Изоцитратдегидрогеназа, ее ген и их применение в лечении ожирения, гиперлипидемии и жировой инфильтрации печени при биосинтезе липидов

Изоцитратдегидрогеназа, ее ген и их применение в лечении ожирения, гиперлипидемии и жировой инфильтрации печени при биосинтезе липидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к изоцитратдегидрогеназе, которая катализирует продуцирование НАДФН, необходимого для биосинтеза липидов, включая жирные кислоты, сквален и холестерин, и к ее применению в лечении болезней обмена веществ, включая ожирение, гиперлипидемию и жировую инфильтрацию печени. Также, настоящее изобретение относится к гену изоцитратдегидрогеназы, слитым генным конструкциям, содержащим этот ген, клеткам-трансфектантам, несущим эти гены в своем геноме, и к трансгенным животным, способным к непрерывной экспрессии изоцитратдегидрогеназы на протяжении всей их жизни.

Предшествующий уровень техники

Принимая участие в цикле ТКК (трикарбоновых кислот), изоцитратдегидрогеназа катализирует окислительное декарбоксилирование лимонной кислоты в α-кетоглутарат с сопутствующим продуцированием НАДН или НАДФН.

У высших животных изоферменты изоцитратдегидрогеназы можно разделить на три класса в соответствии с их кофакторами и локализацией в клетке: митохондриальная НАД⁺-зависимая изоцитратдегидрогеназа (далее называемая «IDH»), митохондриальная НАДФ⁺-зависимая изоцитратдегидрогеназа (далее называемая «IDPm») и цитоплазматическая НАДФ⁺-зависимая изоцитратдегидрогеназа (далее называемая «IDPc»). Предполагают, что из этих изоцитратных изоферментов IDH играет основную роль в окислительном декарбоксилировании изоцитрата в цикле трикарбоновых кислот (ТКК) с сопутствующим продуцированием α-кетоглутарата и НАДН. НАДН используется для генерации энергии посредством системы переноса электронов, а α-кетоглутарат представляет собой метаболит, используемый в синтезе аминокислот, таких как глутаминовая кислота, глутамин, аргинин и пролин, а также других биологических продуктов. Активность IDH регулируется как контрольная точка цикла ТКК. Следовательно, IDH является ключевым ферментом для регуляции не только цикла ТКК, но также энергетического метаболизма, биосинтеза белка и метаболизма азота, поскольку метаболиты цикла ТКК принимают участие в этих процессах метаболизма.

IDH находится в исследовании с момента ее выделения из дрожжей и свиней. Дрожжевая IDH представляет собой аллостерически регулируемый фермент, который существует в виде октамера, состоящего из двух неидентичных субъединиц IDH1 и IDH2, имеющих высокую гомологию друг с другом. IDH1 играет роль в регуляции ферментативной активности, тогда как IDH2 ответственна за каталитическую активность (Keys, D.А. & McAlister-Henn, L., J.Bacteriol., 172, 4280-4287, 1990). Разбитая на три субъединицы (α, β и γ субъединицы), свиная IDH также существует в виде октамера (2 (α 2β γ)) в активной форме.

Хотя обнаружено, что IDPm и IDPc структурно состоят из двух частей, однако их функции не известны. Хотя оба фермента имеют молекулярную массу примерно 45 кДа при высокой гомологии, они были идентифицированы как разные независимые белки, что проанализировали с помощью экспериментов с иммунологическими реакциями, включающими использование поликлональных антител (Plaut, G.W.E. et al., Biochem. Biophys. Acta, 760, 300-308, 1983; Fantania, H.R. et al., FEBS, 322, 245-248, 1993). В частности, IDPm и IDPc высокотканеспецифичны. В тканях сердечной мышцы, например, более 90% суммарной НАДФ⁺-зависимой изоцитратдегидрогеназы находится в митохондриях, а оставшиеся 10% обнаружены в цитоплазме. Напротив, сообщают, что 3% суммарной НАДФ⁺-зависимой изоцитратдегидрогеназы тканей печени находится в митохондриях, тогда как оставшиеся 97% находятся в цитоплазме (Plaut, G.W.E., Current Topics in Cell Regulation, 2, 1-27, 1983).

