Рекомбинантная плазмидная днк phins05, кодирующая гибридный полипептид, содержащий проинсулин человека, клетка escherichia coli, трансформированная рекомбинантной плазмидной днк phins05, и штамм бактерий escherichia coli jm109/phins05 - продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин человека

Рекомбинантная плазмидная днк phins05, кодирующая гибридный полипептид, содержащий проинсулин человека, клетка escherichia coli, трансформированная рекомбинантной плазмидной днк phins05, и штамм бактерий escherichia coli jm109/phins05 - продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин человека

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии, и может быть использовано для получения рекомбинантного инсулина человека.

Инсулин, пептидный гормон, синтезируется специализированными клетками в островках Лангерганса поджелудочной железы. Инсулин образуется из препрогормона (препроинсулина) в результате посттрансляционной модификации. На первом этапе от препроинсулина отщепляется сигнальная последовательность - N-концевой фрагмент, содержащий 23 аминокислотных остатка. Образовавшийся проинсулин (86 аминокислотных остатков) в комплексе Гольджи в результате выщепления С-пептида (35 аминокислотных остатков) превращается в инсулин при участии специфических пептидаз. Зрелый инсулин является полипептидом, состоящим из двух цепей: А-цепь (21 аминокислотный остаток) и В-цепь (30 аминокислотный остаток), связанных между собой двумя дисульфидными мостиками.

В настоящее время большую часть инсулина человека получают с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Производство рекомбинантного инсулина человека основано главным образом на использовании гена проинсулина человека, полученного химико-ферментативным синтезом [1,2]. При этом широко используется методология экспрессии гена проинсулина человека в клетках Е. coli в составе гибридных белков в виде нерастворимых "тел включения". В качестве лидерных последовательностей, защищающих рекомбинантный белок от протеолитической деградации, использовали бычий протимозин [3], глутатион-S-трансферазу [4], иммуноглобулин связывающий (IgG) домен белка А из S.aureus Х [5, 6] и др. После выделения гибридного белка из тел включения и его ренатурации проводят отщепление проинсулина от лидерного пептида, которое достигается либо обработкой бромцианом по остатку метионина [7, 8], либо путем специфического расщепления трипсином (ферментативного гидролиза) в месте соединения лидерной последовательности с проинсулином через остатки Arg, LysArg или Lys [6, 9]. Основным недостатком бромцианаового метода является использование высокотоксичного соединения - бромциана в крупномасштабном производстве.

Ферментативный гидролиз гибридного белка с проинсулином человека имеет преимущество, так как позволяет исключить из технологии высокотоксичный продукт. Гибридный белок, содержащий лидерную последовательность, соединенную через остатки Arg, LysArg или Lys с проинсулином человека, может быть специфически расщеплен смесью трипсина и карбоксипептидазы В с высоким выходом [6, 9]. Образующиеся при этом инсулин и С-пептид могут быть изолированы при помощи обращенно-фазовой хроматографии.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является рекомбинантная плазмидная ДНК pPINS07 с молекулярной массой 3,3 МДа, кодирующая гибридный полипептид массой около 17 кДа, в котором IgG-связывающий домен белка А из S.aureus соединен через пептидный линкер His₆GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека и штамм-продуцент Е. coli, трансформированный плазмидной ДНК pPINS07 [6]. Существенным недостатком штамма-продуцента, содержащего плазмиду pPINS07, является продукция им гибридного белка, содержащего высокую долю лидерного пептида, составляющего около 50%. Использование штамма-продуцента, содержащего плазмиду pPINS07, в производстве инсулина удорожает процесс производства из-за повышения затрат на синтез и снижает выход целевого продукта.

Задачей изобретения является получение высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента, позволяющего увеличить выход проинсулина человека и удешевить технологический процесс получения целевого продукта - инсулина человека.

Поставленная задача решается путем конструирования рекомбинантной плазмиды pHINS05, детерминирующей синтез гибридного белка с молекулярной массой около 14,5 кДа, в котором N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека соединен через пептидный линкер His₄GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, и создания штамма-продуцента Escherichia coli JM109/pHINS05, обеспечивающего индуцибельный биосинтез гибридного полипептида с уровнем экспрессии не ниже 30% от суммарного клеточного белка, позволяющего увеличить выход проинсулина человека и удешевить технологический процесс получения целевого продукта - инсулина человека.

