Биотрансплантат и способ лечения остеопороза

Биотрансплантат и способ лечения остеопороза

Реферат

Изобретение касается получения культуры генетически немодифицированных мезенхимальных стволовых клеток и метода лечения остеопороза.

Актуальность проблемы остеопороза подтверждена результатами широкомасштабных длительных эпидемиологических исследований, свидетельствующих о широкой распространенности остеопороза в популяции, существенном негативном влиянии этого заболевания на состояние здоровья и значительном экономическом ущербе.

Остеопороз - это системное заболевание скелета, характеризующееся снижением костной плотности и нарушением трабекулярной микроархитектоники костной ткани. Постоянно увеличивающаяся хрупкость костей приводит к повышению риска переломов, который представляет собой один из наиболее значимых клинических аспектов заболевания.

Лечение остеопороза представляет собой непростую задачу, так как заболевание имеет гетерогенную природу и, как правило, диагностируется поздно, когда уже имеются переломы и необратимые изменения в костях. Оно протекает длительно, со спонтанными обострениями и периодами ремиссии, требует большого терпения и активного участия больного в лечебном процессе, поскольку эффект может проявиться после длительного периода времени. Целью лечения являются замедление или временное прекращение потери костной массы, предотвращение переломов костей, улучшение состояния больного, расширение его двигательной активности, максимально возможное восстановление трудоспособности, улучшение качества жизни.

Лечение остеопороза основано на трех принципах: этиологическом, патогенетическом, симптоматическом. Этиологический принцип - лечение основного заболевания при вторичном остеопорозе. При этом требуется коррекция или отмена "ятрогенных" в отношении остеопении препаратов. Однако, поскольку заболевания, симптомом которых является остеопороз, чаще всего имеют хроническое течение, "ятрогенные" препараты оказываются в ряде случаев жизненно необходимыми. Поэтому этиологический принцип не всегда бывает радикальным. Патогенетический - основной принцип в лечении первичного и многих вариантов вторичного остеопороза. Он направлен на подавление повышенной костной резорбции, на стимуляцию костеобразования или на нормализацию обоих процессов костного ремоделирования. Симптоматический принцип включает применение сбалансированной по кальцию, фосфору и белкам диеты, назначение препаратов солей кальция, использование дозированных физических нагрузок и лечебной физкультуры, физиотерапевтических методов, ортопедического лечения, обезболивающих средств [Насонов Е.Л., 2000].

В настоящий момент к основным группам препаратов для патогенетического лечения остеопороза относятся препараты, замедляющие костную резорбцию (эстрогены, селективные модуляторы эстрогенных рецепторов, кальцитонины, биофосфонаты, кальций; препараты, стимулирующие костеобразование (фториды, паратиреоидный гормон, гормон роста, анаболические стероиды, андрогены; препараты многопланового действия (активные метаболиты витамина D, оссеин-гидроксиапатитный комплекс, иприфлавон, вещества, содержащие фосфаты, стронций, кремний, алюминий, тиазиды) [Рожинская Л.Я., 2000].

Регенерация костной ткани при повреждении и системной резорбции происходит за счет мезенхимальных стволовых клеток (МСК), которые являются предшественниками остеобластов и способствуют формированию ремоделирующих единиц. В настоящее время использование МСК для системной и местной регенерации костной ткани находит все большее применение [Jorgensen С., et al, 2001].

Опубликованы результаты клинического исследования трансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга детям с нарушенным остеогенезом. У шести детей с наследственным дефектом развития скелета (osteogenesis imperfecta) было произведено по две инфузии аллогенных меченых мезенхимальных костномозговых клеток. У 5 пациентов клетки прижились в одном и более органов (кости, кожа, строма костного мозга). После лечения наблюдалось увеличение скорости роста пациентов в течение первых 6 месяцев после трансплантации. Сравнительно непродолжительный эффект и быструю потерю клеток исследователи объясняют иммунной реакцией реципиента, что является одним из основных недостатков использования взрослых неаутологичных клеток донорских мезенхимальных клеток [Smith R., 2001].

Большинство исследователей предпочитают аутогенные клетки (костный мозг, клетки периферической крови). Преимущества аутотрансплантатов не вызывают сомнений, однако имеется ряд ограничений по их применению. В частности, длительность выращивания клеточных культур - более 2 месяцев, может являться критической для ряда пациентов; клетки, полученные от пожилых и тяжелобольных людей обладают низкой способностью к пролиферации и самообновлению.

