Композиция и способ обнаружения и раннего и дифференцированного подсчета грамотрицательных микроорганизмов

Композиция и способ обнаружения и раннего и дифференцированного подсчета грамотрицательных микроорганизмов

Реферат

Область изобретения

Представленное изобретение связано с областью микробиологии и, в частности, с композицией и способом раннего обнаружения, идентификации, дифференцирования и подсчета микроскопических организмов, конкретно грамотрицательных микроорганизмов,

Предшествующий уровень техники

Рекуперация, идентификация и подсчет грамотрицательных микроорганизмов, таких как Salmonella, E.coli и разновидности кишечных бактерий, представляют большой интерес для клинической диагностики и для санитарного контроля качества вод, продовольствия и образцов окружающей среды.

Для идентификации и подсчета микроскопических грамотрицательных организмов существует диапазон питательных сред, составы которых можно считать "традиционными" и многие из которых развиты с прошлого столетия. Среди этих питательных сред можно отметить S.S. агар (стерильный раствор агара), S.S. агар (модифицированный), питательную среду XLD, энтерический агар Хектоена, агар Кристенса и агар с бриллиантовой зеленью, используемые для идентификации Salmonella (Soria Melquizo, F. Difco Handbook. Tenth edition. 1984; MERCK. Handbook of Culture Media. 1990; OXOID Handbook of Culture Media. 1995). В целом эти питательные среды неудобны: они являются ингибиторами для большого числа кишечных бактерий, даже рост Salmonella слегка замедляется благодаря наличию ингибиторов, которые ингибируют рост, активированный свойствами питательных веществ, содержащихся в питательных средах.

В некоторых из ранее рекомендованных питательных сред идентификация Salmonella основана на выработке H₂S, однако эта реакция также характерна для других грамотрицательных микроорганизмов, таких как Proteus и Citrobacter.

Другие питательные среды продаются для идентификации E.coli и подсчета кишечных бактерий в некоторых биологических образцах, среди прочего, такие как фуксиновый агар (среда Эндо), агар с эозином и метиленовым синим, агар MacConkey, агар с желчью и фиолетовым красным (Soria Melquizo, F. Difco Handbook. Tenth edition. 1984; MERCK. Handbook of Culture Media. 1990; OXOID Handbook of Culture Media. 1995).

Эти питательные среды, в общих чертах, содержат ингибиторы грамположительных микроорганизмов, которые находятся в неадекватном соотношении с питательными веществами и часто уменьшают рост целевого микроорганизма. С другой стороны, в этих субстратах невозможно идентифицировать ни Salmonella, ни микрорганизмы поздней ферментации лактозы.

Диагностическая специфичность и/или чувствительность этих питательных сред обычно не так высоки, потому что в них идентификация таких микрорганизмов основана на ферментативных биохимических реакциях углевода, которые являются общими для нескольких целевых видов или родов, как это имеет место при деградации лактозы колиформной группой (так как не все способны ферментировать этот субстрат).

В 1998, Helena Tuompo и др. запатентовали способ и питательную среду для идентификации Salmonella (Патент США №5786167), основанный на способности этого микроорганизма преобразовывать в ходе обмена веществ мелибиозу, маннит и сорбит так же, как на включении хромогенного субстрата, для обнаружения активности β-галактозидазы. Эта питательная среда имеет ограничение, которое не позволяет идентифицировать кишечные бактерии рода Proteus, представляющие интерес для санитарии, так как этот микроорганизм растет в виде бесцветных колоний.

Другим неудобством, которое представляет эта питательная среда, является то, что она не допускает подсчета кишечных бактерий и Salmonella можно перепутать с ферментирующей маннит Shigella типа S.sonnei и S.flexneri.

В том же году Alain Rambach запатентовал хромогенно-флуорогенную питательную среду для обнаружения E.coli и способ для ее применения (Патент США №5846761). Изобретение состояло в применении субстрата, полученного из индолилглюкуроновой кислоты или ее солей, и нехромогенного субстрата, полученного из алкил-, алкенил- или арилглюкуроновой кислоты или их солей.

Эта питательная среда специфична для E.coli, и она не позволяет идентифицировать и/или подсчитывать Salmonella и другие микроскопические грамотрицательные организмы. С другой стороны, требуется применение лампы ультрафиолетового света, которая затрудняет подсчет.

