Лекарственные вещества и фармацевтические композиции на их основе для использования в случаях окислительного стресса

Лекарственные вещества и фармацевтические композиции на их основе для использования в случаях окислительного стресса

Реферат

Настоящее изобретение относится к новым лекарственным веществам, предназначенным как для систематического, так и для несистематического применения, а также композициям на их основе для использования при окислительном стрессе и/или эндотелиальных дисфункциях средней интенсивности.

Под окислительным стрессом подразумевается образование свободных радикалов или радикальных соединений, которые вызывают разрушение как клеток, так и окружающей их ткани (Pathophysiology: the biological basis for disease in adults and children, McCance&Huether 1998, pp. 48-54).

Под эндотелиальными дисфункциями подразумевают дисфункции, относящиеся к сосудистому эндотелию. Известно, что повреждение сосудистого эндотелия является одной из важнейших причин, которые могут вызвать серию патологических процессов, затрагивающих различные органы и системы организма, как описано далее (Pathophysiology: the biological basis for disease in adults and children, McCance & Huether 1998, p. 1025).

Как известно, окислительный стресс и/или эндотелиальные дисфункции связаны с различными патологиями, которые описаны далее. Окислительный стресс также может быть обусловлен токсичностью большого числа различных лекарственных веществ, что сильно сказывается на эффективности их действия.

Указанные патологические явления носят хронический характер, подрывающий силы организма, и очень часто являются типичными для людей пожилого возраста. Как уже было сказано, при указанных патологических состояниях эффективность применяемых лекарственных веществ значительно снижается.

Можно привести следующие примеры патологических состояний, обусловленных окислительным стрессом и/или эндотелиальными дисфункциями или характерных для людей пожилого возраста:

- Для сердечно-сосудистой системы: миокардиальная и сосудистая ишемия в целом, гипертония, инсульт, атеросклероз и т.д.

- Для соединительной ткани: ревматоидный артрит и связанные с ним воспалительные заболевания и т.д.

- Для легочной системы: астма и связанные с ней воспалительные заболевания и т.д.

- Для желудочно-кишечной системы: язвенные и неязвенные диспепсии, кишечные воспалительные заболевания и т.д.

- Для центральной нервной системы: болезнь Альцгеймера и т.д.

- Для мочеполовой системы: импотенция, недержание.

- Для кожных покровов: экзема, нейродерматит, угри.

- Инфекционные заболевания в целом (см.: Schwarz, Brady "Oxidative stress during viral infection: a review" Free Radical Biol. Med. 21/5, 641-649, 1996).

Кроме того, сам процесс старения может рассматриваться как действительное патологическое состояние (см. Pathophysiology: the biological basis for disease in adults and children, pp. 71-77).

Известные лекарственные вещества, при введении их пациентам, имеющим патологии, связанные с окислительным стрессом и/или эндотелиальными дисфункциями, проявляют сниженную активность и/или повышенную токсичность.

Это происходит, например, в случае таких лекарственных веществ, как противовоспалительные, сердечно-сосудистые лекарственные вещества, лекарственные вещества для дыхательной системы, лекарственные вещества для центральной нервной системы, лекарственные вещества для костной системы, антибиотики, лекарственные вещества для мочеполовой, эндокринной системы и т.д.

Исследования лекарственных веществ направлены на поиск новых молекул, имеющих улучшенный терапевтический индекс (соотношение эффективность/токсичность), или пониженное соотношение риск/полезное действие, в том числе и для указанных выше патологических состояний, при которых терапевтический индекс значительного числа лекарственных веществ оказывается низким. Фактически при указанных выше состояниях окислительного стресса и/или эндотелиальных дисфункций многие лекарственные вещества проявляют пониженную активность и/или повышенную токсичность.

В частности, противовоспалительные лекарственные вещества, такие как NSAIDs и лекарственные вещества против колик, например 5-аминосалициловая кислота и ее производные, имеют следующие недостатки. NSAIDs проявляют токсические свойства, особенно в тех случаях, когда организм ослаблен или находится под влиянием патологических состояний, связанных с окислительным стрессом. К указанным состояниям можно отнести, например, следующие: преклонный возраст, ранее перенесенная язва, ранее перенесенное желудочное кровотечение, хронические заболевания, подрывающие силы организма, в частности, воздействующие на сердечно-сосудистую систему, почечный аппарат, состояние крови и т.д. ("Misoprostol reduces serious gastrointestinal complications in patients with rheumatoid arthritis receiving non-steroidal anti-inflammatory drugs. A randomized, double blind, placebo-controlled trial." F.E. Silverstein et al. Ann. Intern. Med. 123/4, 241-9, 1995; Martindale 31 a ed. 1996, pag. 73, Current Medical Diagnosis and Treatment 1998, pages 431 and 794).

