & Littman, 1994). Этот каскад рассматривается как исходное событие в активации Т-клеток.

TCR распознает антиген только тогда, когда он презентирован с участием МНС. Известны два класса МНС-белков, которые связаны с процессом презентирования антигена на Т-клетке. Молекулы класса I МНС обнаруживаются практически на всех ядерных клетках тела, и их функцией является перенос эндогенных пептидов на поверхность клеток (Matasumura et al., 1992). Пептид, экспрессированный с участием МНС класса I, распознается Т-клетками, экспрессирующими CD8 в связи с TCR (Littman, 1987). CD8-позитивные Т-клетки выполняют функцию иммунного надзора за уничтожением клеток, зараженных вирусом, и опухолевых клеток. Распознавание Т-клеткой CD8⁺ "чужих" молекул (пептидов или измененных своих пептидов, что может свидетельствовать о развитии опухоли) обусловливает разрушение этой клетки, осуществляемое с участием цитотоксичных Т-лимфоцитов (CTL) (Berke, 1994).

Молекулы класса II МНС, представляющие вторую группу факторов главного комплекса гистосовместимости, в норме обнаруживаются только у специализированных антигенпрезентирующих клеток, включая В-лимфоциты, макрофаги/моноциты и дендритные клетки, хотя возможна их индукция и в некоторых других типах клеток в ответ на специфичные стимулы (Germain, 1993). Молекула класса II МНС отвечает за презентирование внешнего антигена на CD4-позитивную Т-клетку. Антиген, который был фагоцитирован, эндоцитирован или связан поверхностным Ig с последующим поглощением клеткой, претерпевает эндогенную обработку и связывается с молекулой класса II МНС (Unanue, 1987). Затем такая молекула выходит на поверхность клетки и становится доступной для распознавания ее CD4-позитивными Т-клетками αβ-TCR (Littman, 1987). Распознавание антигена Т-клетками CD4⁺ обусловливает выработку цитокинов и факторов роста, необходимых для инициации и распространения различных элементов активного иммунного ответа (Mosmann & Coffman, 1987).

Дифференцировка групп Т-клеток αβ-TCR определяется наличием CD4 и CD8, что связано с детерминацией функций каждой из этих групп. Одновременное присутствие CD4 и CD8 на Т-клетке исключено (Littman, 1987). Т.е. в процессе селекции и созревания в тимусе Т-клетки-αβ получают только CD4 либо CD8. Эти молекулы обеспечивают стабильность взаимодействия между TCR и МНС-связанным антигеном и определяют для данной Т-клетки то, каким классом молекул МНС (I или II) презентируется антиген (Littman, 1987). Связывающий домен молекулы CD4 или CD8 распознает соответствующий неполиморфный участок молекулы класса I или класса II (Clayberger et al., 1994). Связывание CD4 или CD8 с этими специфическими участками обеспечивает стабильность взаимодействия TCR и МНС-связанного антигена с точки зрения инициации Т-клеточной активации (Littman, 1987). Таким образом, CD4-позитивные Т-клетки функционально взаимодействуют только с клетками АРС, презентирующими антиген с помощью молекул класса II и инициирующими тем самым Т-хелперный ответ, в то время как CD8-позитивные Т-клетки распознают только антиген, презентируемый с участием молекул класса I, после связывания которого инициируется цитотоксический ответ (Germain, 1993). Два различающихся фенотипа - Т-хелперы и CTL - могут быть идентифицированы по поверхностно-клеточной экспрессии либо CD4, либо CD8.