В патенте США №5723308, Mach и др. описывают питательную среду для быстрого подсчета колиформных бактерий. Питательная среда включает в себя смесь желатинового пептона и экстракта дрожжей, лактозы или глюкозы, хлорида натрия, солей желчи, гуммиарабика и рН индикаторов, таких как феноловый красный и сульфонфталеин, в количествах от 0,16 до 5 г/л для идентификации бактерий. Такие высокие концентрации индикаторов в то же самое время замедляют и подавляют рост целевых микроорганизмов. Принцип ферментации сахаров, особенно ферментации лактозы колиформными микроорганизмами, тем не менее используется в этой питательной среде с поправкой на невозможность обнаружения микроорганизмов поздней ферментации, таких, например, как Citrobacker. Другие кишечные бактерии не идентифицированы и также могли подвергнуться воздействию высокой концентрации индикаторов.

В 1993 Christopher Tate и др. запатентовали очень селективную питательную среду для Salmonella (Патент США №5208150) с включением тергитола RTM в основе с ксилозализином, куда также включен сульфапиридин для ингибирования роста Citrobacter. Что касается большинства питательных сред, которые были проанализированы и в настоящее время находятся в продаже для идентификации Salmonella, проблема решена путем ингибирования флоры, которая могла бы быть перепутана с Salmonella, главным образом Proteus и Citrobacter. Эти кишечные бактерии, в особенности Citrobacter, считаются относящимися к роду колиформных, следовательно, подсчет этих микроорганизмов, по-видимому, в этой питательной среде окажется искаженным. Применение антибиотика в питательной среде, такого как новобиоцин, становится затруднительным для подготовки питательной среды. Для ее стерилизации и хранения необходимы дополнительные усилия.

Alain Rambach запатентовал питательную среду для изоляции и идентификации Salmonella (Патент США № 5194374), которую можно рассматривать в качестве самого близкого прототипа данного изобретения. Он заключается в идентификации этого организма посредством реакции расщепления 1,2-пропандиола в присутствии рН-индикатора, который адсорбируется в порошкообразном материале с размером частиц 100 микрон. Таким материалом может быть кремнезем, силикагель или целлюлоза. Помимо других компонентов в эту питательную среду включен субстрат для β-галактозидазы, IPTG и дезоксихолаты. В питательной среде, упомянутой ранее, обнаруживаются следующие недостатки:

- Не все Salmonellas "не-typhi" дают красный цвет, потому что согласно сообщениям Monget-Daniel (Патент США № 5434056), один штамм каждого из штаммов Salmonella enteritidis, S.gallinarum, S.pullorum и S.paratyphi, испытанных им, не проявлял никакой окраски, и один штамм S.Arizonae проявлял синюю окраску.

- Один штамм Klebsiella pneumoniae в нескольких испытаниях, проведенных в лаборатории, показывал синий цвет, когда ожидаемая реакция должна была быть фиолетовой, принимая в расчет, что этот организм производит пропан-1,2-диол, это положительно β-галактозидаза, и у большинства штаммов этого микроорганизма развивалась синяя окраска после 24 часов.

- В экспериментах, проведенных в процессе работы над данным изобретением, результаты Monget были подтверждены обнаружением некоторых штаммов Pseudomonas с красной окраской, характерной также для Salmonella.

- Неожиданно синяя окраска была обнаружена также для штаммов Proteus vulgaris.

- Для подсчета организмов питательная среда не разработана в основном из-за композиции питательных веществ, которая не содержит необходимого количества каждого питательного вещества, чтобы избежать ингибирующего действия дезоксихолатов, включенных в формулу. Аналогично, общее соотношение между питательными веществами и ингибиторами недостаточно и не допускает адекватного развития грамотрицательных микроорганизмов и, таким образом, в итоге нет гарантии достоверного подсчета таких организмов.

- Предыдущий дефицит проявляет свое негативное влияние, когда для идентификации Salmonella используется питательная среда Рамбаха, из-за необходимости провести предшествующую инкубацию образца в предобогащенной или обогащенной питательной среде прежде, чем вносить посевной материал в агаровую пластинку Рамбаха. Обычно эта стадия обогащения длится 18-24 часа в селенитовом бульоне, тетратионате или в среде Раппапорт Вассилиадис.

- В различных тестах, проведенных заявителем настоящего изобретения, штаммы Enterobacter aerogenes (ATCC 13048) и Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883) казались сильно ингибируемыми в питательной среде после 18-24 часов инкубации при 37°С. В том же самом эксперименте Proteus vulgaris (ATCC 13315) и Proteus mirabilis (ATCC 7002) не росли. В двух других сериях испытаний в питательной среде, в отличие от экспериментальной среды, не росли Enterobacter aerogenes ATCC 13048.