Введение противовоспалительных лекарственных веществ пациентам, находящимся в указанных выше патологических состояниях, можно осуществить, только используя более низкие дозы лекарственного вещества по сравнению с теми, которые обычно используются для терапии, чтобы избежать заметных токсических проявлений. Поэтому противовоспалительная активность проявляется слабо.

Бета-блокаторы, используемые для лечения стенокардии, гипертонии и сердечной аритмии, оказывают побочное воздействие на дыхательную систему (одышка, бронхостеноз), поэтому из-за них могут возникнуть проблемы у пациентов с патологиями указанных органов (астмой, бронхитом). Таким образом бета-блокаторы еще больше ухудшают состояние при таких заболеваниях дыхательной системы, как астма. Поэтому пациентам, страдающим от астмы, следует назначать уменьшенные дозы указанных лекарственных веществ, чтобы не подвергать еще большей опасности их дыхательную систему. В результате эффективность бета-блокаторов значительно снижается.

Антитромботические средства, такие как, например, дипиридамол, аспирин и т.д., используемые для профилактики явлений тромбоза, имеют те же недостатки. У пациентов, имеющих патологии, связанные с окислительным стрессом и/или эндотелиальными дисфункциями, терапевтическое действие или переносимость этих лекарственных средств, в частности аспирина, значительно снижены.

Для лечения астмы и бронхита используют бронходилататоры, например сальбутамол и т. д., а при таких патологиях, как недержание мочи используют лекарственные вещества, действующие на холинэргическую систему. При их введении могут возникнуть аналогичные побочные эффекты, влияющие на сердечно-сосудистую систему и порождающие проблемы у пациентов, страдающих от сердечной недостаточности и гипертонии. Сердечная недостаточность и гипертония являются патологиями, связанными, как упоминалось выше, с окислительным стрессом и/или эндотелиальными дисфункциями. И эти лекарственные вещества тоже имеют такие же недостатки, как и перечисленные ранее.

Отхаркивающие и муколитические лекарственные вещества, которые применяются для лечения воспалительных заболеваний органов дыхания, проявляют те же недостатки у пациентов в описанных выше состояниях. Их введение может вызвать изжогу и раздражение желудка, особенно у людей пожилого возраста.

Ингибиторы костной резорбции, такие как дифосфонаты (например, алендронат и т.д.), являются лекарственными веществами, проявляющими повышенную желудочно-кишечную токсичность. Следовательно, эти лекарственные вещества также могут иметь такие же недостатки, которые описаны выше.

В случае ингибиторов фосфодиэстераз, таких как, например, силденафил, запринаст, используемых для лечения заболеваний сердечно-сосудистой и дыхательной систем, возникают аналогичные проблемы с переносимостью и/или эффективностью при упомянутых выше патологических состояниях окислительного стресса и/или эндотелиальных дисфункций.

Антиаллергические лекарственные вещества, например цетиризин, монтелукаст и т.д., вызывают аналогичные проблемы при упомянутых патологических состояниях, в особенности в отношении эффективности.

Антиангиотензиновые лекарственные вещества, т.е. ингибиторы АСЕ, например эналаприл, каптоприл и т.д., или ингибиторы рецепторов, например лозартан и т.д., используют для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Их недостатком является побочное воздействие на органы дыхания (например, возникновение кашля и т.д.) при указанных выше патологических состояниях.

Противодиабетические лекарственные вещества, как повышающие чувствительность к инсулину, так и снижающие уровень глюкозы, такие как, например, сульфонилмочевины, толбутамид, глипирид, гликлазид, глибурид, никотинамид и т.д., являются неэффективными для профилактики диабетических осложнений. При их введении могут возникать побочные эффекты, например поражение желудка. Эти явления усиливаются при указанных выше патологических состояниях.

В случае антибиотиков, например ампициллина, кларитромицина и т.д., и противовирусных лекарственных веществ, например ацикловира и др., возникают проблемы, связанные с их переносимостью, в частности они вызывают раздражение желудочно-кишечного тракта.

Противоопухолевые лекарственные вещества, например доксорубицин, даунорубицин, цисплатин и др., обладают высокой токсичностью по отношению к различным органам, в том числе к желудку и кишечнику. Это токсическое воздействие еще более усиливается при указанных выше патологических состояниях окислительного стресса и/или эндотелиальных дисфункций.