Большинство CD4-позитивных Т-лимфоцитов в целом рассматриваются как Т-хелперная популяция, хотя имеется и предполагаемый CD4-позитивный CTL-подтип (Yasukawa et al., 1989). CD4-позитивные Т-хелперы являются основными регуляторами иммунного ответа за счет выработки серии стимуляторных и супрессорных цитокинов (Mosmann & Coffman, 1987). Вырабатываемые этими клетками факторы являются важными медиаторами инициации и гуморального, т.е. опосредованного антителами, и клеточного, т.е. гиперчувствительности замедленного типа (DTH), ответов (Mosmann & Coffman, 1987). Для того чтобы Т-клетки CD4⁺ активировались по выработке растворимых факторов роста, должен произойти сложный каскад процессов. Антиген выявляется и подвергается эндоцитозу специфическими АРС-клетками, которые в норме являются макрофагами (Unanue, 1984). АРС денатурируют антигенный белок и разделяют его на меньшие фрагменты, после чего 15-18-аминокислотные пептиды связываются молекулами МНС в эндоплазматическом ретикулюме и после этого переносятся на поверхность клетки (Rotzschke et al., 1994). Перенесенный на поверхность антиген становится в результате "видимым" для Т-клеток и может быть распознан группами Т-клеток, экспрессирующих CD4 и имеющих соответствующий TCR-идиотип (Germain, 1993). Когда происходит точное распознавание антигена Т-клеткой и образуются точные вспомогательные сигналы, происходит дифференцировка "наивного" лимфоцита и запускается его клональная пролиферация. По пока не установленным причинам происходит предпочтительное формирование ответа 1-го типа (клеточного) по отношению к ответу 2-го типа (гуморальному) (Mosmann & Coffman, 1989).

Участие Т-хелперов является необходимым для обеспечения активности и гуморального, и клеточного ответов. В зависимом от Т-клеток В-клеточном ответе, необходимом для выработки антител к большинству антигенов, Т-хелперы нужны для обеспечения правильного созревания В-клеток (Chesnut et al., 1986). После того как экспрессируемый. В-клеткой поверхностный Ig связал антиген, происходит интернализация, процессинг и вывод антигена на поверхность молекулами класса II МНС (Germain, 1993). Непосредственный межклеточный контакт между Т-клеткой CD4⁺, имеющей точный TCR-идиотип, и В-клеткой способствует активации и пролиферации этой Т-клетки (Chesnut et al., 1986). Активированный Т-хелпер может инициировать ответ 2-го типа за счет секреции факторов, необходимых для роста и дифференцировки В-клеток (Mosmann & Coffman, 1989). Этими факторами являются интерлейкины IL-4, IL-5 и IL-13, которые способны индуцировать активацию и пролиферацию В-клеток, а также важны в процессе изотипического переключения молекул антител, в то время как IL-10 предотвращает инициацию ответа 1-го типа, что в свою очередь является фактором негативной регуляции гуморального ответа (Mosmann & Coffman, 1989).

Клеточные, ответы (1-й тип) индуцируются не так, как гуморальные ответы (2-й тип) (Sher et al., 1992). После активации Т-клеток и их созревания для ответа 1-го типа этой Т-клеткой вырабатываются факторы, которые способствуют клеточному иммунитету. IL-2 является Т-клеточным фактором роста, который также активирует CTL-ответы, в то время как γ-интерферон активирует макрофаги, CTL и нейтрофилы (Wang et а1., 1993).

Таким образом, Т-хелперы способны опосредовать два принципиально взаимоисключающих ответа. Признак секреции цитокинов, связанный с инициацией гуморального ответа, включает факторы, которые являются супрессорами клеточного ответа, и наоборот (Mosmann & Coffman, 1989). Пока неясно, что заставляет Т-клетку проявлять либо признак 1-го типа (выработка IL-2, γ-интерферона и лимфотоксина), либо признак 2-го типа (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и IL-13), хотя предполагается, что на формирующийся вариант цитокинового профиля могут влиять тип АРС, которая презентирует данный антиген, или растворимые факторы, вырабатываемые этой АРС (Mosmann & Coffman, 1989). В дополнение к хелперным клеткам 1-го и 2-го типов существует так называемый 0-й тип хелперов, который характеризуется параметрами цитокиновой секреции, промежуточными по отношению к 1-му и 2-му типам (Gajewski et al., 1989). Хотя типы хелперов в основном были охарактеризованы в экспериментах in vitro, т.е. могут отражать культуральные артефакты, они являются важными моделями той роли, которую Т-хелпер играет в контроле развития специфических ответов в ситуации in vivo.

