Способ культивирования бактерий lawsonia intracellularis, штаммы l.intracellularis, способ культивирования бактерий l.intracellularis (вариант), способ получения аттенуированного штамма l.intracellularis, способ определения наличия антител, вакцина, способ индукции иммунного ответа и аттенуированный штамм l.intracellularis n343np40wk

Способ культивирования бактерий lawsonia intracellularis, штаммы l.intracellularis, способ культивирования бактерий l.intracellularis (вариант), способ получения аттенуированного штамма l.intracellularis, способ определения наличия антител, вакцина, способ индукции иммунного ответа и аттенуированный штамм l.intracellularis n343np40wk

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение направлено на создание вакцины против бактерий Lawsonia intracellularis, способы защиты от них и диагностику инфекций, вызываемых Lawsonia intracellularis. Продукты и способы по изобретению частично достижимы в результате усовершенствованного способа, который разработан для крупномасштабного культивирования бактерий Lawsonia intracellularis.

Описание аналогичных технических решений

Бактерии Lawsonia intracellularis являются причинным агентом пролиферативной энтеропатии свиней (ПЭС) и действует практически на все животные организмы, включая человека, кроликов, хорьков, хомяков, лис, лошадей и других животных, таких различных, как страусы и эму.

Бактерии Lawsonia intracellularis являются особенно значительной причиной потерь в свиных стадах. Оценки распространенности и заболеваемости ПЭС в США достигали 20 процентов свиного стада с номинальными потерями в 20 миллионов долларов ежегодно.

Характерным признаком ПЭС является обнаружение интрацитоплазматических не связанных с мембраной изогнутых палочковых бактерий в энтероцитах поврежденных областей кишечника. Бактерии, ассоциированные с ПЭС, были отнесены к "Campylobacter-подобным организмам". S.McOrist и др., Vet.PathoL, т.26, 260-64 (1989). Впоследствии причинные бактерии были идентифицированы как новый таксономический род и вид, общеупотребительно отнесенный к Heal symbiont (IS) intracellularis. C.Gebhart и др., International J. of Systemic Bacteriology, т.43, №3, 533-38 (1993). Позднее эти новые бактерии получили таксономическое название Lawsonia (L) intracellularis. S.McOrist и др., International J. of Systemic Bacteriology, т.45, №4, 820-25 (1995). Эти три названия были использованы равнозначно для обозначения того же организма, что и идентифицированный и описанный в дальнейшем здесь. Заявитель стремился использовать таксономическое название, L.intracellularis, в ходе обсуждения настоящего изобретения.

L.intracellularis - это облигатная внутриклеточная бактерия, которая не может культивироваться нормальными бактериологическими методами на обычных бесклеточных средах и, как считалось, для роста им необходимы прикрепленные эпителиальные клетки. S.McOrist и др. Infection and Immunity, т.61, №10, 4286-92 (1993) и G. Lawson и др., J. of Clinical Microbiology, т.31, №5, 1136-42 (1993) обсуждают культивирование L.intracellularis с использованием монослоев клеток кишечного эпителия крысы IEC-18 в обычных сосудах для культур тканей. Кроме того, Н.Stills, Infection and Immunity, т.59, №9, 3227-36 (1991) обсуждает использование монослоев клеток кишечника человеческого эмбриона Intestine 407 и монослоев клеток аденокарциномы ободочной кишки морской свинки в обычных сосудах для культур тканей. Эти прежние методы культивирования трудоемки и не пригодны для масштабирования.

Современному пониманию инфекции, вызываемой L.intracellularis, лечению и эффективному контролю заболевания серьезно препятствовали изощренные требования к in vitro культурам, L.intracellularis. В настоящее время необходим улучшенный способ культивирования L.intracellularis. Необходимы также вакцины против L.intracellularis и эффективные средства диагностики инфекции, вызываемой L.intracellularis.

Краткое описание изобретения

Одним объектом изобретения является обеспечение вакцин против бактерий L.intracellularis.

Другим объектом изобретения является обеспечение способов определения наличия антител к L.intracellularis в биологических образцах.

Дальнейшим объектом является обеспечение улучшенного способа культивирования L.intracellularis, позволяющего проводить его в больших масштабах с целью получения вакцин и диагностических агентов.

Для достижения этих и других объектов и в соответствии с целью изобретения, как осуществлено и подробно здесь описано, настоящее изобретение обеспечивает способ культивирования L.intracellularis и крупномасштабных поставок образующихся при этом бактерий. В соответствии со способом бактерии L.intracellularis инкубируют при концентрации кислорода от примерно 0 процентов до примерно 18 процентов при перемешивании бактерий для того, чтобы культивировать L.intracellularis, при сохранении бактерий в суспензии.