Как упомянуто выше, изоферменты изоцитратдегидрогеназы охарактеризованы в отношении их некоторых структурных характеристик, но не в отношении функций. В частности, исследования точных механизмов IDPm и IDPc не обнаружены до публикации недавних сообщений, в которых только сделано предположение, что IDPm катализирует обратную реакцию цикла ТКК по превращению α-кетоглутарата через изоцитрат в цитрат, который связан с трикарбоксилатпереносящей системой для доставки ацетил-КоА, предшественника для биосинтеза жирных кислот и холестерина, с сопутствующим превращением цитрата в оксалоацетат с повышением уровней фосфоенолпирувата в цитоплазме, стимулируя таким образом гликонеогенез (Des Rosiers, С. et al., J. Biol. Chem., 269, 27179-27182, 1994; Fernandez, С.A. et al., J. Biol. Chem., 270, 10037-10042, 1995).

Важность IDPm в гликонеогенезе предполагается вследствие катализа ею обратной реакции цикла ТКК. Напротив, ни одно из сообщений об IDPc не касается ее метаболических функций. Известно, что IDPc экспрессируется в больших количествах в яичнике и молочной железе. Из ферментов, продуцирующих НАДФН, существующих в печени крыс, количественно проанализировали, что IDPc продуцирует НАДФН в количествах, больших, чем это делают важные ферменты пентозофосфатного пути, то есть глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа - для превращения глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконо-δ-лактон и НАДФН, 6-фосфоглюконатдегидрогеназа - для превращения 6-фосфоглюконата в рибулозо-5-фосфат и НАДФН и цитоплазматическая малатдегидрогеназа - для превращения малата в пируват и НАДФН, в 16, 8 и 18 раз соответственно (Veech, R.L. Et al., Biochem. J., 115, 609-619, 1969).

В цитоплазме различные ферменты, вовлеченные в пути метаболизма жирных кислот, холестерина и гормонов, требуют большого количества НАДФН для своей каталитической активности. Поэтому считают, что ферменты, продуцирующие НАДФ, такие как глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и малатдегидрогеназа, играют важную роль в поставке НАДФН в цитоплазму. Однако в свете способности IDPc продуцировать цитоплазматический НАДФН, ожидается, что она в большей степени ответственна за регуляцию поставки НАДФН. В конечном счете, предполагают, что IDPc играет критическую роль в биосинтезе жирных кислот и холестерина. Среди синтаз жирных кислот, вовлеченных в биосинтез жирных кислот, β-кетоацил-[ацил-переносящий белок]-редуктазе и еноил-АПБ-редуктазе для катализа необходим НАДФН в качестве кофактора. В биосинтезе холестерина большое количество НАДФН необходимо для реакций, катализируемых гидроксиметил-глютарил-КоА-редуктазой и скваленсинтетазой, и для конечной 19-стадийной реакции получения холестерина из ланостерина. Соответственно, регуляция активности IDPc, функции которой состоят в поставке большей части НАДФН, необходимого в клетке, очень важна для регуляции биосинтеза жирных кислот и их производных, липидов, сквалена, а также холестерина и его производных.

У высших животных отложение липидов происходит в следующем порядке. Когда имеется избыток источников энергии, дифференциация жировых клеток ускоряется, приводя в результате к увеличению числа и размера белых жировых тканей с сопутствующим отложением липидов. В свою очередь, белая жировая ткань дает возможность активной экспрессии гена ob, что приводит к повышению уровня лептина в организме. В ответ на это изменяется гормональное действие головного мозга в направлении снижения аппетита. В то же время избыточные калории потребляются для поддержания температуры тела при использовании белков-разобщителей (UCP, uncoupler proteins). В белой жировой ткани активируется экспрессия генов, которые кодируют основные факторы транскрипции для пролиферации жировых клеток, такие как активируемый пролифератором пероксисом рецептор γ (peroxysome proliferator-activated receptor γ, PPARγ), C/EBPα и ADD1/SREBP1. Таким образом, происходит стимуляция дифференциации жировых клеток и отложения липидов, и избыток энергии организма запасается в форме липидов, так что энергия организма сбалансирована (Hu, Е. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 9856-9860, 1995; Keller, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 20, 9856-9860, 1993; Freytag S.О. et al., Genes Dev., 8, 1654-1663, 1994; Tontonoz, P. et al., Mol. Cell. Bid., 13, 4753-4759, 1993; Spiegelman, В.М., Cell, 87, 377-389, 1996). Примеры лигандов, необходимых для активации PPARγ, основного фактора транскрипции для дифференциации жировых клеток, включают полиненасыщенные жирные кислоты, такие как линолевая кислота, докозагексановая кислота (DHA) и арахидоновая кислота (Krey, G. et al., Mol. Endocrinol., 11, 779-791, 1997; Yu et al., J. Biol. Chem., 270, 23975-23983, 1995). Также известно, что простагландин J2 служит в качестве лиганда этого основного фактора транскрипции (Forman В.М. et al., Cell, 83, 803-812, 1995; Kliewer S. A. et al., Cell, 83, 813-819, 1995).

