Способ выявления пролиферативных изменений глиальных клеток мюллера

Способ выявления пролиферативных изменений глиальных клеток мюллера

Реферат

Предлагаемое изобретение относился к офтальмологии, предназначено для выявления пролиферативных изменений глиальных клеток Мюллера при заболеваниях сетчатки различного генеза.

Известно, что эндотелиальная и глиальная пролиферация являются грозным осложнением, развивающимся при заболеваниях сетчатки, связанных с острым нарушением кровоснабжения, грубой витреоретинальной патологией, при отслойке сетчатки, развитых и далекозашедших стадиях таких заболеваний, как пигментный ретинит (пигментная абиотрофия сетчатки), диабетическая ретинопатия. Наиболее часто выявляется неоваскуляризация и пролиферация астроцитов - развитие астроглиально- фиброваскулярной ткани, в то время как истинная пролиферация клеток Мюллера относительно более редкий феномен (Reichenbach A. et al. Glio-Neuronal Interactions in Retinal Development//Development and Organization of the Retina From Molecules to Function. Ed. By L.M. Chalupa and B.L. Finlay. - Plenum Press: N.Y., 1998. - P. 121-146). При этом выявление пролиферации глиальных Мюллеровских клеток (МК) имеет важное прогностическое значение, так как в большинстве случаев будет свидетельствовать о неблагоприятном течении патологического процесса и, следовательно, о прогнозе низкой эффективности хирургического лечения для восстановления или сохранения зрительных функций. С другой стороны, разработка критериев диагностики пролиферации МК может явиться ценным инструментом для изучения патогенеза пролиферативного процесса в сетчатке при ее заболеваниях различной природы и, таким образом, способствовать развитию новых методов его профилактики и лечения.

Ранее нами была показана важность электроретинографических исследований для диагностики прогрессирования диабетической ретинопатии, в частности, ее перехода в стадию пролиферативных изменений сетчатки, знания о которых необходимы для профилактики осложнений сахарного диабета (Зуееа М.В. и др. Роль электроретинографии в диагностике и изучении патогенеза диабетической ретинопатии // Клиническая физиология зрения. П/ред. Шамшиновой А.М. и др. М: Н-МФ МБН.- 2002.- С.347-358). Описаны также электроретинографические признаки развития пролиферативной витреоретинопатии (ПВР) при регматогенных отслойках сетчатки (Антелава КД., Зуева МД, Цапенко И,Е. и др. Электроретинографическая характеристика пролиферативной витреоретинопатии при регматогенной отслойке сетчатки // Вести. Офтальмол.-1999.- Е.115.- №6.- С.27-29).

Однако в данных исследованиях рассматривались изменения электрогенеза сетчатки, характерные для развития пролиферативного процесса в целом. При этом делался акцент на изменении глио-нейрональных взаимоотношений в сетчатке и функции клеток Мюллера, но даже при прогрессировании ПВР не дифференцировался характер изменений функциональной активности сетчатки, специфичный для эндотелиальной, астроглиальной пролиферации или пролиферативной активности МК.

Офтальмоскопическое обследование также не позволяет дифференцировать характер развивающегося глиоза, селективно оценивать вовлечение активной пролиферации астроцитов или клеток Мюллера в патологический процесс.

Пролиферацию ретинальных глиальных Мюллеровских клеток хорошо выявляют в морфологических исследованиях, ее активно изучают с применением гистохимических, иммунногистохимических и методов на изолированной сетчатке животных, на эксплантах ранней постнатальной сетчатки кролика (Reichelt W. et al. Potassium as a signal for both proliferation and differentiation of rabbit retinal (Muller) glia growing in cell culture // Cell Signal. -1989.- V.1.- N.2.- Р.187-194). Подобные исследования позволяют изучать факторы, инициирующие пролиферацию МК, что полезно для повышения фундаментальных знаний о патогенезе развития ретинальных патологий различного генеза, сопровождающихся развитием пролиферативного процесса, но любые инвазивные методы выявления патологических изменений в сетчатке недопустимы для их применения в качестве диагностических тестов в практической офтальмологии.

Таким образом, в настоящее время отсутствуют диагностические критерии, позволяющие неинвазивным путем, безопасно для пациента выявлять пролиферативные изменения Мюллеровских клеток.