Лекарственные вещества против слабоумия, например никотин и колиномиметики, характеризуются слабой переносимостью, особенно в случае указанных выше патологий.

Лекарственные вещества стероидной структуры, которые используют для терапии острых (астма и т.д.) или хронических заболеваний (заболеваний кишечника, печени, органов дыхания, заболеваний женской репродуктивной системы, гормональных расстройств, кожных заболеваний, и т.д.), отличаются заметным токсическим воздействием на различные органы, особенно в вышеупомянутом состоянии окислительного стресса.

Класс стероидных лекарственных веществ, в том числе гидрокортизон, кортизон, преднизон, преднизолон, флюдрокортизон, дезоксикортикостерон, метилпреднизолон, триамцинолон, параметазон, бетаметазон, дексаметазон, триамцинолона ацетонид, флуопинолона ацетонид, беклометазон, ацетоксипрегнелон и т.д., оказывает заметное фармакотоксическое влияние на различные органы, и поэтому как их клиническое применение, так и перерывы в приеме приводят к ряду побочных эффектов, некоторые из которых могут быть очень серьезными. См., например, Goodman & Gilman, "The Pharmaceutical Basis of Therapeutics" 9-е изд., стр. 1459-1465, 1996.

Среди указанных токсических эффектов следует отметить воздействие на костную ткань, что приводит к изменению клеточного метаболизма и повышению вероятности возникновения остеопороза; воздействие на сердечно-сосудистую систему, приводящее к гипертонии; воздействие на желудочно-кишечный аппарат, приводящее к желудочным расстройствам. См., например, Martindale "The Extrapharmacopoeia, 30-е изд., стр. 712-723,1993.

К классу стероидных лекарственных веществ также принадлежат желчные кислоты, применяемые в терапии заболеваний печени и при желчных коликах. Урсодезоксихолевая кислота также применяется при некоторых расстройствах функций печени (цирроз печени желчного происхождения и т.д.). Переносимость этих лекарственных веществ значительно ухудшается при наличии желудочно-кишечных осложнений (хронические повреждения печени, язва желудка, кишечные воспаления и т.д.). В случае желчных кислот окислительный стресс также заметно влияет на эффективность действия лекарственного вещества: как эффективность, так и переносимость хенодезоксихолевой и урсодезоксихолевой кислот значительно снижаются. Особенно усиливается нежелательное воздействие на печень. Среди стероидных соединений также можно упомянуть эстрогены, применяемые для лечения дислипидемии, гормональных расстройств, опухолей женских органов. Упомянутые стероиды также оказывают вышеуказанное побочное воздействие, особенно па печень.

Исходя из вышеописанного уровня техники представляется практически невозможным отделить терапевтическую активность от побочных эффектов (см. Goodman et al, как указано выше, стр. 1474).

Таким образом существует необходимость разработки доступных лекарственных веществ, обладающих улучшенным терапевтическим воздействием, т.е. обеспечивающих и пониженную токсичность и/или повышенную эффективность, чтобы их можно было вводить пациентам при патологических состояниях окислительного стресса и/или эндотелиальных дисфункций, без проявления недостатков, характерных для лекарственных веществ, известных из уровня техники.

Неожиданно было обнаружено, что вышеупомянутые проблемы, возникающие при введении лекарственных веществ пациентам, страдающим от окислительного стресса и/или эндотелиальных дисфункций, или пожилым людям в общем случае, можно решить при помощи нового класса лекарственных веществ, описанных далее.

Объектом изобретения являются соединения или их соли, соответствующие следующей общей формуле (I):

A-B-N(O)_s (I)

где: s=2

А=R-T₁-, где

R представляет собой радикал лекарственного вещества при условии, что лекарственное вещество по формуле R-T₁-Z или R-T₁-OZ, где T₁=(CO) или О, S, NH и Z представляет собой Н или линейный или разветвленный C₁-C₅ алкил, выбирается из парацетамола, салбутамола, амброксола, алендроновой кислоты, цетиризина, амбрициллина, ацикловира, доксорубицина, симвастатина, дифиллина, такрина, клопидогрела, деметиломепразола, диктофенака, феруловой кислоты, эналаприла, пропранолола, бенфуродил гемисукцината, толрестата или сулиндака;

В=-Т_B-Х₂-0-, где

Т_B=(СО), О или NH;