Преимущество предложенной плазмидной конструкции и штамма-продуцента, содержащего эту плазмиду, заключаются в биосинтезе гибридного полипептида с более высокой долей проинсулина человека благодаря уменьшению размера лидерной последовательности.

Исходной плазмидой для конструирования нового гена, кодирующего гибридный белок, содержащий проинсулин человека, послужила плазмида pNGIF01. Эта плазмида была сконструирована на основе векторной ДНК рКК223-3, у которой был удален фрагмент BamHI-Ehe I размером примерно 830 п.о., при помощи достройки "липких" концов после частичного гидролиза по BamHI и полного гидролиза по Ehe I и последующего лигирования полученных "тупых" концов. Полученная таким образом плазмидная ДНК рКК223-3-del размером примерно 3750 п.о. была использована в качестве вектора для клонирования фрагмента ДНК, кодирующей N-концевую последовательность гамма-интерферона человека, по сайтам EcoRI и BamHI. Фрагмент ДНК, кодирующий N-концевую последовательность гамма-интерферона с дополнительными 4His, был синтезирован при помощи полимеразной цепной реакции на матрице плазмидной ДНК pTTgKm2 [10] в присутствии специфических праймеров. Перед клонированием продукт амплификации был обработан рестриктазами EcoRI и BamHI для генерации "липких" концов. Полученная плазмидная ДНК pNGIF01 содержит между сайтами EcoRI и BamHI последовательность, кодирующую N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека с дополнительными 4His. Далее плазмида pNGIF01 была использована для конструирования плазмидной ДНК, кодирующей гибридный белок, в котором N-концевая последовательность гамма-интерферона с дополнительными 4His соединена с последовательностью проинсулина человека. Для этого нуклеотидная последовательность, кодирующая проинсулин человека, фланкированная сайтами рестрикции BamHI и HindIII, была получена из плазмидной ДНК pPINS07 [6] и клонирована в вектор, полученный гидролизом плазмидной ДНК pNGIF01 теми же рестриктазами. Лигированной смесью трансформировали компетентные клетки штамма E.coli JM109. В результате получили рекомбинантную плазмидную ДНК pHINS05, строение которой подтверждали рестрикционным анализом. Структура гена, кодирующего гибридный белок, была подтверждена секвенированием [11].

Рекомбинантная плазмидная ДНК pHINS05, кодирующая гибридный белок с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, характеризуется следующими признаками:

имеет молекулярную массу 2,75 МДа;

кодирует гибридный белок с молекулярной массой около 14,5 кДа, в котором N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека соединен через пептидный линкер His₄GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека;

состоит из: BamHI-EcoRI - фрагмента плазмиды рКК223-3 [12], содержащего промотор транскрипции tac, HindIII-EheI - фрагмента плазмиды рКК223-3, содержащего ген β-лактамазы (bla), участок инициации репликации (ori), терминатор транскрипции рибосомого оперона Е.coli, EcoRI-HindIII - фрагмента, включающего ген с последовательностью нуклеотидов, представленной на фиг.2, кодирующий N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека, пептидный линкер His₄GlySerArg и аминокислотную последовательность проинсулина человека;

содержит: tac-промотор транскрипции, ген, кодирующий гибридный белок, в котором N-концевая последовательность гамма-интерферона соединена через пептидный линкер His₄GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека; в качестве генетического маркера ген β-лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pHINS05 клеток бактерий к ампициллину; уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: EcoRI - 1, BamHI - 147, HindIII - 418, Pvu I - 1352.

Преимуществом предложенной плазмидной конструкции является то, что она обеспечивает эффективный биосинтез гибридного полипептида, содержащего более высокую долю проинсулина человека за счет уменьшения размера лидерной последовательности.

Для получения штамма-продуцента гибридного белка с проинсулином человека трансформируют компетентные клетки Escherichia coli JM109 рекомбинантной плазмидной ДНК pHINS05.

Полученный штамм Escherichia coli JM109/pHINS05 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки мелкие палочковидной формы грамотрицательные, неспороносные, 1×3,5 мкм, подвижные.

Культуральные признаки: при росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.

Физико-биохимические признаки: клетки растут при температуре 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 500 мг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена β-лактамазы (bla).