Существует способ выявления пролиферативных изменений клеток Мюллера, принятый нами за аналог, который основан на электрофизиологических исследованиях (Bringmann A. et al. Role of glial K⁺ channels in ontogeny and gliosis: a hypothesis based upon studies on Muller cells // Glia. - 2000. -V.29.- N.1. - P.35-44). Этот способ осуществляют в эксперименте на изолированных сетчатках животных и человека, и, следовательно, так же как и другие острые опыты, он не может применяться в практической офтальмологии. Однако именно в указанных исследованиях были получены те фундаментальные данные о специфике активности индивидуальных К⁺ каналов и мембранном потенциале МК, развитие которых позволило нам сформулировать обоснования для развития нового, применимого в клинике глазных болезней неинвазивного способа выявления пролиферативных изменений глиальных клеток Мюллера (см. ниже).

Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность неинвазивного выявления пролиферативных изменений глиальных клеток Мюллера, позволяющего расширить возможности диагностики характера и тяжести патологических изменений в сетчатке при развитии в сетчатке пролиферативного процесса различного генеза.

Технический результат достигается за счет того, что выполняют электроретинографическое исследование, вычисляют глиальный индекс К_Г по соотношению амплитуд b-волны ЭРГ и низкочастотной ритмической ЭРГ и оценивают степень его снижения по сравнению с нижней границей нормальных значений.

По сравнению с прототипом предлагаемый способ имеет следующие отличия.

- Электрофизиологические исследования выполняют не на изолированной сетчатке, а при отведении биопотенциалов от роговицы целого глаза.

- Регистрируют ганц-фельд ЭРГ и низкочастотную ритмическую ЭРГ (РЭРГ) на мелькания 8-12 Гц.

- Оценивают степень снижения глиального индекса К_г по сравнению с нижней границей его нормальных значений.

По сравнению с прототипом предлагаемый способ обладает следующими преимуществами.

- Способ позволяет неинвазивно, быстро и безопасно для пациента выявлять развитие пролиферативных изменений глиальных клеток Мюллера.

- Способ может использоваться в качестве диагностического и прогностического теста в практической офтальмологии, позволяя объективно судить о тяжести и характере патологических изменений в сетчатке, повышая эффективность прогноза течения заболевания и эффективности терапевтических и хирургических методов лечения.

- Учитывая значительную роль клеток Мюллера в патогенезе заболеваний сетчатки различного генеза, предлагаемый способ позволяет использовать данные фундаментальных исследований в неинвазивных исследованиях пациентов для изучения патофизиологических механизмов развития ретинальных патологий.

Способ основан на следующих теоретических предпосылках.

Доминирующая популяция глиальных клеток сетчатки - клетки Мюллера - обладают огромным спектром функций, жизненно необходимых для обеспечения нормального функционирования ретинальных нейронов. Они выполняют поддержку конечных продуктов анаэробного гликолиза, разрушения гликогена, обеспечивают аэробный гликолиз в нейронах, снабжая лактатом и пируватом цикл Кребса; производят утилизацию продуктов отхода жизнедеятельности нейронов, таких как углекислый газ и аммиак; выполняют защиту нейронов от излишков нейротрансмиттеров и, прежде всего, глутамата (см. обзор Зуева М.В. Клетки Мюллера; роль в нормальном функционировании сетчатки и патогенезе ретинальных заболеваний // Клиническая физиология зрения, П/ред. Шамшиновой А.М. и др. М: Н-МФ МБН. - 2002. - С.92-109). Мюллеровские клетки (МК) контролируют гомеостаз и защищают нейроны от неблагоприятных воздействий среды, участвуют в фагоцитозе обломков нейронов при их повреждении и в освобождении нейроактивных субстанций, таких как ГАМК, таурин и допамин. МК дают вклад в генерацию b-волны ЭРГ, медленный РШ-компонент и скотопический пороговый ответ, регулируя распределение ионов калия соответственно через ретино-витреальный барьер, всю сетчатку и во внутреннем плекси-формном слое.

Наиболее типичным для реакции МК на повреждающие факторы различной природы является усиленная экспрессия некоторых внутриклеточных белков. Таким «маркером повреждения» («белком стресса») является глиальный фибриллярный кислый белок.