Х₂ представляет собой бивалентный радикал, равный радикалу R_1B-X-R_2B, где Х представляет собой связь. О, S, NR_1C, где R_1C представляет собой Н или линейный или разветвленный C₁-C₅ алкил, R_1B и R_2B равны или различаются, являются линейными или разветвленными C₁-C₆ алкиленами, что соответствующий предшественник В не соответствует условиям теста 5 и соответствует условиям теста 4а; причем указанный предшественник имеет формулу -Т_B-Х₂-ОН, где когда Т_B=(СО), а свободная валентность Т_B занята

-OZ, где Z как определено выше, когда Т_B=0, а свободная валентность Т_B занята Н;

лекарственное вещество А=R-T₁-, где свободная валентность занята, как определено выше, соответствует условиям по меньшей мере одного из тестов 1-3;

- где тест 1 (NEM) представляет собой тест, который проводят in vivo с четырьмя группами крыс (каждая состоит из 10 крыс), включая контрольные группы (две группы) и опытные группы (две группы), при этом соответственно одной из контрольных и одной из опытных групп подкожно вводят одну дозу 25 мг/кг N-этилмалеимида (NEM), контрольные группы обрабатывают носителем, а опытные группы обрабатывают носителем + лекарственным веществом формулы А=R-T₁-, где свободная валентность занята, как указано выше, причем вводимая доза лекарственного вещества эквивалентна дозе, максимально переносимой крысами, которым не вводили NEM, т.е. самой высокой дозе, которую можно ввести животным, чтобы она не вызвала никаких очевидных токсических явлений, т.е. с заметными симптомами; при этом лекарственное вещество соответствует условиям теста 1, т.е. оно может быть использовано для получения соединений общей формулы (I), если у группы крыс, обработанной NEM + носителем + лекарственным веществом, наблюдаются желудочно-кишечные повреждения, или у группы крыс, обработанной NEM + носителем + лекарственным веществом, наблюдаются желудочно-кишечные повреждения в большей степени, чем у группы, обработанной только носителем, или чем у группы, обработанной носителем + лекарственным веществом, или чем у группы, обработанной носителем + NEM;

где тест 2 (CIP) представляет собой in vitro тест, в котором эндотелиальные клетки человека из пупочной вены выращивают в стандартных условиях, затем делят на две группы (каждый опыт воспроизводят пять раз), одну из этих групп обрабатывают смесью лекарственного вещества с концентрацией 10^-4 М в культуральной среде, а другую группу обрабатывают носителем; затем к каждой из этих двух групп добавляют гидропероксид кумола (CIP) с концентрацией 5 мМ в культуральной среде; при этом лекарственное вещество соответствует условиям теста 2, т.е. оно может быть использовано для получения соединений общей формулы (I), если не имеет место статистически значимое ингибирование апоптоза (повреждения клеток), вызванного CIP, при р<0,01, по сравнению с группой, обработанной носителем и CIP;

- где тест 3 (L-NAME) представляет собой тест, который проводят in vivo в течение 4 недель с четырьмя группами крыс (каждая состоит из 10 крыс), получающих питьевую воду, включая контрольные группы (две группы) и опытные группы (две группы), при этом соответственно одна из контрольных и одна из опытных групп получает на протяжении этих 4 недель питьевую воду с добавлением метилового эфира N-ω-нитро-L-аргинина (L-NAME) с концентрацией 400 мг/л, контрольным группам в течение четырех недель вводят носитель, а опытным группам в течение четырех недель вводят носитель + лекарственное вещество, причем носитель или носитель + лекарственное вещество вводят один раз в день, а лекарственное вещество вводят в дозе, максимально переносимой группой крыс, которые не были предварительно обработаны L-NAME, т.е. в самой высокой дозе, которую можно ввести животным, чтобы она не вызвала никаких очевидных токсических явлений, т.е. с заметными симптомами; через указанные четыре недели доступ к воде прекращают на 24 часа, а затем животных умерщвляют, измерив кровяное давление за I час до умерщвления, после умерщвления измеряют уровень в плазме глутамат-пируват трансаминазы (ОРТ) и исследуют состояние тканей желудка; лекарственное вещество соответствует условиям теста 3, т.е. оно может быть использовано для получения соединений общей формулы (I), если у группы крыс, обработанных L-NAME + носителем + лекарственным веществом, наблюдаются более сильные повреждения печени (определенные по более высокому уровню содержания GPT), и/или повреждения желудка, и/или сердечно-сосудистые повреждения (определенные по более высоким величинам кровяного давления) по сравнению с группой, обработанной носителем, или с группой, обработанной носителем + лекарственным веществом, или с группой, обработанной носителем + L-NAME, соответственно;