На основании данного обзора можно сделать вывод о высокой вероятности того, что IDPc может быть непосредственно вовлечен в регуляцию биосинтеза различных жирных кислот, холестерина и гормонов благодаря его способности продуцировать НАДФН. Можно также предполагать, что IDPc играет ключевую роль в ожирении и жировой инфильтрации печени, стимулируя продуцирование активирующих лигандов для PPARγ, таких как полиненасыщенные жирные кислоты и арахидоновая кислота, для запуска каскада экспрессии различных генов, связанных с дифференциацией жировых клеток. Кроме того, необходимость большого количества НАДФН для биосинтеза холестерина предлагает возможность того, что искусственная регуляция внутриклеточных уровней IDPc и продукта его реакции НАДФН может дать средство регуляции биосинтеза холестерина.

Краткое изложение сущности изобретения

Ведущее к настоящему изобретению интенсивное и тщательное исследование механизма биосинтеза липидов путем молекулярно-биологических и биохимических экспериментов с использованием трансфицированных клеток животных и трансгенных мышей, осуществленное авторами настоящего изобретения, привело в результате к открытию того, что внутриклеточные уровни IDPc и продукта реакции с его участием НАДФН оказывают бесспорное влияние не только на скорость дифференциации жировых клеток и отложение липидов в жировых клетках, но и на биосинтез липидов и холестерина.

Следовательно, в задачу настоящего изобретения входит предложение фермента изоцитратдегидрогеназы для продуцирования НАДФН и ее гена.

В задачу настоящего изобретения также входит предложение слитой генной конструкции, которая содержит ген, кодирующий изоцитратдегидрогеназу, клетки-трансфектанта, которая несет этот ген в своем геноме, и трансгенного животного, которое может экспрессировать этот ген непрерывно на протяжении всей своей жизни.

В задачу настоящего изобретения также входит предложение применения изоцитратдегидрогеназы и ее гена в лечении и профилактике ожирения, гиперлипидемии и жировой инфильтрации печени или в биосинтезе липидов.

Краткое описание графических материалов

На фиг.1 представлены схематические диаграммы, показывающие структуры базового вектора LNCX (вверху), рекомбинантного вектора, в который встроен ген IDPc в смысловой ориентации для повышения экспрессии гена IDPc в жировых клетках NIH3T3 F442A (посередине), и рекомбинантного вектора, в который ген IDPc встроен в антисмысловой ориентации для снижения экспрессии гена IDPc в жировых клетках NIH3T3 F442A (внизу).

На фиг.2а представлены оптические фотографии, показывающие окрашенные Oil-Red-О жировые клетки, дифференцировавшие из нормальных NIH3T3 F442A (слева), клетки-трансфектанты FS1 с повышенной экспрессией гена IDPc (в центре) и клетки-трансфектанты FAS1 со сниженной экспрессией гена IDPc (справа) на чашках (верхняя панель) и частично при 200-кратном увеличении (нижняя панель).

На фиг.2б представлены оптические фотографии, показывающие отложение липидов в жировых клетках в зависимости от дозы НАДФН.

Фиг.3 представляет собой схему, иллюстрирующую конструирование рекомбинантного вектора экспрессии для использования при создании трансгенного животного, в которого встроена кДНК IDPc в прямом направлении от промотора гена РЕРСК (фосфоенолпируваткарбоксикиназы) крысиного происхождения.

На фиг.4 представлены фотографии, показывающие сравнение размера тела и отложения в виде жирового тела в придатке яичка между потомством F₁ от трансгенных мышей по настоящему изобретению и нормальными мышами.

На фиг.5 представлены авторадиографии, показывающие повышение уровня экспрессии генов, показательных для ожирения, в жировой ткани трансгенных мышей по настоящему изобретению по сравнению с нормальными мышами.

Фиг.6а представляет собой гистограмму сравнения массы тела трансгенных мышей F₁ с массой тела нормальных мышей.

Фиг.6б представляет собой гистограмму сравнения массы печени трансгенных мышей F₁ с массой печени нормальных мышей.

Фиг.6в представляет собой гистограмму сравнения активности IDPc и уровня IDPc в крови у трансгенных мышей F₁ с этими же параметрами у нормальных мышей.