В отличие от ретинальных нейронов, которые во взрослой сетчатке, как и в мозге, всегда остаются постмитотическими клетками, МК могут отвечать на патогенный стимул клеточной пролиферацией, участвуя в образовании преретинальных и эпиретинальных мембран. Однако МК имеют высокий порог к митогенным стимулам, и для того, чтобы вновь приобрести способность пролиферировать, должна произойти их ре-транзиция в незрелый фенотип, к поздней стволовой клетке. Поэтому пролиферация - более редкий ответ Мюллеровской глии на патогенные стимулы, чем гипертрофия и экспрессия «белков стресса». Она всегда наблюдается в случаях быстрых или массивных повреждений нейронов и классически доказана при отслойках сетчатки, грубой витреоретинальной патологии, при кровоизлияниях в стекловидное тело. Пролиферация МК развивается также при поздних стадиях диабетической ретинопатии, пигментном ретините и других заболеваниях, которые не характеризуются стремительным развитием процесса.

В клинической физиологии зрения существуют электроретинографические критерии, способные селективно оценить патологическую реакцию МК и реакцию нейрональных элементов сетчатки. При одиночных световых вспышках (до 1-2 Гц) генерация b-волны ЭРГ зависит и от активности биполярных клеток, и от МК. Поскольку МК не воспроизводят световой ритм с частотой свыше 2-4 Гц, ЭРГ при мелькающей световой стимуляции ритмическая ЭРГ (РЭРГ) является чисто нейрональным ответом, не опосредованным глией (Зуева М.В., Цапенко И.В. Методика регистрации ритмической ЭРГ и перспективы ее развития в клинике глазных болезней // Клиническая физиология зрения: Сб. научн. трудов МНИИГБ им. Гельмгольца. - М.: АО Русомед,1993. - с.81-98).

Количественную оценку изменений МК дает отношение амплитуды b-волны ЭРГ к амплитуде низкочастотной РЭРГ (на 8-12 Гц) - так называемый глиальный индекс К_г. Анализ этого индекса был впервые предложен нами, и его динамика исследовалась при заболеваниях сетчатки различного генеза (Зуева М.В., Цапенко И.В., Захарова Г.Ю. Способ диагностики X-хромосомного ретиношизиса. Патент №2217040 от 19 сентября 2002, Бюл, №33, 27.11.2003). Нами показано, что при ранних и развитых стадиях различных заболеваний сосудистого генеза характерна активизация метаболизма МК, что проявляется в возрастании К_г в подавляющем большинстве случаев: и при нарастании ишемизации сетчатки, и при дальнейшем прогрессировании заболевания, несмотря на снижение абсолютных величин ЭРГ и РЭРГ.

Однако при изучении пациентов с развитой пролиферативной ДР с глиозом сетчатки различной степени нам удалось показать, что если для глиоза I-II степени с наличием астроглиальной пролиферации и гипертрофии МК происходит общее, чаще параллельное угнетение ЭРГ и РЭРГ, то для выраженного глиоза сетчатки III-IV степени часто характерной становится опережающее угнетение b-волны ЭРГ по сравнению с ритмической ЭРГ. Проанализировав количественные значения К_Г, мы обнаружили, что у этих больных происходит резкое снижение глиального индекса. Наименьшие значения К_г наблюдались у больных ПДР с рецидивирующими витреоретинальными геморрагиями.

У здоровых лиц нормальные значения индекса К_Г (отношение амплитуды b-волны ЭРГ к амплитуде РЭРГ на 12 Гц) составляют 5,5-8,5 при расчете b-волны от пика а-волны. В указанных выше исследованиях, как правило, величина глиального индекса составляла менее 5 единиц, а при рецидивирующих геморрагиях - не более 4.

Индекс К_Г был просчитан также по архивным данным наших более ранних исследований у пациентов с отслойками сетчатки и ПВР различной тяжести. При грубых пролиферативных витреоретинальных изменениях также было обнаружено резкое угнетение глиального индекса, что совпадало с наименьшей эффективностью хирургического лечения отслойки сетчатки. Подобные же изменения К_Г мы наблюдали при острых нарушениях кровообращения в бассейне центральной артерии сетчатки.