В сравнении с аутологичным клеточным трансплантационным материалом донорские (в том числе фетальные) клетки обладают рядом преимуществ:

фетальные клетки имеют больший потенциал роста и пролиферации, выраженную способность к дифференцировке и функционально более активны, продуцируют факторы роста и регенерации;

пересаженные фетальные клетки стимулируют ангиогенез;

фетальные клетки и ткани лучше переносят гипоксию и холодовую консервацию;

культуры донорских клеток могут быть приготовлены заранее и использоваться по первому требованию.

Наиболее выраженным терапевтическим потенциалом при патологиях костной ткани обладают мезенхимальные стволовые клетки, способные восполнять необходимое количество остеобластов и, соответственно, ремоделирующих единиц костной ткани. Являясь уникальной «фабрикой» цитокинов и факторов роста, донорские МСК обеспечивают активизацию собственных резервов организма. Мезенхимальные стволовые клетки в основном получают из донорского костного мозга, однако существуют и другие источники - скелетные мышцы, подкожная жировая ткань, фетальные органы гемопоэза (печень, тимус, селезенка). МСК из фетальных органов гемопоэза и методики их получения практически не изучены. Описанные методики выращивания МСК из костного мозга и липоаспиратов позволяют получить гетерогенные популяции клеток стромы, лишь небольшой процент которых являются стволовыми. Клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в различные клеточные линии и, таким образом, терапевтически неэффективны. После трансплантации стромальные клетки мигрируют преимущественно в соединительную ткань и там накапливаются. При стандартном пассировании в высоких посевных дозах доля зрелых стромальных клеток быстро увеличивается.

Использование в качестве трансплантата гомогенной (не менее 80%) популяции плюрипотентных МСК позволяет повысить эффективность лечения, увеличить воспроизводимость результатов и избежать нежелательных эффектов.

Задачами настоящего изобретения являются получение биотрансплантата для комплексного, патогенетического метода лечения остепороза, эффективность которого подтверждается достоверным увеличением минеральной плотности костной ткани (МПКТ) или прекращением ее потери по данным денситометрии, динамикой основных биохимических показателей, позволяющих оценить костеобразование (щелочная фосфатаза, остеокальцин) или снижение костной резорбции (экскреция кальция, деоксипиридонолин), отсутствием новых переломов костей, улучшением общего состояния больного, уменьшением болей в костях, расширением двигательного режима, улучшением качества жизни пациента.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Биотрансплантат для лечения остеопороза содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.

В качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.

В качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.

В качестве аутологичного материала используют ткани: костный мозг, жировая ткань.

Биотрансплантат предназначен для внутривенного введения. Предложен также способ лечения остеопороза, заключающийся в том, что пациенту внутривенно, капельно вводят биотрансплантат по п.1, включающий от 50 до 500 млн. мезенхимальных стволовых клеток.

МСК с преимущественной способностью к остеогенной дифференцировке выделяют из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань) или донорских (костный мозг, жировая ткань, тимус) тканей или аутологичного материала (костный мозг, жировая ткань). Для выделения фетальных клеток используют абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых женщин, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций.

Возможность использования биоматериала достигается на следующих сроках гестации: печень - 5-8 недель, тимус - 18-20 недель, костный мозг - 17-20 недель, подкожная жировая ткань - 17-19 недель. Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей - например тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1,500×g, 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 миллионов мононуклеарных клеток на 1 см² в зависимости от источника выделения. Через 1 сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 5% CO₂. Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций. По достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см² в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг\мл трансферрина, 1 мкг\мл инсулина, 10 нг\мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД\мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток\см² и выращивают до состояния преконфлуентности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводят к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы. Экспериментально подобранные условия, объединяющие критерии отбора исходного материала и режим культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов.

Система отбора источников получения МСК позволяет получить культуры клеток с преимущественной способностью к остеогенной дифференцировке.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных клеток.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют сохранить плюрипотентность клеточных культур.

Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получить большое количество клеток для трансплантации (серию), что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.

Способ лечения базируется на экспериментально доказанном факте репаративного действия мезенхимальных стволовых клеток.