В дополнение к CD4-позитивным Т-хелперным лимфоцитам вторая популяция Т-клеток-αβ составлена CD8-позитивными цитотоксическими лимфоцитами (CTL). Считается, что CTL-CD8⁺ играют ведущую роль в системе иммунного надзора, основная функция которой связана с разрушением клеток, инфицированных вирусами или внутриклеточными бактериями, а также опухолевых клеток (Berke, 1994). Эти клетки также способы вырабатывать цитокины, но, в целом, только такие, которые связаны с индукцией клеточных ответов (IL-2, γ-интерферон и TNF) (Fong & Mosmann, 1990). Рецептор TCR этих клеток с участием CD8 распознает антиген, презентированный с помощью молекул класса I MHC (Littman, 1987). В целом, все ядерные клетки характеризуются поверхностной экспрессией молекул класса I, презентирующих внутриклеточно синтезированные пептиды (Matasumara, 1992). Специфичные по иммунной активности участки, включая головной мозг и семенники, характеризуются низким уровнем белкового синтеза, хотя он и индуцируется в этих участках под воздействием интерферона (Moffett & Paden, 1994).

Белки, вырабатываемые в эндоплазматическом ретикулюме в ходе нормальной жизнедеятельности клетки, денатурируются, частично расщепляются и с помощью молекул класса I MHC выносятся на поверхность (Engelhard, 1994). Эти полипептиды протеолитически линеаризуются и связываются в виде 9-12-аминокислотных эпитопов молекулами класса I, которые затем выносятся на поверхность этой клетки (Engelhard, 1994). Теоретически таким образом на поверхности могут оказаться любые внутриклеточно синтезированные белки, поэтому в результате селекции в тимусе обусловливается идеальная элиминация всех аутореактивных Т-клеток, а система иммунного надзора может выявить присутствие инфицированных вирусом или трансформированных клеток (Berke, 1993). Распознавание чужеродных пептидов, экспрессируемых молекулами класса I, осуществляется антиген-специфичными Т-клеточными рецепторами на поверхности CTL-CD8⁺ (Lechler et al., 1990). Для активации необходим контакт между эффекторной клеткой и мишенью (Berke, 1994). Когда антиген, рассматриваемый как чужеродный, детектируется рецептором TCR, взаимодействие молекул стабилизируется за счет связывания CD8 с молекулой класса I на поверхности инфицированной клетки (Littman, 1987). После распознавания и активации Т-клетки образуется "конъюгат" между клеткой-мишенью и эффекторной Т-клеткой, после чего эффекторная клетка уничтожается (Taylor & Cohen, 1992). Таким образом, в таком механизме при изменении собственных белков или при нарушении клеточных механизмов в результате атаки патогена пептиды становятся распознаваемыми системой иммунного надзора, в результате чего данный элемент иммунной системы обеспечит уничтожение больной клетки (Berke, 1994).

Цитотоксичность, как считается, обусловливается одним из двух основных механизмов. Либо в клетке индуцируется апоптоз, либо она лизируется с участием цитотоксических гранул, секретируемых CTL (Berke, 1993). Апоптоз в клетках-мишенях индуцируется путем секреции клетками CTL факторов, которые индуцируют экспрессию генов, обусловливающих гибель клетки (Russel, 1983). Преимуществом этого механизма является отсутствие лизиса клетки, что снижает вероятность выхода потенциально инфекционно опасного содержимого этой клетки (Nagata & Golstein, 1995). Однако клеточный лизис может являться наиболее общим механизмом, в соответствии с которым происходит направленное уничтожение клеток. Основным компонентом вырабатываемых клетками CTL "цитотоксических гранул" является белок перфорин, который "протыкает" мембраны клеток-мишеней (Liu et al., 1995). Хотя существуют и другие типы клеток, вовлеченных в данную форму иммунного надзора, считается, что CTL являются основным компонентом противовирусного и противоопухолевого иммунитета и рассматриваются как необходимое звено в защите от конкретных патогенов (Kupfer & Singer, 1989).