Полученный штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ОАО "Национальные Биотехнологии" под номером 05.

Предложенная рекомбинантная плазмидная ДНК pHINS05 также обеспечивает эффективный биосинтез гибридного полипептида с проинсулином человека в других бактериальных штаммах Escherichia coli.

На фиг.1 представлена физическая карта плазмиды pHINS05; на фиг.2 - нуклеотидная последовательность гена гибридного белка, содержащего проинсулин человека, плазмиды pHINS05 и кодируемая им аминокислотная последовательность.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Конструирование промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК pNGIF01.

К раствору 5 мкг плазмидной ДНК рКК223-3 в 20 мкл буфера, содержащего 33 мМ Трис-ацетата, рН 7,9,66 мМ К-асетата, 10 мМ Mg-ацетата и 0,1 мг/мл БСА (буфер 1), добавляют 10 ед рестриктазы Ehe I и смесь инкубируют 1,0 час при 37°С. Далее смесь прогревают 10 мин при 70°С для инактивации фермента. Затем ДНК осаждают этиловым спиртом, растворяют в 20 мкл буфера 1 и гидролизуют 5 ед рестриктазы BamHI в условиях частичного гидролиза 10 мин при 30°С. Из полученного гидролизата выделяют фрагмент ДНК величиной около 3700 п.о. при помощи электрофореза в 0,8% геле легкоплавкой агарозы. Далее ДНК депротеинизируют фенолом, смесью фенол с хлороформом (1:1), хлороформом, осаждают этиловым спиртом, растворяют в 20 мкл воды. Полученную ДНК обрабатывают 10 мин при 20°С 5 ед фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli в 20 мкл буфера, содержащего 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂ и 10 мМ меркаптоэтанол и 25 мкМ дезоксинуклеозид-5'-трифосфаты. Полученную таким образом ДНК лигируют в 30 мкл буфера для лигирования в присутствии 5 ед ДНК лигазы фага Т4 в течение 16 ч при 8°С. 10 мкл лигированной смеси трансформирют компетентные клетки штамма E.coli JM 109 и высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших колоний выделяют плазмидную ДНК и проводят рестрикционный анализ. В результате получают плазмиду pKK223-3-del размером 3750 п.о., в которой сохраняется один BamHI сайт.

Для приготовления фрагмента ДНК, кодирующего N-концевую последовательность гамма-интерферона с дополнительными 4His проводят полимеразную цепную реакцию с использованием олигонуклеотидных праймеров:

TTTGAATTCTAGATGCAGGACCCATATG

(B1)

и

TTGGATCCATGGTGATGATGATCACTCTCCTCTTTCCAAT

(B2)

В праймеры вводят дополнительные последовательности: в прямой B1 - сайт для рестриктзы EcoRI, в обратный B2-4 кодона для His и сайт для рестриктазы BamHI. ПЦР проводят на матрице 5-10 нг плазмидной ДНК pTTgKm2 в присутствии 20 пмоль каждого из праймеров В1 и B2 в 50 мкл буфера для амплификации и 2,5 ед термостабильной ДНК полимеразы, в следующем режиме: денатурация - 95°С, 20 с; отжиг - 65°С, 20 с; полимеризация - 72°С, 20 с; 30 циклов амплификации. Далее продукт амплификации депротеинизируют фенолом, смесью фенол с хлороформом (1:1), хлороформом, осаждают этиловым спиртом, растворяют в 30 мкл воды. Амплифицированную ДНК размером около 150 п.о. гидролизуют рестриктазами EcoRI и BamHI в буфере, содержащем 33 мМ Трис-ацетата, рН 7,9, 66 мМ К-асетата, 10 мМ Mg-ацетата и 0,1 мг/мл БСА 3,0 ч при 37°С. Далее смесь прогревают 10 мин при 70°С для инактивации фермента и ДНК осаждают этиловым спиртом.

5 мкг плазмидной ДНК pKK223-3-del в 20 мкл буфера, содержащего 33 мМ Трис-ацетата, рН 7,9, 66 мМ К-асетата, 10 мМ Mg-ацетата, 0,1 мг/мл БСА и 10 ед рестриктазы EcoRI и BamHI инкубируют 1,0 час при 37°С. Затем смесь прогревают 10 мин при 70°С для инактивации ферментов, осаждают этиловым спиртом и растворяют в 10 мкл воды.