- где тест 4А, условиям которого соответствует предшественник соединения В, представляет собой in vitro тест, при котором часть суспензии эритроцитов, предварительно выдержанной при 4°С в течение 4 дней, причем указанные эритроциты получают стандартным способом от мужских особей крыс Wistar и суспендируют в физиологическом растворе, забуференном при рН 7,4 с помощью фосфатного буфера, центрифугируют при 1000 об./мин в течение 5 минут и 0,1 мл центрифугированных эритроцитов разбавляют натрий-фосфатным буфером с рН 7,4 до 50 мл; из указанной разбавленной суспензии отбирают аликвоты по 3,5 мл (всего 5 образцов) и инкубируют при 37°С в присутствии гидропероксида кумола в концентрации 270 мкМ, и определяют мутность суспензии при 710 нм через каждые 30 минут, чтобы установить, в какой момент времени (Tmax) имеет место максимальная мутность, что соответствует максимальному количеству клеток, подвергшихся лизису под действием гидропероксида кумола (гемолиз принимают равным 100%); затем к 3,5 мл аликвотам разбавленной центрифугированной суспензии эритроцитов добавляют спиртовые растворы предшественников соединений В (тест проводят с 5 образцами для каждого из исследуемых предшественников В) до достижения 2 мМ конечной концентрации предшественника В, а затем полученную суспензию предварительно выдерживают в течение 30 минут, добавляют гидропероксид кумола в количестве, достаточном для достижения такой же конечной концентрации, как указано выше, и при Tmax определяют ингибирование гемолиза в процентах из отношения абсорбции образца, содержащего соответственно эритроциты, предшественник В и гидропероксид кумола, и образца, содержащего эритроциты и гидропероксид кумола, умноженного на 100; предшественники В соответствуют условиям данного теста, если они ингибируют гемолиз, вызванный гидропероксидом кумола, более чем на 15%;

- где тест 5, условиям которого не соответствует предшественник соединения В, представляет собой аналитическое определение, которое выполняют путем добавления аликвот 10^-4 М метанольного раствора предшественника В, к раствору, полученному путем смешивания 2 мМ водного раствора дезоксирибозы с 100 мМ фосфатным буфером и 1 мМ раствором соли Fe^ll(NH₄)₂(SO₄)₂; после термостатирования этого раствора при 37°С в течение 1 часа добавляют аликвоты 2,8% водного раствора трихлоруксусной кислоты и 0,5 М водного раствора тиобарбитуровой кислоты в указанном порядке, нагревают раствор при 100°С в течение 15 минут и затем измеряют поглощение тестируемых растворов при 532 нм; ингибирование образования радикалов Fe^II, вызванное предшественниками соединений В, рассчитывают в процентах по следующей формуле:

(1-A_s/A_c)×100

где A_s и А_с соответственно представляют собой величины поглощения раствора, содержащего тестируемое соединение и соль железа, и раствора, содержащего только соль железа; соединение соответствует условиям теста 5, если процент ингибирования предшественником В, определенный как указано выше, больше или равен 50%;

при условии, что в формуле (I), когда Х₂ в составе В представляет собой линейный или разветвленный C₁-C₂₀ алкилен,

лекарственные вещества формулы А=R-T₁-, со свободной валентностью, занятой, как указано выше, используемые в соединениях формулы (I), не относятся к следующим веществам: эналаприл (ингибиторы АСЕ) и диклофенак (NSAID).

В формуле -Т_B-Х₂-О- предшественника соединения В, который соответствует условиям теста 4А и не соответствует условиям теста 5, можно использовать соединения, в которых Х₂ представляет собой радикал R_1B-X-R_2B, где R_1B и R_2B, одинаковые или разные, представляют собой линейные или разветвленные C₁-C₆ алкилены, и Х как определено выше.

Другими примерами предшественников соединений В являются: 1,4-бутандиол: ОН-(СН₂)₄-ОН, 6-гидроксигексановая кислота: ОН-(CH₂)₅-COOH, 4-гидроксимасляная кислота: ОН-(СН₂)₃-СООН, N-метилдиэтаноламин: ОН-(CH₂)₂-N(СН₃)-(СН₂)₂-ОН, диэтиленгликоль: ОН-(СН₂)₂-O-(CH₂)₂-ОН, тиодиэтиленгликоль: ОН-(СН₂)₂-S-(СН₃)₂-ОН; предпочтительно предшественником В являются N-метилдиэтаноламин, диэтиленгликоль, тиодиэтиленгликоль.

Соединения, являющиеся предшественниками лекарственных веществ и В, получают в соответствии с методами, известными из уровня техники и описанными, например, в "The Merck Index, 12a Ed.", (1996), включенном сюда в качестве ссылки.