Исходно поверхностно-клеточные белки использовались для разграничения конкретных клеточных популяций. Позже были установлены функциональные аспекты многих из этих молекул, а с учетом их значения для дифференцировки клеточных популяций стала более понятной их важная роль в функционировании многих клеток.

Различные вспомогательные молекулы и молекулы адгезии, которые участвуют в развитии иммунного ответа, экспрессируются Т-клетками и антиген-презентирующими клетками (van Seventer et al., 1991). Молекулы адгезии экспрессируются на определенном уровне большинством клеток иммунной системы. Они важны для сохранения клеток в определенном участке и для инициации и поддержания межклеточных контактов (Mescher, 1992).

Два комплекса молекул адгезии - CD2/LFA-3 (CD58) и LFA-1/ICAM-1 - участвуют в стабилизации взаимодействия Т-клеток и клеток АРС и усилении активности (Springer et al., 1987). CD2 является одним из первых маркеров, экспрессируемых предшественниками Т-лимфоцитов, и существует на протяжении всей жизни этой клетки, в то время как LFA-1 экспрессируется Т-клетками позже и позитивно регулируется в клетках памяти или по типу индуцибельности (Springer et al., 1987).

Комплексы вспомогательных молекул также проявляют адгезионные свойства, но их основной функцией, по-видимому, является передача межклеточного сигнала после связывания лиганда (Anderson et al., 1988). После установления взаимодействия между рецептором и его лигандом происходит такое изменение конформационной структуры молекулы, которое обусловливает передачу сигнала в цитоплазму одной или обеих клеток (Hutchcroft & Bierer, 1994). Передаваемые этими молекулами сигналы выполняют ряд функций по способствованию развитию Т-клеток, однако в отсутствие сигналов, опосредуемых этими молекулами, Т-клетки могут становиться анергическими (Leung & Lindsley, 1994).

Взаимодействие CD28/CD80 является основным компонентом интенсивного иммунного ответа, опосредуемого Т-клетками (Linsley et al., 1993a). Взаимодействие вспомогательных молекул CD28 с соответствующим им лигандом CD80 необходимо для полной активации и пролиферации "наивных" Т-клеток (Linsley et al., 1991a). Также это взаимодействие, как считается, играет ключевую роль в пролиферации активированных CD4-позитивных Т-клеток памяти и в предотвращении апоптотической гибели клеток (Linsley et al., 1991a). Установление такого взаимодействия и расшифровка его механизмов дает ключ к пониманию процессов иммунитета, опосредуемого Т-клетками.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенной и очищенной ДНК, кодирующей лиганд CD80 (В7-1) кошки, лиганд CD86 (В7-2) кошки, рецептор CD28 кошки или рецептор CTLA-4 (CD152) кошки, а также к векторам, включающим нуклеиновую кислоту, кодирующую CD80 кошки, CD86 кошки, CD28 кошки или CTLA-4 кошки. Настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, трансформированным CD80-кодирующими векторами, CD86-кодирующими векторами, CD28-кодирующими векторами или CTLA-4-кодирующими векторами. Настоящее изобретение относится к полипептидам, кодируемым нуклеиновой кислотой CD80 кошки, CD86 кошки, CD28 кошки или CTLA-4 кошки.

Настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей эффективное количество полипептидов, кодируемых нуклеиновой кислотой CD80 кошки, CD86 кошки, CD28 кошки или CTLA-4 кошки. Также настоящее изобретение относится к вакцинам, которые дополнительно содержат иммуногены, производные от патогенов. Настоящее изобретение относится к вакцинам, способным усиливать иммунный ответ. Также настоящее изобретение относится к вакцинам, способным подавлять иммунный ответ.