0,5 мкг полученного вектора лигируют с 5 мкг фрагмента EcoRI-BamHI, кодирующего N-концевую последовательность гамма-интерферона человека с дополнительными 4His, в 30 мкл буфера для лигирования с помощью 5 ед ДНК лигазы фага Т4 в течение 16 ч при 8°С. 10 мкл лигированной смеси трансформируют компетентные клетки штамма E.coli JM109 и высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших колоний выделяют плазмидную ДНК и проводят рестрикционный анализ. Окончательно строение плазмиды pNGIF01 подтверждают определением нуклеотидной последовательности между сайтами рестриктаз EcoRI и BamHI.

Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pHINS05.

К раствору 5 мкг плазмидной ДНК pNGlF01 в 20 мкл буфера, содержащего 33 мМ Трис-ацетата, рН 7,9, 66 мМ К-асетата, 10 мМ Mg-ацетата и 0,1 мг/мл БСА, добавляют 10 ед рестриктазы BamHI и 7 ед рестриктазы HindIII, смесь инкубируют 2,0 час при 37°С. Затем смесь прогревают 10 мин при 70°С для инактивации ферментов и плазмидную ДНК осаждают этиловым спиртом и растворяют в 10 мкл воды.

К раствору 15 мкг плазмидной ДНК pPINS07 в 30 мкл буфера, содержащего 33 мМ Трис-ацетата, рН 7,9, 66 мМ К-асетата, 10 мМ Mg-ацетата и 0,1 мг/мл БСА, добавляют 10 ед рестриктазы BamHI и 7 ед рестриктазы HindIII, смесь инкубируют 2,0 час при 37°С. Затем смесь разделяют электрофоретически в 0,8% геле легкоплавкой агарозы. Фрагмент ДНК размером 270 п.о., кодирующий проинсулин человека, выделяют из агарозы, экстрагируют фенолом, смесью фенол с хлороформом (1:1), хлороформом, осаждают этиловым спиртом и растворяют в минимальном объеме воды.

0,5 мкг гидролизованной плазмидной ДНК pNGlF01 лигируют с 5 мкг фрагмента BamHI-HindIII, содержащего последовательность проинсулина человека 30 мкл буфера для лигирования и 5 ед ДНК лигазы фага Т4 в течение 16 ч при 8°С. 10 мкл лигированной смеси трансформируют компетентные клетки штамма E.coli JM109 и высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из выросших колоний выделяют плазмидную ДНК и проводят рестрикционный анализ. Окончательно строение плазмиды pHINS05 подтверждают определением полной нуклеотидной последовательности между сайтами рестриктаз EcoRI и HindIII.

Пример 3. Оценка уровня биосинтеза гибридного полипептида с происулином человека штаммом-продуцентом Е. coil JM 109/pHINS05.

Единичную колонию клеток Е. coli JM 109, содержащую плазмиду pHINS05, инокулируют в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и выращивают при 37°С на качалке при 200 об/мин в течение 16-18 часов. Ночную культуру засевают в разведении 1:100 в жидкую среду LB, содержащую 100 мкг/мл ампициллина, и растят до мутности 0,8 при 37°С на качалке при 200 об/мин. Затем добавляют ИПТГ до концентрации 1,0 мМ и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 5 часов. Отбирают пробу 100 мкл и центрифугируют 5 мин при скорости 6000 об/мин, после чего осадок клеток суспендируют в 100 мкл буфера, содержащего 62,5 мМ Трис-HCl, рН 6,8,3% додецилсульфата натрия, 5% меркаптоэтанола, 10% глицерина и 0,01% бромфенолового синего, прогревают 3 мин на кипящей водяной бане. Полученный лизат клеток анализируют электрофорезом в 18% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия [13] при нанесении 2,0 мкл, 4,0 мкл, 8,0 мкл и 12 мкл образца на лунку. Гель окрашивают кумасси R-250, переводят в цифровой формат с помощью сканера "HP ScanJet Plus" фирмы Hewlett Packard и проводят его денситометрию. По данньм денситометрии гибридный полипептид составляет не менее 30% суммарного клеточного белка.

Пример 4. Оценка уровня биосинтеза гибридного полипептида с происулином человека штаммом-продуцентом Е. coli BL21/pHINS05.