Трансплантацию осуществляют в условиях терапевтического или любого профильного отделения в присутствии врача-терапевта. Перед началом трансплантации осуществляют биологическую пробу. Раствор мезенхимальных стволовых клеток подключают к пациенту, струйно переливается 0,5 мл, после чего систему перекрывают. У реципиента выясняют жалобы на состояние, болевые ощущения, измеряют артериальное давление и подсчитывают пульс. Признаками биологической несовместимости являются появление болей в поясничной, эпигастральной областях, головных, загрудинных болей, чувства страха, наличие пота и отечности лица, снижение артериального давления, учащение пульса. Пробу повторяют три раза. При отрицательном результате приступают к трансплантации.

Культура мезенхимальных стволовых клеток разводится в 50 мл физиологического раствора, тщательно перемешивается, вводится внутривенно капельно со скоростью 10 мл/мин.

В течение 24 часов после трансплантации за пациентом необходимо наблюдение в терапевтическом отделении.

Эффективность предложенного способа заключается в увеличении плотности костной ткани по данным денситометрии, динамике биохимических показателей и улучшении двигательной активности пациента.

Обследовано 11 женщин, средний возраст которых составил 56,9±2,57 года. Давность менопаузы - от 1 года до 6 лет. Всем больным проводили клинико-лабораторное и инструментальное исследование, включавшее определение роста, массы тела, уровня кальция в сыворотке крови и его суточной экскреции с мочой, кислой и щелочной фосфатазы, суточной экскреции оксипролина с мочой. Выполняли рентгенографию грудного и поясничного отделов позвоночника в двух проекциях и ультразвуковую денситометрию. Всем больным провели трансплантацию мезенхимальных стволовых клеток по предложенному способу.

При анализе данных субъективного исследования выявлено, что в обеих группах наиболее распространенными были жалобы на боль в спине, боль в конечностях. Общую слабость отмечали 5 из 11 пациенток.

При лабораторном исследовании у пациенток выявлено повышение уровня кислой фосфатазы до 0,25+0,014 ммоль/ч/л и суточной экскреции оксипролина с мочой до 43,8±2,50 мг/сут, что свидетельствовало об активации процессов костной резорбции у этих больных. При рентгенологическом исследовании позвоночника у больных выявлен остеопороз. У 6 пациенток обнаружены переломы одного грудного или поясничного позвонка. При денситометрическом исследовании у всех больных наблюдалось снижение ШОУ более чем на 2,5 стандартных отклонения, что свидетельствует о наличии у них остеопороза.

По данным проведенного через 6 месяцев и через 1 год клинико-лабораторного и инструментального исследования отмечена положительная динамика субъективных и объективных показателей. Так, после лечения достоверно уменьшилось число больных, предъявлявших жалобы на боль в спине и нижних конечностях.

При биохимическом исследовании выявлено достоверное снижение содержания кислой фосфатазы (с 0,25±0,014 до 0,20±0,015 ммоль/ч-л; р<0,01) и суточной экскреции с мочой оксипролина (с 43,8±2,5 до 29,7±2,4 мг/сут; р<0,05), снижение содержания остеокальцина (с 22,5±4,3 до 10,4±4,2 нг/мл; р<0,05), щелочной фосфатазы (с 1,44±0,09 до 1,19±0,08 ммоль/ч-л; р<0,05), суточной экскреции кальция с мочой (с 380±18,7 до 290±17,9 мг/сут; р<0,01) и оксипролина (с 52,1±2,6 до 31,2±2,4 мг/сут; р<0,05).

При рентгенологическом исследовании новых переломов грудных и поясничных позвонков за время лечения не выявлено. При денситометрическом исследовании у больных выявлено повышение ШОУ на 1,1%

1. Биотрансплантат для лечения остеопороза, характеризующийся тем, что он содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала, при этом ткань дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют и культивируют на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления в культуре клеток зрелой стромы.

2. Биотрансплантат по п.1, в качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.

3. Биотрансплантат по п.1, в качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.

4. Биотрансплантат по п.1, в качестве аутологичного материала используют ткани: костный мозг, жировая ткань.

5. Биотрансплантат по п.1 предназначен для внутривенного введения.

6. Способ лечения остеопороза, характеризующийся тем, что пациенту внутривенно, капельно вводят биотрансплантат по п.1, включающий от 50 до 500 млн. мезенхимальных стволовых клеток.