В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения обеспечивается способ культивирования бактерий L.intracellularis посредством инокуляции (заражения) монослоя клеток Нер-2, McCoys или IEC-18 со слиянием около 30 процентов с использованием инокулята, включающего бактерии L.intracellularis, для того, чтобы инфицировать клетки бактериями. Затем инфицированные клетки инкубируют при температуре от примерно 36 до примерно 38°С при концентрации кислорода от примерно 0 процентов до примерно 8.0 процентов до тех пор, пока не произойдет слияние клеток. Затем инфицированные клетки и ростовая среда помещаются в ферментер, биореактор, вращающийся сосуд или в какой-либо другой сосуд, пригодный для поддержания клеток в суспензии. Инфицированные клетки инкубируют при перемешивании таким образом, чтобы культивировать бактерии L.intracellularis при поддержании инфицированных клеток в суспензии. Затем часть культивированных бактерий L.intracellularis пассируется в свежие культуральные клетки для того, чтобы увеличить образование бактерий L.intracellularis.

Изобретение обеспечивает вакцины против L.intracellularis и способы получения вакцин против L.intracellularis. Авирулентные бактерии L.intracellularis получаются пассированием культивированных бактерий L.intracellularis достаточное число раз и отбором аттенуированного штамма или путем воздействия на культивированные бактерии химических способов аттенуации. Убитые вакцины L.intracellularis также получаются с использованием методов культивирования данного изобретения. В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления изобретения бактерии непрерывно культивируют в течение, по крайней мере, около 6 и до 8 месяцев при пассировании, по крайней мере, около 7 и до 12 раз с целью получения аттенуированного штамма для использования его в качестве вакцины. Затем аттенуированные бактерии смешивают с фармацевтически приемлемым носителем и в эффективном количестве вводят животному для того, чтобы получить иммунный ответ. Заявитель сдал на хранение в Американскую Коллекцию Типовых Культур (АКТК) предпочтительный в настоящее время аттенуированный штамм N343NP40wk.

Изобретение обеспечивает также способ определения наличия антител, которые реагируют специфически с бактериями L.intracellularis в биологическом образце, путем выращивания, по меньшей мере, части культивированных бактерий L.intracellularis, заражения биологического образца от животного выращенными бактериями L.intracellularis или их компонентом в условиях, при которых антитело, присутствующее в биологическом образце, реагирует с L.intracellularis или с компонентом, и определения того, происходит ли реакция антитела с антигеном.

Дополнительные признаки и преимущества изобретения будут упомянуты далее в описании, которое следует, и станут очевидными при прочтении описания или могут быть поняты при практическом использовании изобретения.

Описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Термин "Z.intracellularis", как он используется здесь, означает внутриклеточные, изогнутые, грам-отрицательные бактерии, подробно описанные С.Gebhart и др., International J. of Systemic Bacteriology, т.43, №3, 533-38 (1993) и S.McOrist и др., International J. of Systemic Bacteriology, т.45, №4, 820-25 (1995) (каждый из которых включен здесь полностью в виде ссылки), и охватывает, но не только, бактерии, заложенные на хранение как АКТК 55672 в Американской Коллекции Типовых Культур (Роквилл, Мэриленд); бактерии, заложенные на хранение как НКТК 12656 и 12657 в Национальной Коллекции Типовых Культур (НКТК, Колиндейл, Лондон); причинные бактерии, которые повсеместно могут быть получены от свиней или других животных, инфицированных ПЭС, с учетом приведенных здесь специальных сведений и доктрин; варианты или мутанты любых из упомянутых выше бактерий независимо от того, получены они спонтанно или искусственно.

Термин "аттенуированный штамм", как он здесь используется, означает любой штамм L.intracellularis, который получен в соответствии с приемами культивирования и пассирования, приведенными здесь, с целью достижения вирулентности при поддержании иммуногенных свойств при введении животному-хозяину. Как демонстрируется ниже, различные несходные штаммы L.intracellularis были культивированы и аттенуированы в соответствии с доктринами настоящего изобретения с целью получения аттенуированных иммуногенных штаммов, имеющих эффективность как вакцины для свиней, так и для других животных, чувствительных к инфекции, вызываемой L.intracellularis.