- Другой недостаток - количество порошкообразного силикагеля, который включен в описанные питательные среды; оно делает затруднительным его однородное распределение, и кремнезем легко флоккулирует, вызывая во многих случаях появление неадекватной консистенции питательной среды, и затрудняет манипуляции.

- Высокая адсорбционная способность кремнезема не допускает диффузию адсорбируемых компонентов в питательной среде.

- Низкая способность стимулировать рост влияет даже на рост Salmonella, потому что в предварительно проведенных заявителем опытах штамм Salmonella typhi был ингибирован в питательной среде.

- Соотношение между ингибиторами, питательными веществами и хромогенными веществами не самое подходящее, так как необходимо включить в формулу активаторы ферментов (IPTG) для того, чтобы метаболизировать субстраты и ускорить реакцию.

Краткое содержание изобретения

Цель этого изобретения состоит в обеспечении композиции и способа для раннего обнаружения и дифференциального подсчета микроскопических грамотрицательных организмов, позволяющего специальным образом идентифицировать и проводить надежное и одновременное обнаружение и/или подсчет Salmonella, E.coli, колиформных и других грамотрицательных бактерий, таких как Pseudomonas, Citrobacter и Klebsiella, в ранние периоды культивирования и с высокой аналитической чувствительностью.

Новизна решения состоит в получении смесей с высоким содержанием питательных веществ белковой природы, с высоким содержанием общего азота - между 10 и 33%. Содержание этих смесей в композиции находится в соотношении от 2:1 до 24:1 к общему содержанию ингибирующих веществ для микроорганизмов, которые должны быть ингибированы, и в особенности грамположительных.

С другой стороны, в композицию включены смеси органических и неорганических веществ, которые позволяют производить дифференциальный подсчет целевых микроскопических организмов, эти смеси находятся в адекватном соотношении от 0,5:1 до 2:1 к смеси питательных веществ белковой природы, упомянутых выше. Вещества белковой природы выбраны из нескольких типов смесей, среди которых можно упомянуть следующие:

- Обезвоженные панкреатический или папаиновый гидролизаты говяжего сердца, с общим содержанием азота от 10 до 15%, которые находятся в смеси веществ белковой природы в концентрациях от 25 до 75%.

- Гидролизат обезвоженного ферментативного молочного белка с общим содержанием азота от 11 до 20%, который может быть в смеси в концентрациях вплоть до 15% указанной смеси белковых веществ.

- Ферментативные микробные автолизаты или гидролизаты с общим содержанием азота от 8 до 15%, которые находятся в указанной смеси в концентрациях от 15 до 25%.

- Смеси белков яичного желтка с общим содержанием азота от 15 до 33%, которые могут быть в смеси в концентрациях вплоть до 45%.

Композиция, описанная в данном изобретении, включает в себя малые количества ингибиторов роста грамположительного микроорганизма, таких как холевая и дезоксихолевая кислоты, а также солей желчи, которые находятся в композиции в соотношении от 0,5:1 и 2:1 относительно смеси веществ белковой природы; это означает количественно от 0,8 до 4 г/л.

С другой стороны, новый аспект изобретения заключается в совместном применении ранее упомянутых соединений с другими соединениями, которые дают возможность селективно дифференцировать целевые микроорганизмы и являются последней группой соединений, выбранных из оксидов двухвалентных металлов и кремниевых соединений, таких как 3MgO×4SiO₂×H₂O, SiO₂×H₂O и SiO₂. Указанные вещества находятся в количествах от 2 до 20 г/л (концентрации от 6 до 32% относительно общей массы смеси) вместе с феноловым красным или нейтральным красным в количествах от 0,01 до 0,06 г/л (концентрации от 0,03 до 0,18% общей массы) в присутствии спиртов, и указанные спирты могут быть метаболизированы ферментами некоторых из целевых микроорганизмов, предпочтительно С₃Н₈O₂, в количествах от 10 до 14 мл/л и в присутствии хромогенных соединений. Указанные хромогенные соединения могут быть метаболизированы другими микроскопическими организмами, отличными от тех, которые могли метаболизировать указанные спирты и которые, когда метаболизированы, придают колониям некоторый цвет, отличающийся от цветов, характерных для микроорганизмов, которые способны метаболизировать указанные спирты, предпочтительно Х-gal в количествах от 0,05 до 0,1 г/л (концентрации от 0,15 до 0,3% от общей массы смеси).