Тесты (1-5) более подробно состоят в следующем:

Тест 1 (NEM): оценка желудочно-кишечных повреждений вследствие окислительного стресса, вызванного свободными радикалами, образовавшимися после введения N-этилмалеимида (NEM) (Н. G. Utiey, F. Bernheim, P. Hochstein "Effects of sulphydril reagents on peroxidation in microsomes" Archiv. Biochem. Biophys. 118, 29-32, 1967).

Животных (крыс) распределяют по следующим группам (по 10 животных в группе):

А) Контрольные группы:

группа 1°: обработка: только носитель (водная суспензия 1% мас./об.

карбоксиметилцеллюлозы, доза: 5 мл/кг, если лекарственное вещество вводят через рот, или физиологический раствор, если его вводят парентерально, т.е. подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно),

группа 2°: обработка: носитель, как определено выше, + NEM,

В) Опытные группы, которым вводят лекарственное вещество:

группа I: обработка: носитель + лекарственное вещество,

группа II: обработка: носитель + лекарственное вещество + NEM.

Способы введения являются известными для данного лекарственного вещества; это может быть оральный, подкожный, внутрибрюшинный, внутривенный или внутримышечный способ.

Доза NEM составляет 25 мг/кг в физиологическом растворе (подкожное введение), а лекарственное вещество вводят спустя 1 час в суспензии носителя, в виде единичной дозы, соответствующей максимальной дозе, или наивысшей дозе, переносимой животными из группы крыс, не подвергшихся предварительному воздействию NEM, то есть самой высокой дозе, которую можно вводить указанной группе, чтобы она не вызывала у животных явных токсических явлений, которые можно ясно распознать по заметным симптомам. Животных умерщвляют по истечении 24 часов, после чего приступают к оценке повреждений желудочно-кишечной слизистой оболочки.

Лекарственное вещество соответствует условиям теста 1, то есть может быть использовано для получения соединений общей формулы (I), если у группы крыс, обработанных NEM + носителем -г лекарственным веществом, наблюдаются желудочно-кишечные повреждения, или отмеченные у указанной группы желудочно-кишечные повреждения проявляются в большей степени, чем те, которые наблюдаются у группы, обработанной только носителем, или у группы, обработанной носителем и лекарственным веществом, или у группы, обработанной носителем и NEM, даже если фармакотерапевтическая эффективность лекарственного вещества, исследованная с использованием специальных тестов, существенно не снижается.

Тест 2 (CIP): Показатели защиты эндотелиальных клеток от окислительного стресса, вызванного гидропероксидом кумола (CIP).

Эндотелиальные клетки человека из пупочной вены получают в соответствии со стандартной процедурой. Свежие пупочные вены заполняют 0,1 мас.% раствором коллагеназы и инкубируют при 37°С в течение 5 минут.

После этого вены заливают средой М 199 (GIBCO, Grand Island, NY) с рН 7,4, к которой впоследствии добавляют другие вещества, как описано в примерах. Собирают клетки из перфузата при помощи центрифугирования и выращивают в культуральных колбах Т-75, предварительно обработанных фибронектином человека. Затем выращивают клетки в той же самой среде, к которой дополнительно добавляют 10 нг/мл фактора роста гипоталамуса крупного рогатого скота. Когда клетки первичной клеточной культуры (т.е. полученные напрямую ex-vivo) образуют слитный клеточный монослой (примерно 8000000 клеток на одну колбу), рост культуры останавливают, слои промывают и обрабатывают трипсином. Переносят клеточные суспензии в лунки 24-луночного планшета для клеточных культур, к половине из которых затем добавляют ту же самую культуральную среду, содержащую лекарственное вещество в концентрации 10^-4 М, после чего выращивают клетки в термостате при 37°С и при постоянной влажности. Только клетки из указанных первых субкультур используют для экспериментов с гидропероксидом кумола (CIP). Клетки идентифицируют как эндотелиальные клетки путем морфологического анализа, а также по их специфической иммунологической реакции на фактор VIII; указанные культуры не содержат каких-либо загрязнений из миоцитов или фибробластов.

Перед началом теста клеточную культуральную среду удаляют и клеточные слои осторожно промывают физиологическим раствором при температуре 37°С. Лунки культурального планшета затем инкубируют в течение 1 часа с CIP, содержащимся в культуральной среде в концентрации 5 мМ. Оценку клеточных повреждений (апоптоза) проводят путем определения процентного изменения фрагментации ДНК относительно контрольной группы (которую обрабатывали только CIP), оценивая изменение флуоресценции при длинах волн 405-450 нм. Для каждого образца опыт повторяют пять раз.