Предполагается, что аттенуированные штаммы изобретения полезны в качестве иммуногенов в противомикробных вакцинах для животных, включая птиц, рыб, крупный рогатый скот, свиней, лошадей, вообще млекопитающих и приматов, и человека. Такие вакцины могут быть получены приемами, известными специалистам, с учетом доктрин, содержащихся здесь. Такая вакцина включала бы иммунологически эффективное количество аттенуированного штамма в фармацевтически приемлемом носителе. Вакцина могла бы быть введена в одной дозе или более. Иммунологически эффективное количество поддается определению способами, известными специалистам, без излишнего экспериментирования, с учетом содержащихся здесь доктрин. Количество авирулентных бактерий должно быть достаточным для того, чтобы стимулировать иммунный ответ у восприимчивых к заболеванию животных, оставаясь при этом авирулентным. Оно будет зависеть от конкретного животного, бактерий и вызванного ими заболевания. Рекомендованная доза для введения чувствительному животному составляет предпочтительно около 10³ до 10⁹ бактерий/кг веса тела и наиболее предпочтительно около 10⁵ до 10⁷ бактерий/кг веса тела. Носители известны специалистам и включают стабилизаторы и разбавители. Такая вакцина может содержать также соответствующий адъювант. Вакцины данного изобретения могут использоваться в комбинации с другими вакцинами, например, в качестве разбавителя другой лиофилизированной вакцины или смешиваться с другой вакциной перед лиофилизацией. Препараты вакцин могут быть также высушены, например, лиофилизацией для целей хранения или последующего получения лекарственной формы жидких вакцин.

Соответственно изобретение включает также метод индукции иммунного ответа к вирулентным бактериям L.intracellularis дикого типа у животного-хозяина с целью защиты его от таких бактерий. Метод включает введение хозяину иммунологически эффективного количества аттенуированных бактерий или убитых бактерий этого изобретения и, предпочтительно, введение хозяину вакцины этого изобретения.

Термин "крупномасштабное культивирование", как он использован здесь, означает уровень культивирования L.intracellularis больше чем приблизительно от 2.0 до 3.0 литров и включает производство в масштабе 100 литров или более.

Термин "культивирование", как он использован здесь, означает процесс промотирования роста, репродукции и/или пролиферации L.intracellularis.

При практическом применении способа культивирования по этому изобретению культуральные клетки могут сначала инокулироваться инокулятом, включающим бактерии L.intracellularis таким образом, чтобы инфицировать клетки бактериями. Многочисленные клеточные линии могут использоваться в практике этого изобретения, включая, но не только, IEC-18 (АКТК 1589) - эпителиальные клетки кишечника крысы, Нер-2 (АКТК 23) - клетки человеческой эпидермоидной карциномы, McCoys (АКТК 1696) - мышиные (неспесифицированные клетки), MDCK (АКТК 34) - клетки собачьих почек Madin-Darby, BGMK (Biowhittaker #71-176) - клетки почек зеленой обезьяны Buffalo и эпителиальные клетки кишечника свиньи. Предпочтительными культуральными клетками являются клетки Нер-2, McCoys или IEC-18. В качестве альтернативы бактерии могут культивироваться в бесклеточной среде до тех пор, пока бактерии поддерживаются при соответствующей концентрации растворенного кислорода, как описано здесь.

Если используются культуральные клетки, то перед инокуляцией предпочтительно, но не обязательно, клетки должны быть в виде монослоя. Для образования монослоя клетки можно сеять в обычных сосудах. Каждый сосуд, как правило, засевается в интервале от примерно 1×10⁵ до примерно 10×10⁵ клеток на 25 см² площади сосуда, смешанных с ростовой средой. Ростовой средой может служить любая среда для культивирования клеток, которая включает источник азота, необходимые ростовые факторы для выбранных культуральных клеток и источник углерода, такой как глюкоза или лактоза. Предпочтительной средой является среда Игла в модификации Дюльбекко (МДСИ) с 2-5% эмбриональной бычьей сыворотки, хотя и различные другие коммерчески доступные среды могут использоваться с хорошими результатами.

Было обнаружено, что успешное культивирование L.intracellularis усиливается поддержанием культуральных клеток в постоянном состоянии роста. Поэтому у монослоя культуральных клеток во время инокуляции слияние должно быть примерно от 20 до 50%. Предпочтительно слияние клеток во время инокуляции должно быть примерно от 30 до 40%, причем 30% слияния являются наиболее предпочтительными.

Инокулят может быть чистой культурой L.intracellularis, полученной, например, из депозита АКТК 55672, депозитов НКТК 12656 либо 12657 или от инфицированных свиней или других животных с использованием доктрин выделения и очистки, обсужденных здесь.