В качестве другого нового элемента в композицию питательной среды такого типа, предложенной для заключения, включена комбинация солей натрия и магния, таких как хлорид магния и карбонат натрия, в количествах от 0,01 до 10 г/л (концентрации от 0,03% до 32% общей массы смеси). Креатинин и низкомолекулярные соединения азота могут быть включены в количествах вплоть до 1 г/л (вплоть до 3% смеси); серосодержащие аминокислоты, такие как цистин и цистеин, могут быть также включены в количествах вплоть до 0,4 г/л (концентрации вплоть до 1,25% общей массы смеси).

В композицию включены гелеобразующие агенты, предпочтительно агар, с твердостью между 400 и 700 г/см², в количествах от 13 до 20 г/л (от 40 до 63% от общей массы смеси).

Для применения композицию воссоздают в воде в количествах от 30 до 32 г/л. Для этой цели к воде добавляют спирт, встряхивая до полного распределения. Остальные ингредиенты добавляют к жидкой смеси, встряхивая и нагревая до температуры 100°С от 1 до 3 минут и понижая температуру до 45-50°С. Новая композиция имеет значение рН от 6,8 до 7,4 (после кипячения в течение 1-15 минут и охлаждения до 20-25°С).

Композицию используют, инкубируя ее в форме геля при температуре от 30 до 45°С по крайней мере 12 часов.

В этой приготовленной и восстановленной в воде композиции можно обеспечить новый способ для раннего обнаружения и дифференциального счета грамотрицательных микроскопических организмов, таких как Salmonella, E.coli и других колиморфных организмов. E.coli и колиморфные организмы будут иметь сине-зеленоватую окраску колонии на фоне оранжевой нижней части питательной среды. Salmonella (не typhi) можно обнаружить по красной окраске в центре колоний на фоне розовой нижней части. Salmonella typhi и Proteus vulgaris можно обнаружить по прозрачности колоний. Citrobacter и Klebsiella отличаются фиолетовым цветом колонии на розовой или оранжевой нижней части питательной среды. Pseudomonas aeruginosa можно обнаружить по чистому оранжевому цвету с более темным центром колонии, позже становящимся зеленоватым спустя 24 часа, и по продуцированию желто-зеленоватой флуоресценции под ультрафиолетовым светом.

Преимущества нового изобретения состоят в следующем:

- Впервые обеспечена композиция, которая дает возможность раннего обнаружения и дифференцированного подсчета нескольких видов и генераций микроскопических грамотрицательных организмов, к которым относятся Salmonella typhi. Salmonella не-typhi, Escherichia coli, Proteus, Citrobacter и Pseudomonas.

- Баланс между пищевыми основами с адекватным общим содержанием азота, отношение между ними и ингибиторами, благоприятные условия, при которых целевые организмы растут без ингибирования, особенно Salmonella, а с другой стороны, гарантировано, что грамположительные организмы полностью ингибированы.

- Диагностическая специфичность для целевых организмов в композиции очень высока, потому что во всех проведенных опытах был получен 100% результат для всех организмов.

- Совершенно неожиданно выделение и идентификация Salmonella была обеспечена в течение всего лишь 12 часов, без необходимости предварительного "предобогащения" или обогащения образца.

- Аналитическая чувствительность очень высока даже до 24 часов для всех целевых организмов.

- С использованием данной композиции возможны ранняя идентификация и перечень организмов поздней ферментации лактозы, которые можно пересчитать и идентифицировать как колиморфные, такие как Citrobacter и Serratia.

- Представляет большой интерес то, что неожиданно Proteus, который интересен для санитарии и который является кишечной бактерией, не относящейся, однако, к роду колиморфных, и Salmonella typhi, другая грамотрицательная бактерия, растут в питательной среде и идентифицированы как бесцветные колонии, причем их присутствие не мешает подсчету колиморфных организмов и, таким образом, их можно идентифицировать в дальнейшем.

- Род Salmonella перечислен в форме, дифференцированной от ферментирующей маннит Shigella, такой как Shigella flexneri и Shigella sonnei.

- Благодаря балансу, достигнутому в предложенной композиции между ингибиторами, питательными веществами и другими веществами, стимулирующими рост, и их взаимосвязи с субстратами (которая допускает дифференцированную идентификацию целевых организмов), можно применять низкие концентрации индикаторов или веществ, для обнаружения реакции (от 0,01 до 0,06 г/л), благодаря чему усиливаются стимулирующие или пищевые качества продукта.

- Низкие концентрации индикаторов достаточны для идентификации целевых организмов, что экономит эти вещества, получить которые синтезом трудно.