Фиг.6г представляет собой гистограмму сравнения [НАДФН]/[НАДФН+НАДФ⁺] у трансгенных мышей F₁ с этими же параметрами у нормальных мышей.

Фиг.6д представляет собой гистограмму сравнения массы жирового тела придатка яичка у трансгенных мышей F₁ с этим же параметром у нормальных мышей.

Фиг.6е представляет собой гистограмму сравнения уровней триглицеридов и холестерина в крови у трансгенных мышей F₁ с этими же уровнями у нормальных мышей.

Фиг.6ж представляет собой гистограмму сравнения уровней триглицеридов и холестерина в печени у трансгенных мышей F₁ с этими же параметрами у нормальных мышей.

Фиг.6з представляет собой гистограмму сравнения уровней лептина в крови у трансгенных мышей F₁ с этими же параметрами у нормальных мышей.

На фиг.7а представлены фотографии, показывающие ткани печени трансгенных мышей по настоящему изобретению и контрольных мышей.

На фиг.7б представлены фотографии, показывающие жировую клетку трансгенных мышей по настоящему изобретению и контрольных мышей.

Фиг.8а представляет собой график, иллюстрирующий ингибиторную активность щавелево-яблочной кислоты в отношении активности изоцитратдегидрогеназы.

Фиг.8б представляет собой график, иллюстрирующий ингибиторную активность метилизоцитрата в отношении активности изоцитратдегидрогеназы.

На фиг.9 представлены оптические фотографии, показывающие окрашенные Oil-Red-О жировые клетки, дифференцировавшие из клеток NIH3T3 F442A, обработанных ингибиторами изоцитратдегидрогеназы (слева), обработанные щавелево-яблочной кислотой (в центре) и метилизоцитратом (справа) при 100-кратном увеличении (верхний ряд) и 200-кратном увеличении (нижний ряд).

Фиг.10а представляет собой гистограмму, иллюстрирующую сравнение масс печени и жирового тела придатка яичка у крыс, которым вводили ингибитор изоцитратдегидрогеназы по настоящему изобретению, с этими параметрами у крыс, которым не вводили ингибиторы.

Фиг.10б представляет собой гистограмму, иллюстрирующую сравнение уровней триглицеридов и холестерина в крови у крыс, которым вводили ингибитор изоцитратдегидрогеназы по настоящему изобретению, с таковыми параметрами у крыс, которым не вводили ингибитор.

Фиг.10в представляет собой гистограмму, иллюстрирующую сравнение уровня ЛПВП (липопротеинов высокой плотности) в крови у крыс, которым вводили ингибитор изоцитратдегидрогеназы по настоящему изобретению, с таковыми параметрами у крыс, которым не вводили ингибитор.

Подробное описание изобретения

В одном аспекте изобретение относится к ферменту изоцитратдегидрогеназе, который катализирует продуцирование НАДФН, необходимого для биосинтеза жирных кислот и холестерина и для отложения липидов, а также к гену, кодирующему изоцитратдегидрогеназу.

Полезной для настоящего изобретения является IDPc, выделенная из мышей. Ген IDPc мышиного происхождения по настоящему изобретению, соответствующий последовательности №3 в перечне последовательностей, имеет открытую рамку считывания (ОРС) размером 1245 п.н., с 3'-нетранслируемым районом (НТР), в котором имеется последовательность оснований ААТААА, предполагаемый поли-А-сигнал. Белок IDPc, кодируемый геном IDPc, состоит из 414 аминокислот, последовательность №4 в перечне последовательностей, с молекулярной массой 46575 Да. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей IDPc из различных видов показывает, что мышиная IDPc по изобретению имеет гомологию 97,8% с крысиной IDPc, 68,5% с бычьей IDPm и 64,4% с дрожжевой IDPc. В частности, аминокислотная последовательность 412-414 мышиной IDPc идентична последовательности-мишени пероксисомы, о которой известно, что она вовлечена в биосинтез и расщепление жирных кислот и холестерина. Следовательно, это позволяет предположить высокую вероятность того, что IDPc перемещается к пероксисомам и там принимает участие в синтезе жирных кислот и холестерина.

Кроме IDPc, IDPm, ген, имеющий последовательность оснований, схожую с последовательностью оснований гена IDPc, также используется для продуцирования НАДФН, необходимого для биосинтеза жирных кислот и холестерина и для отложения липидов в соответствии с настоящим изобретением.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к слитой генной конструкции, содержащей ген, к новому клеточному штамму, в котором закреплен этот ген, и к трансгенному животному, которое экспрессирует этот ген непрерывно на протяжении всей своей жизни.