Краткое описание чертежей

Фигура 1А. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности CD80 (В7-1) кошки (TAMU) (SEQ ID NO: 1 и 2).

Фигура 1В. Спектр гидрофобности аминокислотной последовательности CD80 (В7-1) кошки (TAMU).

Фигура 2А. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности CD80 (В7-1) кошки (SYNTRO) (SEQ ID NO: 3 и 4).

Фигура 2В. Спектр гидрофобности аминокислотной последовательности CD80 (В7-1) кошки (SYNTRO).

Фигура 3А. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности CD86 (В7-2) кошки (SEQ ID NO: 5 и 6).

Фигура 3В. Спектр гидрофобности аминокислотной последовательности CD86 (В7-2) кошки.

Фигура 4А. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности CD28 кошки (SEQ ID NO: 7 и 8).

Фигура 4В. Спектр гидрофобности аминокислотной последовательности CD28 кошки.

Фигура 5А. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности CTLA-4 (CD152) кошки (SEQ ID NO: 9 и 10).

Фигура 5В. Спектр гидрофобности аминокислотной последовательности CTLA-4 (CD152) кошки.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение представляет выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую лиганд CD80 кошки или растворимый лиганд CD80 кошки. Также настоящее изобретение представляет выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую лиганд CD86 кошки или растворимый лиганд CD86 кошки. Также настоящее изобретение представляет выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую рецептор CD28 кошки или растворимый рецептор CD28 кошки. Также настоящее изобретение представляет выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую рецептор CTLA-4 кошки или растворимый рецептор CTLA-4 кошки.

В одном из осуществлении настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую лиганд CD80 кошки, который характеризуется аминокислотной последовательностью, показанной на фиг.1А, начиная с остатка метионина и заканчивая остатком треонина (SEQ ID NO: 1). В другом осуществлении настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую лиганд CD86 кошки, который характеризуется аминокислотной последовательностью, показанной на фиг.3А, начиная с остатка метионина и заканчивая остатком глутамина (SEQ ID NO: 5). Еще в одном осуществлении настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую рецептор CD28 кошки, который характеризуется аминокислотной последовательностью, показанной на фиг.4А, начиная с остатка метионина и заканчивая остатком серина (SEQ ID NO: 7). В другом осуществлении настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую рецептор CTLA-4 кошки, который характеризуется аминокислотной последовательностью, показанной на фиг.5А, начиная с остатка метионина и заканчивая остатком аспарагина (SEQ ID NO: 9).

В осуществлении описывавшегося выше изобретения нуклеиновой кислотой является ДНК или РНК. В другом осуществлении ДНК является кДНК или геномной ДНК.

Настоящее изобретение представляет олигонуклеотид, состоящий по крайней мере из 12 нуклеотидов, характеризующийся комплементарностью по отношению к уникальной последовательности, имеющейся в составе нуклеиновой кислоты, кодирующей CD28, CD80, CD86 или CTLA-4, описанной выше. В другом осуществлении настоящего изобретения представляется олигонуклеотид, состоящий по крайней мере из 15 или 16 нуклеотидов, который характеризуется комплементарностью по отношению к уникальной последовательности, присутствующей в составе нуклеиновой кислоты, кодирующей CD28, CD80, CD86 или CTLA-4, описанной выше.

В другом осуществлении описываемого выше изобретения представляется олигонуклеотид, который помечен определяемой меткой. В одном из осуществлений выявляемой, меткой является радиоактивный изотоп, флуорофор или биотин. В другом осуществлении такой олигонуклеотид избирательно метилирован.