Таким образом, во всех перечисленных случаях снижение глиального индекса ниже нижней границы нормальных значений выявлено при ситуациях, по литературе классически связанных с пролиферацией МК.

Снижение глиального индекса связано с тем, что при пролиферации МК происходит более выраженное угнетение b-волны ЭРГ, чем РЭРГ. С чем это может быть связано?

Известно, что только зрелая Мюллеровская глия имеет большой мембранный потенциал и обладает способностью регулировать уровень глутамин-синтетазы и удалять избыток глутамата из межклеточного пространства. Известно также, что паттерны калиевого тока во взрослых МК резко отличаются от незрелых и патологически измененных глиальных клеток (Bringmann A. et al. Role of glial K⁺ channels in ontogeny and gliosis: a hypothesis based upon studies on Muller cells // Glia. - 2000. - V.29.- N.1.- Р.35-44).

В то время как незрелые клетки Мюллера экспрессируют внутрь выпрямляющие калиевые токи - K(IR) очень низкой плотности, мембрана нормальных зрелых клеток Мюллера имеет преобладающую проводимость по этим токам. K(IR) каналы медиируют пространственный буферинг калиевых токов и поддерживают стабильный гиперполяризованный мембранный потенциал, необходимый для различных глиально-нейрональных взаимодействий. Во время «консервативного», то есть непролиферативного, реактивного глиоза проводимость МК по K(IR) умеренно редуцируется, клеточная мембрана слегка деполяризуется. Однако, когда клетки Мюллера начинают пролиферировать, их K(IR) проводимость драматически падает, что сопровождается возрастанием активности активированных кальцием калиевых каналов и подозрительной нестабильностью их мембранного потенциала.

Зрелые клетки Мюллера проходят через процесс де-дифференциации перед инициацией пролиферативной активности при заболеваниях сетчатки. Поэтому при ре-транзиции МК в незрелый фенотип, которая неизбежно предшествует возвращению их эмбриональной способности к пролиферации, происходит снижение активности К⁺ каналов входящего тока, что вызывает деполяризацию и изменение мембранного потенциала покоя. Это в свою очередь приводит к снижению способности, присущей зрелым МК, обеспечивать потенциалозависимый рецикл трансмиттеров, генерацию b-волны ЭРГ и другие функции метаболически активной зрелой глио-нейрональной единицы, что неизбежно отражается на ЭРГ (см. обзор Зуева М.В. Клетки Мюллера: роль в нормальном функционировании сетчатки и патогенезе ретинальных заболеваний // Клиническая физиология зрения. П/ред. Шамшиновой А.М. и др. М: Н-МФ МБН. - 2002. - С.92-109).

Таким образом, выявленные нами закономерности имеют подтверждение в фундаментальных исследованиях и объективно отражают пролиферативную активность клеток Мюллера, что может быть эффективно использовано в электроретинографической диагностике.

Способ осуществляют следующим образом.

Регистрацию ганц-фельд ЭРГ выполняют в мезопических условиях регистрации без глубокой темновой адаптации (возможна предварительная темновая адаптация до 10 минут, запись в темноте), угловые размеры стимулов 80-110°, яркость ахроматических вспышек 40-55 кд/м², энергетическая экспозиция на уровне роговицы 0,8-1,2 мкДж/см².

При исследовании ритмической ЭРГ на мелькания света с частотой 8-12 Гц анализируют амплитуды первого субкомпонента РЭРГ (волны R3: Зуева М.В. Закономерности изменений биоэлектрической активности сетчатки при проникающих ранениях глазного яблока // Дисс. ...д-ра биол. наук. - 1997. - 416 с.) на ахроматические стимулы. Регистрацию РЭРГ выполняют при умеренных яркостях ганц-фельд стимула (80-110°, энергетическая экспозиция на уровне роговицы 0,3-0,4 мкДж/см², 10-20 кд/м²).

При осуществлении способа диагностики глаз стимулируют вспышками света в указанных выше условиях, последовательно выполняя исследование ЭРГ и РЭРГ.