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения инокулят для практического применения изобретения представляет собой гомогенат кишечника, полученный соскабливанием слизистой оболочки подвздошной кишки свиньи или другого животного, инфицированного ПЭС. При получении гомогената кишечника отделы подвздошной кишки, выбранные для культивирования, должны иметь тяжелые повреждения с выраженным утолщением кишки. Вследствие недолговечности бактерий образцы должны сохраняться предпочтительно при -70°С как можно быстрее после аутопсии.

К инокуляту предпочтительно добавляют антибиотик, к которому бактерии L.intracellularis устойчивы, такой как ванкомицин, амфотерицин В или члены группы аминогликозидных антибитиков, включающей, например, гентамицин и неомицин, для того, чтобы подавить контаминирующие бактерии и дать возможность расти L.intracellularis. Независимо от того, является ли инокулят чистой культурой или гомогенатом кишечника, инокуляция культуральных клеток может осуществляться различными приемами, известными специалистам, с учетом приведенных здесь доктрин.

Затем бактерии и/или инокулированные культуральные клетки инкубируют при пониженной концентрации кислорода. При концентрации растворенного кислорода выше 18% рост L.intracellularis меньше оптимального, и в конечном итоге рост прекращается, если концентрации кислорода выходят за пределы этого значения. Предпочтительно инокулированные культуральные клетки инкубируют при концентрации растворенного кислорода в интервале от примерно 0% до примерно 10%. Более предпочтительно клетки инкубируют при концентрации кислорода в интервале от примерно 0% до примерно 8%, причем наиболее предпочтительной является концентрация кислорода в интервале от примерно 0% до примерно 3.0%.

Для правильного роста L.intracellularis необходима также надлежащая концентрация двуокиси углерода. При концентрациях двуокиси углерода более 10% и менее 4% наблюдается неоптимальный рост, и в конечном итоге - прекращение роста, если концентрации двуокиси углерода выходят за пределы этого интервала. Предпочтительно концентрация двуокиси углерода находится в интервале от примерно 6% до примерно 9%, причем наиболее предпочтительная концентрация двуокиси углерода составляет 8.8%.

Кроме того, клетки предпочтительно инкубируются при концентрации водорода в интервале от примерно 73% до примерно 94%. Вместо некоторого количества или всего водорода может быть использован азот. В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления изобретения клетки инкубируют примерно в 0-8.0% кислорода, около 8.8% двуокиси углерода и примерно 83.2% водорода.

Инокулированные клетки можно инкубировать в двойном газовом инкубаторе или другой газовой камере, которая содержит надлежащие концентрации кислорода и двуокиси углерода и которая позволяет клеткам находиться в суспендированном состоянии во время инкубации. Камера должна включать средства для поддержания инокулированных клеток в суспензии и газовый монитор и источник подачи газа для подведения и поддержания газа в надлежащей концентрации. Температура инкубации должна поддерживаться в интервале от 30°С до 45°С и более предпочтительно в интервале от 36°С до примерно 38°С. Самой предпочтительной является температура около 37°С. Необходимое оборудование для способов культивирования и аттенуации данного изобретения является общедоступным для обычных специалистов с учетом приведенных здесь доктрин. Одним из примеров оборудования, пригодного для осуществления на практике настоящего изобретения, является двойной газовый инкубатор, например модель 480, поставляемая фирмой Лэб-Лайн (Мельроуз Парк, Иллинойс), в сочетании с вращающимися сосудами для поддержания клеток в суспензии. Предпочтительное современное оборудование включает ферментер, биореактор или роторное встряхивающее устройство, вмещающее, по меньшей мере, 2 литра среды и способное поддерживать культуральные клетки в суспензии посредством барботирования газа в соответствующей концентрации, или другие средства механического перемешивания и постоянного мониторинга уровней кислорода, растворенного в среде. Подходящие для этой цели ферментеры и биореакторы производят Нью-Брунсвик, Браун и другие компании.

Поддержанием инокулированных клеток в суспендированном состоянии в ходе инкубации достигается максимальный рост клеток и, следовательно, L.intracellularis путем увеличения контакта каждой клетки в отдельности со средой и надлежащей смесью кислорода и двуокисью углерода. Культуральные клетки могут перемешиваться и поддерживаться в суспензии разнообразными методами, известными специалистам, включая, например, сосуды для культивирования, вращающиеся бутыли, полупроницаемые мембраны для культивирования и вращающиеся сосуды. При инкубации клетки могут поддерживаться в суспендированном состоянии посредством инкубации их во вращающемся сосуде внутри двойного газового инкубатора или подобного аппарата. Термин "вращающийся сосуд", как он использован здесь, означает сосуд или какой-либо другой контейнер, снабженный лопастью, пропеллером или другими средствами для перемешивания культуры и поддерживающий содержащиеся в нем клетки в суспендированном состоянии.