Настоящее изобретение представляет вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую лиганд CD80 кошки или растворимый лиганд CD80 кошки. В другом осуществлении настоящего изобретения представляется плазмидный вектор, обозначенный PSI-B7-1/871-35 (Коллекция АТСС, депозитарный №209817). Эта плазмида была депонирована в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) 29 апреля 1998 года (адрес которой - 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20108-0971, США) в соответствии с Будапештским соглашением о Международных правилах депонирования микроорганизмов для целей осуществления процедуры патентования.

Настоящее изобретение представляет вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую лиганд CD86 кошки или растворимый лиганд CD86 кошки. В другом осуществлении настоящего изобретения представляется плазмидный вектор, обозначенный В7-2#19-2/011298 (АТСС, депозитарный №209821). Эта плазмида была депонирована в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) 29 апреля 1998 года (адрес которой - 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20108-0971, США) в соответствии с Будапештским соглашением о Международных правилах депонирования микроорганизмов для целей осуществления процедуры патентования.

Настоящее изобретение представляет вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую рецептор CD28 кошки или растворимый рецептор CD28 кошки. В другом осуществлении настоящего изобретения представляется плазмидный вектор, обозначенный PSI-CD28-#7/100296 (АТСС, депозитарный №209819). Эта плазмида была депонирована в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) 29 апреля 1998 года (адрес которой - 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20108-0971, США) в соответствии с Будапештским соглашением о Международных правилах депонирования микроорганизмов для целей осуществления процедуры патентования.

Настоящее изобретение представляет вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую рецептор CTLA-4 кошки или растворимый рецептор CTLA-4 кошки. В другом осуществлении настоящего изобретения представляется плазмидный вектор, обозначенный CTLA-4-#1/091997 (АТСС, депозитарный №209820). Эта плазмида была депонирована в Американскую коллекцию типовых культур (АТСС) 29 апреля 1998 года (адрес которой - 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20108-0971, США) в соответствии с Будапештским соглашением о Международных правилах депонирования микроорганизмов для целей осуществления процедуры патентования.

Настоящее изобретение представляет описанный выше вектор, который дополнительно включает промотор, функционально присоединенный к нуклеиновой кислоте. В другом осуществлении настоящее изобретение представляет клетку-хозяина, которая несет любой из упоминавшихся выше векторов. В одном из осуществлений такой клеткой-хозяином, несущим один из упомянутых выше векторов, является эукариотическая или прокариотическая клетка. В другом осуществлении клеткой-хозяином являются клетки E.coli, клетки дрожжей, клетки COS, клетки РС12, клетки СНО или клетки GH4C1.

Настоящее изобретение представляет полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой лиганда CD80 кошки или растворимого лиганда CD80 кошки. В осуществлении настоящего изобретения представляется полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой лиганда CD86 кошки или растворимого лиганда CD86 кошки. В другом осуществлении настоящего изобретения представляется полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой рецептора CD28 кошки или растворимого рецептора CD28 кошки. Настоящее изобретение представляет полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой рецептора CTLA-4 кошки или растворимого рецептора CTLA-4 кошки.

В другом осуществлении настоящего изобретения представляется способ продукции упоминавшихся выше полипептидов путем культивирования клетки-хозяина, которая экспрессирует эти полипептиды, и выделения этих полипептидов, получаемых таким образом.

Настоящее изобретение представляет вакцину, содержащую эффективное количество упоминавшихся выше полипептидов и подходящий носитель. В другом осуществлении изобретения представляется вакцина, в составе которой эффективное количество упомянутого выше полипетида и подходящего носителя является количеством от примерно 0,01 мг до примерно 100 мг на 1 дозу. В другом осуществлении изобретения представляется вакцина, в которой эффективное количество упомянутого выше полипетида и подходящего носителя является количеством от примерно 0,25 мг на 1 кг веса тела кошки в день до примерно 25 мг на 1 кг веса тела кошки в день.