- Вещества, которые образуют композицию, термостабильные, и ни одно из них не усложняет получение заключительной питательной среды. Они облегчают подготовку диагностического устройства без необходимости его стерилизации.

- Реакции, которые позволяют идентифицировать целевые организмы в этой композиции, ясны и являются общими для идентификации штаммов каждой генерации или вида. Не наблюдалось ни одого "атипичного" ответа ни для Salmonella, ни для остальной части кишечных бактерий, включая группу колиморфных организмов.

- Неожиданно при использовании этой композиции штаммы Klebsiella дали отличный от остальной части кишечных бактерий ответ, за исключением Citrobacter. Это составляет новую диагностическую возможность, потому что допускает предполагаемый подсчет этих двух микроорганизмов всякий раз, когда это требуется.

- В данном изобретении достигнуто значительное сокращение общего времени анализа. В случае E.coli в некоторых приложениях результат может быть достигнут меньше чем за 12 часов.

- Продукт не содержит веществ, распределение или растворение которых затруднительно; также как и не содержит несовместимых компонентов, поэтому его получение является простым.

- Соединение нескольких источников специально отобранных белков и белковых веществ, полученных в результате их гидролиза, с содержанием азота от 8 до 33%, обеспечивает достаточно питательных веществ для развития всей целевой генерации и разновидности без ингибирования, в короткий период времени. Присутствие других компонентов, таких как витамины и микроэлементы, поддерживает этот баланс.

- Изобретение обеспечивает отношение между компонентами органической и неорганической природы и белковыми веществами от 0,5:1 до 2:1, которое облегчает дифференцирование целевых организмов. Это отношение создает возможность роста микроорганизмов, легко ингибируемых группой соединений холевой и дезоксихолевой кислот, которые трудно дифференцировать традиционными методами деградации сахаров.

- Добавление двухвалентных оксидов металлов и кремнийсодержащих в количествах от 2 до 20 г/л, помимо активизации микробного метаболизма, дает возможность образования однородной твердой структуры, которая вместе с агаром с выбранной твердостью (400-700 г/см²) не препятствует формированию характерных колоний. Окраска колоний не диффундирует в питательную среду, что в конечном итоге облегчает одновременное дифференцирование по окраске широкого диапазона микроскопических организмов.

- Смесь яичных белков, помимо вклада в питательные вещества, дает возможность, совместно с упомянутыми в предыдущем абзаце веществами, появления контрастной зоны во всем объеме питательной среды, и это облегчает обнаружение нескольких окрасок и тональностей колоний.

- Комбинация спиртов, разрушаемых ферментами по меньшей мере одного из идентифицируемых микроорганизмов, в установленных количествах, с рН-индикаторами и Х-gal облегчает наблюдение реакции при высоких разбавлениях образца и через небольшое время от начала культивирования (меньше чем 12 часов для Е.coli и около 12 часов для Salmonella и колиморфных бактерий) и, таким образом, достигается правильная и достоверная идентификация, облегчая высокую чувствительность и специфичность диагностического устройства.

- Присутствие солей натрия и магния в заявленных количествах позволяет ускорить ферментативные реакции и в комбинации с другими соединениями, такими как креатинин и другие серосодержащие аминокислоты, также предполагает дополнительные питательные вещества для целевых микроорганизмов, которые восприимчивы к ингибированию соединениями холевой и дезоксихолевой кислот.

- Количества, в которых композиция восстанавливается в воде, также как способ приготовления и инкубация образцов, обеспечивают легкую, простую и надежную методику для лаборантов. Это придает исключительную надежность диагностической методике.

- Возможность, которую предлагает новая композиция для идентификации микроскопических организмов, только благодаря их специфическим цветовым характеристикам допускает прочтение и идентификацию результатов персоналом с минимумом подготовки.

Подробное описание изобретения

Для получения композиции, описанной в данном изобретении, компоненты приготовлены согласно их физическому состоянию: твердому или жидкому. Далее описано получение твердых компонентов или порошков.

Вещества белковой природы выбраны из группы панкреатических или папаиновых гидролизатов говяжьего сердца с общим содержанием азота между 9-14% и в количестве от 25 до 77% от массы смеси указанных веществ белковой природы; ферментированный гидролизат молочных белков с общим содержанием азота от 9 до 20% и в количестве вплоть до 15% от массы указанной смеси, также как яичные белки с общим содержанием азота от 5 до 7% и в количестве вплоть до 45% от массы смеси, просеяны или обработаны для достижения однородности по размеру частиц.