В особо предпочтительном варианте осуществления изобретения инокулированные клетки инкубируют до тех пор, пока они не достигнут слияния, а затем клетки помещают во вращающийся сосуд с ростовой средой и инкубируют в двойном газовом инкубаторе при вращении сосуда. Предпочтительно инокулированные клетки соскабливают во вращающийся сосуд. Это может быть достигнуто разнообразными способами, известными специалистам, таким, например, как использование клеточного скребка для отделения клеток. Как только клетки вводят во вращающийся сосуд, лопасть в нем вращается со скоростью в интервале от примерно 30 до примерно 60 об/мин для того, чтобы поддерживать клетки в суспензии.

Часть культивированных бактерий L.intracellularis затем пассируется в свежую культуру с целью повышения образования бактерий L.intracellularis. Термин "пассируется" или его вариации, как они здесь используются, означают процесс перенесения части культивированных бактерий L.intracellularis в свежие культуральные клетки с целью инфицирования свежих клеток бактериями. Термин "свежие", как он использован здесь, означает клетки, которые еще не инфицированы L.intracellularis. Предпочтительно возраст таких клеток, в среднем, не более примерно одних суток.

Пассаж L.intracellularis в суспензионные культуры можно выполнить удалением части исходной культуры и добавлением ее в новый сосуд, содержащий свежие культуральные клетки. Если исходная культура имеет высокое значение количества бактерий/мл, например, более примерно 10 бактерий/мл, предпочтительно добавлять в новый сосуд, содержащий свежие клетки, примерно от 1 до 10% (объемных) культуры из инфицированного сосуда. Предпочтительно осуществлять это, когда 50-100% клеток инфицированы. Если инфицировано менее 50% клеток, предпочтительно проводить пассаж разделением культуры в соотношении 1:2 в новом сосуде и доведением объема путем добавления свежей среды. В любом случае не нужен лизис клеток и другие этапы, в отличие от пассажа монослойных культур по прототипу.

После достаточного роста культуральных клеток и последующего заражения бактериями L.intracellularis до уровня клеточной инфективности более примерно 70%, что определяется иммунно-ферментным анализом (ИФА), 50%-ной инфекционной дозой тканевой культуры (ТКИД₅₀) или другим сопоставимым методом, собирают, по крайней мере, часть культивированных бактерий L.intracellularis. Этап сбора может осуществляться выделением бактерий из суспензии различными приемами, известными обычным специалистам, с учетом приведенных здесь доктрин. Предпочтительно бактерии L.intracellularis собирают центрифугированием содержимого всей или части суспензии с образованием осадка культуральных клеток, ресуспендированием образующихся клеточных осадков и лизисом инфицированных клеток. Обычно, по меньшей мере, часть содержимого центрифугируется при примерно 3000g в течение примерно 20 минут для того, чтобы осадить клетки и бактерии. Затем осадок ресуспендируют, например, в растворе сахароза-фосфат-глутамат (СФГ) и пассируют примерно четыре раза через иглу калибра 25 для того, чтобы лизировать клетки. Если желательна дальнейшая очистка, образцы могут быть центрифугированы при примерно 145g в течение примерно пяти минут для того, чтобы удалить клеточные ядра и осколки. Затем можно центрифугировать супернатант при примерно 3000g в течение примерно двадцати минут и образующийся осадок ресуспендировать в соответствующем растворителе, таком как СФГ с эмбриональной бычьей сывороткой (чтобы получить собранные бактерии, пригодные для замораживания или использования в качестве инокулята) или ростовой средой (чтобы получить собранные бактерии, более пригодные для пассирования в свежие клетки).

Как упоминалось ранее, эффективный рост L.intracellularis для крупномасштабного производства усиливается содержанием культуральных клеток в состоянии активного роста. В монослоях, когда культуры становятся сливающимися, скорость деления клеток существенно снижается. Попытки вырастить L.intracellularis на монослойных культурах тканей имели ограниченный успех, и масштабирование не было возможным. Однако использование суспензионных культур очень благоприятствует содержанию клеток в состоянии активного роста и позволяет продолжать развитие культуры и проводить масштабирование. Используя ферментер и растворенный кислород в количестве около 0-3%, мы смогли вырастить до 10⁸ бактерий/мл. Мы смогли также держать культуральные бактерии в состоянии активного роста в течение многих месяцев и ожидаем, что сможем сделать это в течение неограниченного времени.