Единичную колонию клеток E.coli BL21, содержащую плазмиду pHINS05, инокулируют в 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и выращивают при 37°С на качалке при 300 об/мин в течение 16-18 часов. Ночную культуру засевают в разведении 1:100 в жидкую среду LB, содержащую 100 мкг/мл ампициллина, и растят до мутности 0,7 при 37°С на качалке при 300 об/мин. Затем добавляют ИПТГ до концентрации 1,0 мМ и продолжают инкубацию в тех же условиях в течение 5 часов. Отбирают пробу 100 мкл и центрифугируют 5 мин при скорости 6000 об/мин, после чего осадок клеток суспендируют в 100 мкл буфера, содержащего 62,5 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 3% додецилсульфата натрия, 5% меркаптоэтанола, 10% глицерина и 0,01% бромфенолового синего, прогревают 3 мин на кипящей водяной бане. Полученный лизат клеток анализируют электрофорезом в 18% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия [13] при нанесении 2,0 мкл, 4,0 мкл, 8,0 мкл и 12 мкп образца на лунку. Гель окрашивают кумасси R-250, переводят в цифровой формат с помощью сканера "HP ScanJet Plus" фирмы Hewlett Packard и проводят его денситометрию. По данным денситометрии гибридный полипептид составляет не менее 30% суммарного клеточного белка.

Источники информации

1. Williams D.C, Van Frank R.M., Murth M.L., Burnett J.P. // Science, 1982, v.215, p.687-689.

2. Ovchinnikov Y.A., Efimov V.A., Ivanova I.N., Reverdatto S.V., Skiba N.P., Chakhmakhcheva O.G. // Gene, 1984, v.31, p.65-68.

3. Tang J., Xue Y., Fan X., Fu Y. // Clin. J. Biotechnol., 1993, v.9, p.71-78.

4. Berg H., Walter M., Mauch L., Seissler J., Northemann W. J. // Immunol. Methods, 1993, v.164, p.221-231.

5. Wei G., Hu M. H., Tang L. G. // Biochem. Mol. Biol. Int., 1995, v.35, p.37-46.

6. Патент РФ RU2144957, 27.01.2000.

7. McGregor W.C. // Ann. N.Y. Acad. ScL, 1983, v.413, p.231-237.

8. Cowley D.J., Mackin R.B. // FEBS Lett., 1997, v.402, p.124-130.

9. Jonasson P., Nilsson J., Samuelsson E., Moks Т., Stahl S., Uhlen M. // Eur. J. Biochem., 1996, v.236, p.656-661.

10. Патент РФ RU2097428, 27.11.1997.

11. Sambrook J., MacCallum P., Russell D. // Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3^d ed. Cold Spring Harbor, NY, 2000.

12. Brosius J., Dull T.J., Sleeter D.D., Noller H.F. // J. Mol. Biol., 1981, v.148, p.107-127.

13. Laemmli U.K. // Nature, 1970, v.227, p.680-687.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pHINS05, кодирующая гибридный полипептид с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, в котором N-концевой фрагмент гамма-интерферона человека соединен через пептидный линкер His₄GlySerArg с аминокислотной последовательностью проинсулина человека, имеющая молекулярную массу 2,75 МДа, содержащая BamHI-EcoRI - фрагмент плазмиды рКК223-3, включающий промотор транскрипции tac, EcoRI-HindIII - фрагмент с геном, имеющим нуклеотидную последовательность, представленную на фиг.2, и кодирующим N-концевой фрагмент гамма-интерферрна человека, пептидный линкер His₄GlySerArg и аминокислотную последовательность проинсулина человека, HindIII-EheI - фрагмент плазмиды рКК223-3, включающий терминатор транскрипции рибосомного оперона Е.coli, ген β-лактамазы (bla), участок инициации репликации (ori), включающая уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции со следующими координатами: EcoRI - 1, BamHI - 147, HindIII - 418, Pvu I - 1352.

2. Клетка Escherichia coli, трансформированная рекомбинантной плазмидной ДНК pHINS05 по п.1, - продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин человека.

3. Штамм бактерий Escherichia coli JM109/pHINS05 - продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин человека (Коллекция микроорганизмов ОАО "Национальные Биотехнологии" №05).