Далее настоящее изобретение представляет упоминавшуюся выше вакцину, которая дополнительно содержит иммуноген, производный от патогена. В другом осуществлении изобретения такой иммуноген в составе вакцины происходит от кошачьего патогена, вируса бешенства, хламидии, Toxoplasma gondii, Dirofilaria immitis, блох или бактериальных патогенов. В другом осуществлении изобретения представляется вакцина, в составе которой патогеном является вирус иммунодефицита кошачьих (FIV), вирус лейкоза кошачьих (FeLV), вирус инфекционного перитонита кошачьих (FIP), вирус панлейкопении кошачьих, калицивирус кошачьих, реовирус кошачьих 3-го типа, ротавирус кошачьих, коронавирус кошачьих, респираторно-синцитиальный вирус кошачьих, вирус саркомы кошачьих, герпесвирус кошачьих, вирус болезни Борна кошек или кошачий паразит.

Также настоящее изобретение представляет способ индукции иммунитета у кошек, который включает введение кошке дозы вакцины, содержащей любой из указывавшихся выше иммуногенов. Также настоящее изобретение представляет способ усиления иммунного ответа у кошки, который включает эффективную дозу полипептида, иммуногена и подходящего носителя. Настоящее изобретение представляет способ введения упомянутой выше вакцины подкожно, внутримышечно, системно, местно или перорально.

В другом осуществлении настоящего изобретения представляется способ подавления иммунного ответа у кошки, который включает введение этой кошке эффективного по подавлению иммунного ответа количества полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой CTLA-4 кошки. В другом осуществлении изобретения представляется способ подавления иммунного ответа у кошки, включающий введение этой кошке эффективного по подавлению иммунного ответа количества растворимого полипептида, кодируемого CD80 кошки, CD86 кошки или CD28 кошки.

В другом осуществлении настоящего изобретения представляется способ подавления иммунного ответа у кошки путем введения полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой CTLA-4 кошки, в количестве от примерно 0,25 мг на 1 кг веса тела в день до 25 мг на 1 кг веса тела в день. В другом осуществлении изобретения представляется способ подавления иммунного ответа у кошки путем введения полипептида, кодируемого CD80 кошки, CD 86 кошки или CD28 кошки, в количестве от примерно 0,25 мг на 1 кг веса тела в день до 25 мг на 1 кг веса тела в день.

Также настоящее изобретение представляет способ подавления иммунного ответа у кошки с диагнозом аутоиммунного заболевания или у кошки-реципиента пересадки ткани или органа путем введения этой кошке эффективного по подавлению иммунного ответа количества полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой CTLA-4 кошки.

Настоящее изобретение также представляет способ подавления иммунного ответа у кошки с диагнозом аутоиммунного заболевания или у кошки-реципиента пересадки ткани или органа путем введения этой кошке эффективного по подавлению иммунного ответа количества полипептида, кодируемого CD80 кошки, CD86 кошки или CD28 кошки.

Настоящее изобретение представляет выделенную и очищенную кДНК CD80 (В7-1) длиной примерно 941 нуклеотид. Изобретение также представляет выделенный и очищенный полипептид CD80 кошки, состоящий примерно из 292 аминокислот, являющийся связанной с мембранной или зрелой формой с молекулярной массой 33,485 кДа, изоэлектрической точкой примерно pI=9,1 и общим зарядом при рН 7,0 равным 10. Коэкспрессия CD80 с костимуляторной молекулой CD28 и с опухолевым антигеном или антигеном патогенного организма проявляет способность к активации или усилению активации Т-лимфоцитов, индуцируя тем самым выработку иммуностимулирующих цитокинов, и к регуляции роста других клеточных типов. Коэкспрессия CD80 с костимуляторной молекулой CTLA-4 проявляет способность к регуляции активации Т-лимфоцитов.