Рассчитывают амплитуды b-волны ЭРГ от пика-а до пика-b и РЭРГ, а по их соотношению - глиальный индекс К_Г. Данные сопоставляют со средней возрастной нормой, равной 5,5-8,5 условных единиц. При снижении К_Г до значений менее 4,5 ед. выявляют угнетение функции клеток Мюллера, которое указывает на начало пролиферации. Значения К_г от 4,5 до 5,5 единиц указывают на риск развития пролиферации клеток Мюллера, так как снижение их мембранного потенциала происходит уже при ре-транзиции МК в незрелый фенотип и де-дифференциации, непосредственно предшествующих их активным пролиферативным изменениям.

Кроме того, мы предполагаем, что отсутствие гиперреакции МК, то есть близкие к норме значения глиального индекса (5,5-8,5 ед.) на фоне выраженного (на 50% от нормы и более) угнетения ЭРГ и РЭРГ, при пролиферативной ретинопатии следует рассматривать как отражение возможной астроглиальной пролиферации и гипертрофии МК, но не пролиферативной активности МК.

При этом абсолютные значения волн ЭРГ и РЭРГ указывают на выраженность патологических изменений в фоторецепторах, нейронах внутреннего ядерного слоя и клеток Мюллера.

Для реализации данного способа диагностики возможно использование любых устройств, обеспечивающих указанные выше параметры стимуляции сетчатки.

Клиническая апробация способа проведена при анализе данных ЭФИ 82 больных с пролиферативной ДР (ПДР) и 96 пациентов с отслойкой сетчатки с ПВР различной тяжести.

Конкретные примеры выполнения способа:

Пример 1. Пациент К., 57 лет, сахарный диабет I типа, инсулинозависимый, длительность СД 22 года. Диагноз: OU-ПДР, глиоз II-III степени, множественные лазерные коагуляты по средней периферии сетчатки, начальная катаракта.

Vis, OU=0,3-0,4 с коррекцией.

При выполнении ЭФИ в данном и во всех последующих случаях регистрировали ганц-фельд ЭРГ на ахроматические стимулы (110°, 50 кд/м², 1 мкДж/см²) и низкочастотную ритмическую ЭРГ на мелькания белого света с частотой 12 Гц (110°, 0,3-0,4 мкДж/см², 16 кд/м²). Амплитуда b-волны рассчитана от пика волны-а до пика волны-b.

OD: Амплитуды а-, b-волн ЭРГ и РЭРГ соответственно: 29, 168 и 18 мкВ.

Глиальный индекс К_Г=168:18=9,33.

OS: Амплитуды а-, b-волн ЭРГ и РЭРГ соответственно: 22, 93 и 17 мкВ.

Глиальный индекс К_Г=93:17=5,47.

Заключение: OU имеются типичные изменения электрогенеза сетчатки, характерные для пролиферативной стадии ДР, с угнетением функциональной активности фоторецепторов и нейронов II порядка в периферических отделах сетчатки (хуже в OS). Гиперреакция клеток Мюллера, установленная в OD превышению К_г верхней границы нормальных значений, указывает на выраженную ишемизацию сетчатки. В OS - значение глиального индекса у границы нормальных значений, имеется риск развития пролиферативных изменений клеток Мюллера, рекомендовано повторное ЭФИ не менее чем через 1-2 месяца.

Пример 2. Пациент Д., 68 лет, сахарный диабет II типа, в последние 2 года применяет инсулин, длительность СД 15 лет. Диагноз: OU - ПДР, глиоз сетчатки: OD - III ст., OS - IV ст., OU - диабетическая макулопатия.

Vis. OD=0,1-0,2 н/к; OS=0,1 н/к.

OD: Амплитуды а-, b-волн ЭРГ и РЭРГ соответственно: 12, 26 и 6 мкВ.

Глиальный индекс К_Г=26:6=4,33.

OS: Амплитуды а-, b-волн ЭРГ и РЭРГ соответственно: 10, 15 и 5 мкВ.

Глиальный индекс К_Г=15:5=3,0.

Заключение: OU - резкое угнетение биоэлектрической активности сетчатки (хуже в OS). Значения глиальных индексов ниже 4,5 ед., что указывает на начало развития пролиферативных изменений МК в OD и активный пролиферативный процесс МК в OS.

Пример 3. Пациент Р., 58 лет. Диагноз OD - регматогенная отслойка сетчатки с ПВР Cl, OS - Миопия высокой степени, ПВХРД.

Vis. OD=0,7-0,8 н/к; OS=0,9=1,0 с коррекцией.