До настоящего изобретения обычно считалось, что клетки должны прикрепляться к поверхности для того, чтобы инфицироваться L.intracellularis. Клеточные суспензии настоящего изобретения уникальны и противоречат этой теории. При использовании клеток McCoys или IEC-18, наряду со средой, предпочтительно добавить желатин, агарозу, коллаген, акриламидные или кремний-содержащие гранулы, такие как пористые микроносители Cultisphere-G, производимые фирмой ХайКлон Лэборэтрис (Логан, Юта). Однако клетки Нер-2 и другие в соответствии со способом культивирования данного изобретения не нуждаются в микроносителях. Это обеспечивает особенно благоприятный и экономичный путь для крупномасштабного культивирования.

В случае культуры клеток Нер-2 для целей ее поддержания предпочтительно 25-50% культуры удаляется с недельными интервалами и заменяется свежей средой. В случае клеточных культур с микроносителями или бусами предпочтительно 25-50% культуры удаляется 1-2 раза в неделю и заменяется свежими микроносителями или бусами и свежей средой. В целях масштабирования к культуре могут быть добавлены дополнительные 25-50% среды или среды с микроносителями.

В зависимости от скорости, с которой культуральные клетки становятся инфицированными, пассаж в свежие клетки обычно проводят в интервале между примерно каждой 2 и примерно каждой 5 неделями. Полагая, что культуральные клетки за 2-3 недели становятся инфицированными, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно проводить пассаж примерно между каждыми 3-4 неделями.

Настоящее изобретение обеспечивает также вакцины и способы получения вакцин против L.intracellularis. В соответствии с особо предпочтительным вариантом осуществления изобретения после поддержания инфицированных клеток в суспензии в течение продолжительного времени (например, 6-8 месяцев), по меньшей мере, часть культивированных бактерий L.intracellularis собирают и проверяют на возможную аттенуацию. Такой мониторинг предпочтительно выполняется с помощью животного-хозяина или моделей животных-мишеней для того, чтобы отобрать аттенуированный штамм. Такие аттенуированные штаммы используются в вакцинах в соответствии со способами, приведенными здесь. Аттенуированные вакцины L.intracellularis в соответствии с настоящим изобретением проявили эффективность против инфекции, вызванной L.intracellularis, у разнообразных животных и, как ожидается, будут так же активны и у человека.

Настоящее изобретение дает возможность культуре быстро развиваться (100-1000-кратное увеличение выходов) и снижает затраты. В итоге обильные запасы бактерий L.intracellularis, произведенные в соответствии с методом культивирования этого изобретения, легко аттенуируются в целях производства вакцины. Аттенуация в монослойных культурах затруднена из-за низкого выхода бактерий, полученных с использованием обычных приемов культивирования монослоев. В противоположность этому способ культивирования L.intracellularis настоящего изобретения значительно легче, быстрее и увеличивает количество бактерий, необходимых для этой цели. Чем больше клеток и происходящих клеточных делений, тем выше уровень наблюдающихся мутаций, которые имеют преимущественное значение в создании вакцины. Культивирование в суспензиях в соответствии с этим изобретением повышает экспрессию важных иммуногенов, контролируемых экологически регулируемыми генами и продуктами их экспрессии.

Образующиеся аттенуированные штаммы могут культивироваться в монослойных тканевых культурах, как описано ниже в примере 1, но предпочтительно культивируются в суспензионных культурах в соответствии со способом этого изобретения. Другие способы аттенуации могут включать химическую аттенуацию с использованием, например, N-метилнитрозогуанидина и других соединений, известных специалистам. Независимо от того, используются ли множественные пассажи или химические способы, продуцируются аттенуированные бактерии L.intracellularis и отбираются для получения вакцины.

В соответствии с одним из вариантов получения вакцины по этому изобретению антиген собирают центрифугированием или микрофильтрацией, как описано выше. Затем антиген стандартизуют на определенном уровне, основанном на оптимальном иммунном ответе животного-хозяина, определяемом титрованием дозы у видов животного-хозяина. Бактерии могут быть инактивированы продолжительной экспозицией, например, в течение одной недели, с кислородом окружающей среды или применением 0.3% формалина или других инактивирующих агентов с целью получения убитой вакцины. Затем антиген включается в соответствующий адъювант, такой как гидроксид алюминия или минеральное масло, для усиления иммунного ответа. После этого антиген используют для вакцинации хозяина посредством внутримышечной или подкожной инъекции, в случае свиней в возрасте около 3-4 недель, при необходимости с усиливающей иммунизирующей дозой.