Эти вещества белковой природы берутся в соотношении от 2:1 до 24:1 по отношению к содержанию ингибиторов, выбранных из группы холевой и дезоксихолевой кислот, солей желчи и дезоксихолата натрия. После просеивания они готовы к смешению и гомогенизации с остальной частью органических и неорганических компонентов, которые добавлены в соотношении от 0,5:1 до 2:1 к массе смеси веществ белковой природы.

Предварительная смесь получается в результате комбинации оксидов двухвалентных металлов и/или кремнистых соединений (3MgO×4SiO₂×H₂O; SiO₂×H₂O), которые предварительно высушиваются и берутся в количествах между 6 и 32% по отношению к массе конечной смеси; рН-индикаторы, предпочтительно феноловый красный или нейтральный красный, берутся в количествах от 0,03 до 0,18% по отношению ко всей смеси; хромогенные соединения, которые могут метаболизировать под действием по меньшей мере одного организма, предпочтительно X-gal, - в количествах от 0,15 до 0,3% по отношению ко всей массе смеси. Пред-смесь этих соединений можно измельчить и просеять перед их гомогенизацией, таким образом, взвешиванием суммы количеств каждого компонента в композиции достигается адекватное распределение каждого.

Соли натрия и магния (карбонат натрия и хлорид магния) предварительно высушивают, измельчают и просеивают перед добавлением их к конечной смеси в количестве от 0,03 до 32%.

Азотное соединение с низким молекулярным весом, особенно креатинин (вплоть до 3% в отношении массы конечной смеси) и серосодержащие аминокислоты, предпочтительно цистин и цистеин (вплоть до 1,25% относительно конечной массы смеси), просеивают перед добавлением их к общей смеси.

Гелирующий агент, предпочтительно агар с твердостью между 400-700 г/см², который используется в количествах между 40-67% относительно конечной массы смеси, высушивают и просеивают перед добавлением его к конечной смеси.

Все компоненты, упомянутые выше как пред-смесь, ссыпают вместе в гомогенизатор и смешивают до достижения однородного содержания, с рН от 6,8 до 7,4. Эту смесь ссыпают в колбы и плотно закрывают, защищая от света, поддерживая их при комнатной температуре.

Жидкие составляющие композиции, которыми могут быть полиспирты, в частности С₃Н₈O₂, и яичные белки без дегидратации, а также дистиллированную или деионизированную воду, тщательно перемешивают для получения гомогенного раствора.

Порошок добавляют к жидкой смеси в количествах от 30 до 32 г/л, таким образом восстанавливая композицию, и суспензия композиции готова к употреблению.

Композицию можно приготовить в лабораторном масштабе, взвешивая компоненты по отдельности в контейнере и поддерживая все ранее упомянутые пропорции. Жидкую смесь добавляют впоследствие к порошковой смеси. Суспензию взбалтывают и оставляют для набухания на 10 минут перед тем, как довести ее до кипения по меньшей мере в течение 1-3 минут. Суспензию охлаждают до 45-50°С и распределяют в окончательном контейнере для пробы. Композиции дают возможность затвердеть при температуре 25-30°С. Если в верхней части контейнеров наблюдается влага, когда содержимое превращается в гель, она должна быть высушена любым из известных способов перед инокуляцией образцов. Микроскопические организмы или образцы, которые их содержат, инокулируют любым из способов штриховой разводки или любыми способами распространения на поверхности. Инокулированные реципиенты инкубируют при температуре от 30 до 45°С по меньшей мере 12 часов.

Оценку результатов проводят, наблюдая окраску и морфологию изолированных колоний на поверхности. Наблюдение сине-зеленоватых колоний с более темным центром на оранжевом фоне питательной среды, регулярных границ и размера от 1 до 5 мм, в зависимости от времени инкубации, является характерным для E.coli и колиформных организмов, за исключением Citrobacter и Klebsiella genera, которые наблюдают подобным образом, но с фиолетовой окраской на фоне питательной среды с окраской от розового до оранжевого.

У рода Salmonella не-typhi наблюдается красным окрашенный центр на розовом фоне питательной среды с регулярными границами и диаметром от 1 до 6 мм, в зависимости от времени инкубации. Колонии Salmonella typhi и Proteus наблюдают по характерной окраске питательной среды, благодаря их прозрачности, регулярные границы и размер - от 1 до 3 мм, в зависимости от времени инкубации.

Штаммы Pseudomonas aeruginosa отличают по оранжевой окраске с темным центром и зеленоватой пигментацией, начиная с 24 часов инкубации, и излучению желто-зеленоватой флуоресценции под низким ультрафиолетовым светом (365 нм). Другие грамотрицательные организмы остаются бесцветными в питательной среде.