Настоящее изобретение представляет выделенную и очищенную кДНК CD86 (В7-2) длиной примерно 1176 нуклеотидов. Также изобретение представляет выделенный и очищенный полипептид CD86 кошки, состоящий примерно из 320 аминокислот, являющийся связанной с мембранной или зрелой формой с молекулярной массой 36,394 кДа, изоэлектрической точкой примерно pI=9,19 и общим зарядом при рН 7,0, равным 11,27. Коэкспрессия CD86 с костимуляторной молекулой CD28 и с опухолевым антигеном или антигеном патогенного организма проявляет способность к активации или усилению активации Т-лимфоцитов, индуцируя тем самым выработку иммуностимулирующих цитокинов, и к регуляции роста других клеточных типов. Коэкспрессия CD86 с костимуляторной молекулой CTLA-4 проявляет способность к регуляции активации Т-лимфоцитов.

CD80 или CD86 кошки по настоящему изобретению были получены из нативных или рекомбинантных источников. CD80 или CD86 кошки по настоящему изобретению включают нативную и связанную с мембраной форму или секретируемую форму, утратившую трансмембранный домен.

Настоящее изобретение представляет выделенную и очищенную кДНК CD28 длиной примерно 689 нуклеотидов. Также изобретение представляет выделенный и очищенный полипептид CD28 кошки, состоящий примерно из 221 аминокислоты, являющийся связанной с мембранной или зрелой формой с молекулярной массой 25,319 кДа, изоэлектрической точкой примерно pI=9,17 и суммарным зарядом при рН 7,0, равным 9,58.

Также настоящее представляет выделенную и очищенную кДНК CTLA-4 длиной примерно 749 нуклеотидов. Также изобретение представляет выделенный и очищенный полипептид CTLA-4 кошки, состоящий примерно из 223 аминокислот, являющийся связанной с мембранной или зрелой формой с молекулярной массой 24,381 кДа, изоэлектрической точкой примерно pI=6,34 и суммарным зарядом при рН 7,0, равным 0,99.

В другом аспекте настоящее изобретение представляет способ усиления иммунного ответа у кошки на иммуноген, что достигается введением этого иммуногена до, после или по существу одновременно с CD80 кошки или CD86 кошки вместе с CD28 кошки или CTLA-4 кошки или без них в количестве, эффективном по усилению иммунного ответа.

В другом аспекте настоящего изобретения представляется способ подавления иммунного ответа у кошки на иммуноген, что достигается введением этого иммуногена до, после или по существу одновременно с CD80 кошки или CD86 кошки вместе с CD28 кошки или CTLA-4 кошки или без них или с антисмысловой РНК или ДНК, частично или полностью кодирующих CD80 кошки, или CD86 кошки, или CD28 кошки, или CTLA-4 кошки, в количестве, эффективном по подавлению иммунного ответа.

В следующем аспекте настоящего изобретения представляется вакцина для индукции иммунного ответа у кошек на иммуноген, содержащая этот иммуноген и количество CD80, эффективное по усилению иммунного ответа. Иммуноген является производным, например, от кошачьих патогенов, таких как вирус иммунодефицита кошки, вирус лейкоза кошки, парвовирус кошки, коронавирус кошки, лептовирус кошки и подобное.

В другом аспекте настоящего изобретения представляется вакцина для индукции иммунного ответа у кошки на иммуноген, что достигается введением ДНК или РНК иммуногена и ДНК или РНК вспомогательных молекул CD80, CD86, CD28 кошки в любом сочетании, которые кодируют белки или белковые фрагменты, в количестве, эффективном по модуляции иммунного ответа.

Белок CD80 кошки характеризуется аминокислотной последовательностью, которая на 59% и 46% идентична полипептидам человека и мыши соответственно. Белок CD86 кошки характеризуется аминокислотной последовательностью, которая на 68% и 64% идентична таким белкам человека и кролика соответственно. Белок CD28 кошки характеризуется аминокислотной последовательностью, которая на 82% и 74% идентична полипептидам человека и мыши соответственно. Белок CTLA-4 кошки характеризуется аминокислотной последовательностью, которая на 88% и 78% идентична полипептидам человека и мыши соответственно. Белки CD80 или CD86 мыши или человека не мог