Лекарственное вещество соответствует условиям теста, то есть может быть использовано для получения соединений общей формулы (I), если статистически значимое ингибирование апоптоза (клеточных повреждений), вызванного CIP по сравнению с группой, которую обрабатывали только CIP, не зарегистрировано при р<0,01.

Тест 3 (L-NAME): оценка эндотелиальных дисфункций, вызванных введением L-NAME (метиловый эфир N^w-нитро-L-аргинина), J. Clin. Investigation 90, 278-281, 1992.

Эндотелиальные дисфункции оценивают путем определения повреждений слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, повреждений печени, а также повышения кровяного давления, вызванных введением L-NAME.

Животных (крыс) делят на группы в соответствии со схемой, изложенной ниже. Группе, получающей L-NAME, вводят в течение 4 недель указанное соединение, растворенное в питьевой воде, в концентрации 400 мг/л. Выделяют следующие группы (по 10 животных в каждой):

A) Контрольные группы:

группа 1°: только носитель (водная суспензия 1 мас.%/об. карбоксиметилцеллюлозы, доза: 5 мл/кг, если лекарственное вещество вводят через рот, физиологический раствор, если его вводят парентерально),

группа 2°: носитель + L-NAME,

B) Опытные группы - которым вводят лекарственное вещество:

группа 3°: носитель + лекарственное вещество,

группа 4°: носитель + лекарственное вещество + L-NAME.

Способы введения являются известными для данного лекарственного вещества, и это может быть оральный или подкожный, внутрибрюшинный, внутривенный или внутримышечный способ. Лекарственное вещество вводят в дозе, соответствующей максимальной дозе, переносимой животными из группы крыс, которым не вводили L-NAME, то есть самой высокой дозе, которую можно вводить, чтобы она не вызывала у животных явных токсических явлений, которые можно распознать по заметным симптомам. Лекарственное вещество вводят один раз в день в течение 4 недель.

К концу четвертой недели обработки прекращают доступ животных к воде, и по истечении 24 часов их умерщвляют.

За один час до умерщвления измеряют кровяное давление, и его повышение принимают в качестве критерия оценки повреждения сосудистого эндотелия. Повреждения слизистой оболочки желудка оценивают так, как проиллюстрировано в тесте 1 (см. Пример F1). Повреждения печени определяют путем оценки содержания глутамат-пируват трансаминазы (увеличение уровня GPT) после умерщвления.

Лекарственное вещество соответствует условиям теста 3, то есть может быть использовано для получения соединений общей формулы (I), если в группах крыс, обработанных L-NAME + лекарственным веществом + носителем, наблюдаются более существенные повреждения печени (GPT), и/или более существенные повреждения желудка, и/или более существенные повреждения сердечно-сосудистой системы (кровяное давление) по сравнению с группой, обработанной только носителем, или группой, обработанной носителем и лекарственным веществом, или группой, обработанной носителем и L-NAME, даже если фармакотерапевтическая эффективность лекарственного вещества, исследованная с использованием специальных тестов, существенно не снижается.

В условиях, указанных для вышеописанных in vivo тестов 1 и 3, терапевтический индекс лекарственного вещества снижается вследствие того, что обычные дозы, при которых это лекарственное вещество может быть эффективным, уже не переносятся.

Тест 4А проводят в соответствии с методом, описанным в R. Maffei Facino, M. Carini G. Aldini, M.T. Calloni, Drugs Exptl. Clin. Res. XXIII (5/8) 157-165, 1997. Тест 4А представляет собой in vitro тест, при котором эритроциты, полученные стандартным способом от мужских особей крыс Wister (Charles River) выдерживают в течение 4 дней при 4°С в суспензии в физиологическом растворе, забуференном при рН 7,4 с помощью фосфатного буфера. По окончании указанного периода отбирают аликвоту суспензии и центрифугируют при 1000 об./мин в течение 5 минут. 0,1 мл центрифугированных эритроцитов разбавляют до 50 мл натрий-фосфатным буфером с рН 7,4, получая 0,2% об. суспензию эритроцитов. К 5 аликвотам по 3,5 мл разбавленной суспензии добавляют 0,1-0,3 мл спиртового раствора гидропероксида кумола до достижения концентрации 270 мкМ и затем инкубируют их при 37°С. Это соединение вызывает лизис клеток, и за счет этого увеличивается мутность суспензии. За лизисом клеток следят при помощи турбидиметрии при 710 нм. Проводя измерение оптической плотности (или пропускания) через каждые 30 минут, определяют момент времени (Т_max), когда мутность суспензии максимальна, что соответствует максимальному количеству клеток в суспензии, подвергшихся лизису. Т_max принимают за время, соответствующее 100% лизиса эритроцитов. Для определения ингибирующего воздействия предшественников В на гемолиз, вызванный гидропероксидом кумола, добавляют по 0,1-0,2 мл раствора каждого из исследуемых соединений-предшественников В в этаноле к 3,5 мл аликвотам центрифугированной суспензии эритроцитов (5 образцов для каждого соединения) до достижения конечной концентрации 2 мМ, и полученную суспензию предварительно выдерживают в течение 30 минут.