Примеры

Пример №1.

Получено 400 г обезвоженной композиции в виде порошка следующего состава:

Компонент	г/400 г питательной среды
Панкреатический гидролизат говяжьего сердца (общий азот ≈10%)	63
Ферментативный гидролизат молочных белков (общий азот ≈12%)	38
Гидролизат дрожжей Saccharomyces (общий азот ≈8%)	38

Компоненты, взятые в указанном соотношении, предварительно просеивали.

В композицию в качестве ингибиторов были включены соли желчи (16,6 г). Пред-смесь готовили из 51 г 3MgO×4SiO₂×H₂O, 1 г X-gal и 0,4 г нейтрального красного. Все ингредиенты смешивали с агаром в качестве гелирующего агента, взятого в количестве 191 г (прочность геля 560 г/см²), и карбонатом натрия в количестве 2 г. После достижения однородности и доведения рН до 7,1 композицию помещали в герметично изолированные колбы в количествах по 15,7 г.

Одновременно добавляли С₃Н₈О₂ в стеклянные колбы по 5 мл.

Содержание каждой колбы с твердой композицией пересыпали в колбу Эрленмейера, которая содержала смесь деионизированной воды и содержимого колбы с С₃Н₈О₂; смесь взбалтывали, оставив для набухания в течение 10 минут, затем нагревали до кипения в течение 3 минут, охлаждали до температуры 45°С и распределяли по чашкам Петри. Когда композиция превращалась в гель, проводили характеристическую и функциональную оценку. Дифференциацию колоний и стимуляцию роста по сравнению с триптоновым соевым агаром оценивали по сертифицированным штаммам согласно Таблице 1.

Таблица 1
Дифференциация и стимуляция роста в течение 24 часов
Организм	Штамм ATCC	Характеристика изолированных колоний	Экспериментальная среда CFU/мл	Триптоновый соевый агар FCU/мл	Р≤0,05
Salmonella typhimurium	14028	Красный центр, регулярные границы ≈2-3 мм	430±42,4	430±17,6	-
Escherichia coli	25922	Сине-зеленоватая окраска, регулярные границы ≈2 мм	180±21,2	200±10,6	-
Citobacter freundii	9080	Фиолетовая окраска, регулярные границы ≈2 мм	320±98,9	370±3,5	-

Экспериментальная: Композиция, описанная в этом изобретении.

CFU/мл: Колониеобразующие единицы на каждый мл при разбавлении 10^-6

+ Существуют значимые отличия при р≤0,05

- Нет значимых отличий при р≤0,05

Инокулировали штамм Streptococcus faecalis ATCC 29212, разбавление 10^-1, который ингибировался к 24 часу.

Диффузии окраски от колоний в питательную среду не наблюдали, что очень облегчало подсчет и дифференциацию колоний. В результате был получен перечень и достигнута возможность ранней дифференциации поздних ферментеров лактозы, таких как Citrobacter. Стимуляция роста испытуемых видов оказалась сравнимой с используемой обычно многоцелевой питательной средой, такой как триптоновый соевый агар, и это было статистически достоверно. Значительных различий между подсчетами, полученными в обеих средах, не обнаружили. Ингибирование грамположительных микроорганизмов все еще наблюдали при высокой концентрации инокулята.

Впоследствие была проведена оценка новой композиции в сравнении с другими средами, на которые делаются ссылки, это торговые марки:

Бриллиантовый зеленый агар (BGA): Приготовлен в концентрации 50 г/л деионизованной воды путем встряхивания смеси и кипячения до полного растворения. Его стерилизовали при 121°С в течение 15 минут, охлаждали до 45-50°С и распределяли по чашкам Петри.

Агар Рамбаха (RA): Содержимое флакона (для приготовления 1 л) вливали в колбу с 1 л смеси жидкой составляющей с деионизированной водой. Содержимое взбалтывали и нагревали при перемешивании до кипения, охлаждали до 45-50°С и распределяли по чашкам Петри.

Агар с желчью и фиолетовым красным (VRBA): Приготовлен при концентрации 38,5 г/л в деионизированной воде, содержимое взбалтывали и нагревали с перемешиванием до кипения, охлаждали до 45-50°С и распределяли по чашкам Петри.

Согласно Таблице 2 помимо роста микроорганизмов в питательной среде сравнивали стимуляцию роста при разбавлении 10^-6 каждого инокулята.