Альтернативно, в соответствии с особо предпочтительным вариантом получения вакцины по этому изобретению, бактерии с использованием ранее описанных методов культивирования пассировали по сериям с целью индукции и отбора аттенуированной, авирулентной живой культуры. Культуру тестировали на признаки аттенуации на животном-хозяине (предпочтительно после роста суспензионной культуры в течение, по крайней мере, 6 и до 8 месяцев или более). Культуру собирали, как описано ранее, и разбавляли. Например, свиней вакцинировали, вводя перорально от 1×10⁵ до 1×10⁶ бактерий. Примерно через двадцать восемь дней после вакцинации свиней инокулировали, вводя перорально по 1×10⁷ бактерий из вирулентной культуры L.intracellularis с меньшим числом пассажей (время жизни около 30-45 дней). Инфицированных животных вскрывали через 21 день после введения и исследовали тонкий кишечник на большие поражения, а также на микроскопические поражения. Должен быть проведен также анализ с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и флуоресцирующих антител (ФА). Анализом методами ПЦР и ФА примерно у 80% контрольных животных обнаружены большие или микроскопические поражения и положительная проба на присутствие L.intracellularis в клетках слизистой оболочки кишечника. У вакцинированных животных при гистологическом анализе будет нормальная слизистая оболочка и отрицательный анализ методом ПЦР.

Обычно аттенуированный иммуногенный штамм L.intracellularis получают после продолжительного культивирования в течение, по меньшей мере, примерно 150 и 250 суток, в ходе которых культуру пассируют, по меньшей мере, от примерно 7 до примерно 12 раз. Другие аттенуированные культуры могут быть продуцированы путем изменения этих параметров до таких пределов, которые используются в приведенных здесь способах мониторинга и селекции.

После этого получают вакцину, включающую иммунологически эффективное количество аттенуированных бактерий L.intracellularis в фармацевтически приемлемом носителе. Соединенные вместе иммуноген и носитель могут быть в виде водного раствора, эмульсии или суспензии. Иммунологически эффективное количество определяется способами, известными специалистам, без чрезмерного экспериментирования с учетом содержащихся здесь доктрин. В общем, при использовании очищенных бактерий количество иммуногена будет находиться в интервале 50-500 микрограмм, предпочтительно в интервале 10⁷-10⁹ ТКИД₅₀.

Вакцины в соответствии с этим изобретением обычно вводят чувствительным животным, предпочтительно свиньям, в одной дозе или более. Живую или убитую вакцину можно вводить 1 или 2 раза с двухнедельными интервалами. Для аттенуированной, живой вакцины предпочтительной является одна доза. Предпочтительными путями введения живых, аттенуированных штаммов являются пероральный или интраназальный, но используется также внутримышечная или подкожная инъекция. Внутримышечная и подкожная инъекция являются предпочтительными путями введения убитой вакцины.

Эффективный диагноз ПЭС был также затруднен из-за времени, которое требовалось для того, чтобы культивировать причинные бактерии. Итогом настоящего изобретения является то, что теперь стало возможным создать диагностические средства, способствующие быстрому и точному определению наличия L.intracellularis в биологических образцах, взятых у свиней и других животных, чувствительных к ПЭС.

Бактерии L.intracellularis, выросшие в соответствии со способом настоящего изобретения, или компоненты, полученные из таких бактерий, могут использоваться в качестве антигена в иммуноферментном анализе (ELISA-тест) или в другом иммунотесте, таком как анализ с использованием иммунофлуоресцирующего антитела (ИФА), с целью определения антител к L.intracellularis в сыворотке и других жидкостях организма животных, подозреваемых в инфицировании бактериями. В настоящее время предпочтительным иммуноанализом является ИФА, как описано в примере ниже. Альтернативно, бактерии, выросшие в соответствии с данным изобретением, могут использоваться в анализе методом Вестерн-блоттинга.

Предпочтительный протокол ELISA-теста в соответствии с этим вариантом осуществления изобретения следующий:

1. Добавить 0.1 мл/ячейку антигена, разведенного покрывающим буфером. Инкубировать в течение 18 часов при 4°С.

2. Промыть 3 раза ЗФР (забуференным фосфатом физиологическим раствором).