Затем добавляют гидропероксид кумола в количестве, достаточном для достижения такой же конечной молярной концентрации, как определено ранее, и ингибирование соединением гемолиза в процентах при Tmax определяют из отношения абсорбции исследуемого образца суспензии, содержащей соответственно эритроциты, предшественник В и гидропероксид кумола, и абсорбции суспензии, содержащей эритроциты и гидропероксид кумола, умноженного на 100; предшественник соединения В соответствуют условиям теста 4А, если он ингибирует гемолиз, вызванный гидропероксидом кумола, более чем на 15%.

Тест 5 представляет собой колориметрический тест, в котором 0,1 мл аликвоты 10^-4 М метанольных растворов тестируемых соединений добавляют в пробирки, содержащие раствор, полученный путем смешивания 0,2 мл 2 мМ водного раствора дезоксирибозы, 0,4 мл 100 мМ фосфатного буфера с рН 7,4, и 0,1 мл 1 мМ раствора Fe^II(NH₄)₂(SO₄)₂ в 2 мМ HCl. Затем пробирки выдерживают при 37°С в течение 1 часа. Затем в каждую пробирку добавляют 0,5 мл 2.8% водного раствора трихлоруксусной кислоты и 0,5 мл 0,1 М водного раствора тиобарбитуровой кислоты в указанном порядке. Прозрачный контрольный раствор готовят путем добавления в пробирку, содержащую только указанный выше водный раствор реагентов, 0,1 мл метанола. Пробирки закрывают и нагревают на масляной бане при 100°С в течение 15 минут. Растворы окрашиваются в розовый цвет, причем интенсивность окрашивания пропорциональна количеству дезоксирибозы, подвергшейся радикальному окислительному расщеплению. Растворы охлаждают до комнатной температуры и затем измеряют их поглощение при 532 нм, сравнивая с его прозрачным контрольным раствором. Ингибирование образования радикалов, вызываемое предшественником В относительно образования радикалов солью Fe^II определяют при помощи следующей формулы:

(1-A_s/A_c)×100

где A_s и А_с являются соответственно величинами поглощения раствора, содержащего тестируемое соединение и соль железа, и раствора, содержащего только соль железа; соединение соответствует условиям теста 5 в том случае, если ингибирование предшественником В образования радикалов, выраженное в процентах, как указано выше, больше или равно 50%.

Неожиданно выяснилось, что продукты по изобретению формулы (I) в состоянии окислительного стресса обладают улучшенным терапевтическим индексом по сравнению с лекарственными веществами-предшественниками. Соединения формулы (I) по изобретению, где предшественник соединения В соответствует условиям теста 4А, но не соответствует условиям теста 5, можно использовать, как указано выше, в качестве лекарственных веществ для терапии состояний окислительного стресса средней силы. В этом смысле в соответствии с настоящим изобретением объектом лечения являются состояния окислительного стресса средней силы.

Вышеупомянутые тесты будут проиллюстрированы при помощи следующих соединений (см. Таблицы):

Тест 1: лекарственное вещество-предшественник: индометацин

- Максимально допустимая вводимая доза для крыс: 7,5 мг/кг перорально. При введении более высоких доз проявляется токсичность, характеризующаяся энтеропатией, дрожью, угнетением сознания вплоть до смертельного исхода (в течение 24 часов).

- У группы крыс, обработанных NEM и индометацином в указанной выше дозе, наблюдались желудочно-кишечные повреждения.

Поскольку индометацин вызывает желудочно-кишечные повреждения у крыс, обработанных NEM, он соответствует условиям теста 1.

Тест 2: лекарственные вещества-предшественники: индометацин, парацетамол и мезаламин

Индометацин и парацетамол соответствуют условиям теста 2, поскольку ингибирование клеточных повреждений (апоптоза), вызванных CIP, незначител