Таблица 2
Оценка роста различных микроорганизмов (инкубация при 37°С в течение 24 часов)
Организм	Питательная среда	Характеристика и цвет изолированных колоний	Стимуляция роста
			CFU/мл	р≤0,05
Salmonella enteriditis АТСС 13076	VRBA	Розовый, регулярные границы ≤1 мм	15±7,6	-
RA	Фиолетовый красный, регулярные границы≈1-2 мм	100±40,0
Экспериментальная	Красный центр, регулярные границы ≈1-2 мм	130±74,0
Salmonella typhimurium АТСС 14028	VRBA	Розовый, регулярные границы ≤1 мм	50±36,5	-
RA	Фиолетовый красный, регулярные границы ≈1-2 мм	260±201,5
Экспериментальная	Красный центр, регулярные границы ≈1-2 мм	220±138/0
Salmonelia typhi АТСС 19430	VRBA	Нет роста	Нет роста	+
RA	Нет роста	Нет роста
Экспериментальная	Бесцветный, регулярные границы ≈2 мм	130±28,7
Proteus vulgaris АТСС 13315	VRBA	Нет роста	Нет роста	+
RA	Нет роста	Нет роста
Экспериментальная	Бесцветный до розового, регулярные границы ≈2 мм	225±28,0

Экспериментальная: Композиция, описанная в данном изобретении

CFU/мл: колониеобразующие единицы в каждом мл при разбавлении 10^-6.

+ Существуют значимые отличия при р≤0,05

- Нет значимых отличий при р≤0,05

Рост Proteus vulgaris в питательной среде наблюдался даже при высоких разбавлениях, дифференцированный рост видов Salmonella не-typhi продемонстрирован интенсивным розовым до красного цвета в центре колоний, хорошо дифференцирован от штамма Salmonella typhi. Последний рост в композиции без ингибирования даже при высоких разбавлениях.

Три штамма, относящихся к группе колиформных организмов, также инокулировали в композицию, используя рекомендованные традиционные среды: агар с желчью и фиолетовым красным и агар Рамбаха. Рост и характеристика колоний показаны в Таблице 3.

Таблица 3
Оценка роста нескольких микроорганизмов группы колиформных в композиции
Организм	Питательная среда	Характеристика и цвет изолированных колоний	Стимуляция роста
			CFU/мл	р≤0,05
Enterobacter aerogenes АТСС 13048	VRBA	Розовый, регулярные границы ≈2 мм	350±130,5	-
RA	Нет роста	Нет роста
Экспериментальная	Сине-зеленоватый, регулярные границы ≈2-3 мм	60±19
Escherichia coil АТСС 25922	VRBA	Красный с осадком желчи, регулярные границы ≈3 мм	395±116	-
RA	Темно-синие с голубым ореолом в питательной среде, регулярные границы ≈2 мм	135±115
Экспериментальная	Сине-зеленоватый, регулярные границы ≈2-3 мм	270±43
Citrobacter freundii АТСС 9080	VRBA	Серый, регулярные границы ≈2 мм	765±328	-
RA	Красно-каштановый, регулярные границы ≈1-2 мм	305±20
Экспериментальная	Интенсивный розово-фиолетовый, регулярные границы ≈2 мм	460±7,5

Экспериментальная: Композиция, описанная в данном изобретении.

CFU/мл: колониеобразующие единицы на каждый мл при разбавлении 10^-6.

+ Существуют значимые различия при р≤0,05

- Не существует значимых различий при р≤0,05

Стимуляция роста испытуемых колиформных микроорганизмов статистически сходна с таковой, полученной в традиционной питательной среде (агар с желчью и фиолетовым красным), и выше, чем полученная в агаре Рамбаха для Enterobacter aerogenes. Дифференциации этой колиформной группы достигали в экспериментальной композиции по их характерной сине-зеленоватой окраске, отличающейся от таковой у рода Citrobacter с их фиолетовой окраской. Дифференциация этого организма поздней ферментации не достигается в традиционных питательных средах, основанных на ферментации лактозы.

Композицию оценивали с помощью сертифицированных штаммов, время инкубации составляло 18 часов, согласно данным, показанным в Таблице 4.

Таблица 4
Характеристика роста и колоний за 18 часов
Организм	Штамм	Характеристика колоний
Shigella flexneri	ATCC 12022	Прозрачная, регулярные границы меньше чем 1 мм
Salmonella typhi	ATCC 19430	Прозрачная, регулярные границы, блестящая
Salmonella typhimurium	ATCC 14028	Красные центры, регулярные границы
Proteus vulgarls	ATCC 13315	Прозрачная, регулярные границы
Staphylococcus aureus