OD: Амплитуды а-, b-волк ЭРГ и РЭРГ соответственно: 20, 43 и 8 мкВ.

Глиальный индекс К_Г=43:8=5,35.

OS: Амплитуды а-, b-волн ЭРГ и РЭРГ соответственно: 95, 225 и 28 мкВ.

Глиальный индекс К_Г=225:28=8,03.

Заключение: По данным ЭФИ в OD - резкое угнетение функциональной активности во всех слоях и отделах сетчатки, наиболее выраженное для нейронов II порядка в периферических отделах и несколько более умеренное в слое фоторецепторов; значение глиального индекса ниже нормы, однако превышает 4,5 единицы. Таким образом, имеется риск развития пролиферативных изменений МК, но в настоящее время их пролиферация не выявляется и вероятен положительный эффект хирургического лечения ОС для восстановления функциональной активности сетчатки. В OS - умеренное снижение функций фоторецепторов и нейронов II порядка, глиальный индекс - у верхней границы нормы.

Через 1 месяц после операции на OD (циркляж) амплитуды а-, b-волн ЭРГ и РЭРГ равнялись соответственно: 25, 64 и 10 мкВ.

Глиальный индекс К_Г=64:10=6,4.

Заключение: данные ЭФИ свидетельствуют о положительной динамике электрогенеза сетчатки. Значение глиального индекса соответствует норме, однако, учитывая все еще резко сниженные амплитуды волн ЭРГ и РЭРГ, следует повторить ЭФИ не менее чем через 1-2 месяца для контроля функционального состояния глиальных клеток Мюллера.

Пример 4. Пациент В., 46 лет. Диагноз: OD - периферический ретиношизис, разрывы сетчатки, блокированы л/к; OS - субтотальная отслойка сетчатки, ПВР СЗ.

Vis. OD=0,8-0,9 с коррекцией; OS=0,01 н/к.

OD: Амплитуды а-, b-волн ЭРГ и РЭРГ соответственно: 90, 210 и 30 мкВ.

Глиальный индекс К_Г=210:30=7,0.

OS: Амплитуды а-, b-волн ЭРГ и РЭРГ соответственно: 17, 20 и 7 мкВ.

Глиальный индекс К_Г=20:7=2,86.

Заключение: по данным ЭФИ в OD снижена активность фоторецепторов и нейронов II порядка в периферических отделах сетчатки; в OS - грубые изменения электрогенеза сетчатки, регистрируется микро-ЭРГ. Резкое снижение глиального индекса указывает на пролиферативную активность Мюллеровских клеток. Прогноз эффективности хирургического лечения отслойки сетчатки неблагоприятный.

Через 1 месяц после склеропластической операции с интравитреальным вмешательством данные ЭФИ изменились следующим образом:

OS: Амплитуды а-, b-волн ЭРГ и РЭРГ соответственно: 12, 18 и 6 мкВ.

Глиальный индекс К_Г=18:6=3,0 ед.

Заключение: По сравнению с предыдущими данными ЭФИ наблюдается дальнейшее снижение функции нейронов II порядка во внутреннем ядерном слое, наиболее выраженное в периферических отделах сетчатки. Значения глиального индекса характерны для активной пролиферации МК.

Таким образом, предложенный способ позволяет выявлять пролиферативные изменения глиальных клеток Мюллера с помощью неинвазивных электроретинографических исследований, расширяя возможности офтальмодиагностики. Способ может использоваться в качестве диагностического и прогностического теста в практической офтальмологии, позволяя объективно судить о тяжести и характере патологических изменений в сетчатке, что повышает эффективность прогноза течения заболевания и эффективности терапевтических и хирургических методов лечения.

Способ выявления пролиферативных изменений глиальных клеток Мюллера, отличающийся тем, что вычисляют глиальный индекс К_г как отношение амплитуды b-волны ЭРГ к амплитуде субкомпонента R3 низкочастотной РЭРГ на частоту мельканий 8-12 Гц, причем b-волну рассчитывают от пика волны-а до пика волны-b, и при значении К_г менее 4,5 единиц выявляют развитие пролиферативных изменений клеток Мюллера, при значении К_г 4,5-5,5 единиц выявляют риск развития пролиферации клеток Мюллера.