3. Добавить 25 мл блокирующего буфера в каждую ячейку планшета. Инкубировать от 1 часа до 2 часов при 37°С.

4. Промыть 3 раза водным буфером.

5. Развести сыворотку в блокирующем буфере и добавить 0.1 мл в первые ячейки планшета. Сделать серийные разведения 1:2 по ширине планшета. Инкубировать в течение 1 часа при 37°С.

6. Промыть 3-5 раз водным буфером.

7. Развести конъюгат в блокирующем буфере, добавить по 0.1 мл в ячейки планшета и инкубировать 1 час при 37°С.

8. Промыть 3-5 раз водным буфером.

9. Добавить субстрат.

10. Измерить поглощение света на спектрофотометре.

11. Ячейки, в которые не был добавлен антиген, использовать как слепой опыт.

12. В каждом опыте должна быть использована свиная сыворотка в качестве положительного и отрицательного контроля.

Предпочтительный протокол Вестерн-блоттинга следующий:

1. Подвергнуть антиген электрофорезу в полиакриламидном геле в 12% додецилсульфате натрия (ДСН-ПАГЭ) и перенести на нитроцеллюлозную мембрану.

2. Поместить мембрану в блокирующий буфер на 2 часа.

3. Удалить блокирующий буфер и промыть ЗФР в течение 1 минуты.

4. Развести сыворотку в блокирующем буфере и добавить к мембране. Инкубировать в течение 2 часов при комнатной температуре.

5. Промыть 3 раза водным буфером (5 минут на каждую промывку).

6. Развести конъюгат в блокирующем буфере и добавить к мембране. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.

7. Промыть 3 раза водным буфером.

8. Добавлять субстрат в течение 10 минут или до тех пор, пока не появится сильная полоса.

9. Промыть ЗФР.

10. Сушить на воздухе и хранить в темноте.

Далее настоящее изобретение описывается следующими примерами, которые представлены только в иллюстративных целях и не должны интерпретироваться как ограничивающие.

Пример 1

Выделение L.intracellularis из кишечника американских свиней со свиной пролиферативной энтеропатией

Материалы и методы:

Отбор образцов инокулята:

Образец №24912 был получен от стада на ферме в Айове, где у пятнадцати из 300 пятимесячных откормленных свиней наблюдался устойчивый кровавый стул несмотря на лечение пенициллином. При вскрытии свиней кишечник (подвздошная кишка) имел(а) утолщенную слизистую оболочку. Гистопатологические исследования с серебряным окрашиванием демонстрировали наличие изогнутых внутриклеточных палочковых бактерий и криптовую энтероцитную гиперплазию, подтверждающую диагноз ПЭС. Образец №72994 был получен от полуторагодовалой второго помета свиноматки SPF с фермы из Миннесоты. Поголовье стада составило примерно 70-80 свиноматок, лечение антибиотиком не проводилось. После вскрытия слизистая оболочка подвздошной кишки была утолщенной с признаками геморрагии. Окрашивание слизистой оболочки по Гиминезу демонстрировало много изогнутых палочковых бактерий. Образец №101494 был получен от 12-недельной взрослой свиньи на ферме в Индиане с 600 свиноматок различной упитанности (от морщинистой до откормленной). Свинью лечили тиланом, вводимым при появлении признаков геморрагической диареи, но животное погибло вскоре после обработки.

Приготовление полученного от свиньи бактериального инокулята:

Кишечные образцы выдерживали при -70°С. Кишечники вскрывали и промывали ЗФР. Образец слизистой оболочки в количестве 1 г соскребали в раствор натрий-калийглутамата (НКГ) и гомогенизировали в течение 30 секунд с 4.0 мл 1% трипсина (ДжРХ Биосайенсис, Ленекса, Канзас) в НКГ. Суспензии инкубировали в течение 35 минут при 37°С. Добавляли 10 мл смеси НКГ-10% эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) (ДжРХ Биосайенсис, Ленекса, Канзас) и образцы измельчали в течение 1 минуты в измельчителе тканей. Добавляли 10 мл смеси НКГ-10% ЭТС, фильтровали через бумажный фильтр (Ватман 113в, фирма Ватман Лэбсэйлс, Хиллсборо, Орегон) и последовательно через мембранные фильтры 5.0, 1.0 и 0.65 микрон. Фильтраты разделяли на аликвоты по 1.0 мл и замораживали при -70°С. Мазок из слизистой оболочки наносили на предметное стекло для окрашивания по Гименезу. Отдельные мазки фильтратов красили ИФА с использованием специфично