С этой целью, во-первых, интересующий ген встроен в вектор экспрессии млекопитающего таким образом, чтобы этот ген транскрибировался в смысловом направлении или в антисмысловом направлении.

В этом отношении в качестве носителя гена предпочтительно используют ретровирусные векторы экспрессии, причем наиболее предпочтителен ретровирусный вектор pLNCX. pLNCX, который имеет происхождение от MMLV (вирус лейкемии мышей Moloney), имеет промотор CMV (цитомегаловируса) для экспрессии экзогенных генов в клетках млекопитающих и ген неомицина в качестве селективного маркера вместе с последовательностью LTP (длинный концевой повтор, long terminal repeat), представляющей собой фактор идентификации ретровирусных векторов.

Среди слитых генных конструкций, полученных таким образом, те, которые транскрибируются в смысловом направлении с помощью промотора CMV, используют для усиления экспрессии IDPc, тогда как конструкции, которые предназначены для антисмысловой транскрипции, используют для подавления экспрессии. Полученные в результате рекомбинантные векторы вводят в клетки NIH3T3 L1, являющиеся видом предшественников жировых клеток. Среди клеток-трансфектантов, которые идентифицированы как интегрировавшие ген IDPc в свои геномы, клетки, в которых ген IDPc встроен в смысловом направлении, обозначили как FS1 и депонировали в Корейской Коллекции Типовых Культур Корейского Научно-Исследовательского Института Биологических наук и Биотехнологии (KRIBB) под номером КСТС 0861 ВР 6 сентября 2000 г. С другой стороны, клеточные штаммы, в которых ген IDPc встроен в антисмысловом направлении, обозначили как FAS1.

Определили, что по сравнению с мышиными клетками NIH3T3 L1, в которые введен только вектор pLNCX (контроль), ферментативная активность примерно в 2 раза выше в мышиных клетках-трансфектантах NIH3T3 L1, в которых ген IDPc встроен в смысловом направлении (FS1), но примерно в 0,4 раза ниже в мышиных клетках-трансфектантах NIH3T3 L1, в которых ген IDPc встроен в антисмысловом направлении (FAS1).

Действие IDPc на биосинтез жирных кислот можно количественно определить с помощью Oil-Red-O, красителя, специфичного в отношении липидов, который наносят на жировые клетки, которые дифференцировали из клеток-трансфектантов после обработки инсулином. В результате обнаружили, что продуцирование липидов происходит более активно в клетке-трансфектанте FS1 с повышенной экспрессией гена IDPc, чем в контрольной клетке. С другой стороны, обнаружили небольшое по сравнению с контрольными клетками отложение липидов в клетках-трансфектантах FAS1 со сниженной экспрессией гена IDPc (см. фиг.2а). При дифференциации в жировые клетки в присутствии НАДФН, который является продуктом ферментативной реакции с участием IDPc, клетки-трансфектанты, в которые введен только pLNCX, то есть контрольные клетки, показывают более высокие скорости дифференциации и большие внутриклеточные отложения липидов по мере повышения концентрации НАДФН (см. фиг.2б). Эти результаты указывают на то, что IDPc, ее ген или продукт ферментативной реакции с ее участием, НАДФН, играют ключевую роль в определении внутриклеточных липидных отложений.

Далее, чтобы исследовать активность изоцитратдегидрогеназы, слитую генную конструкцию использовали для получения трансгенного животного, в геноме которого закреплен ген IDPc.

1. Получение слитой генной конструкции

Для постоянной экспрессии гена IDPc необходима интеграция этого гена в геном животного. С этой целью, во-первых, необходимо сконструировать рекомбинантный вектор, который может экспрессировать интересующий ген в млекопитающих. В полученной в результате слитой генной конструкции экспрессия интересующего гена регулируется подходящим геном-промотором. Термин «слитая генная конструкция», как его используют здесь, означает функциональную совокупность генов для использования в трансформации определенных организмов, которая содержит по существу по меньшей мере один структурный ген и по меньшей мере один цис-действующий регуляторный элемент для контроля экспрессии этого структурного гена.

Как правило, цис-действующий регуляторный элемент может быть промотором, энхансером, интроном, 5'-НТР (нетранслируемый район) и 3'-НТР. В слитой генной конструкции цис-действующий регуляторный элемент может быть расположен в любом месте на расстоянии 10 т.п.н. или менее от 5'-фланкирующего района, 3'-фланкирующего района, 5'-конца или 3'-конца структурного гена или внутри этого структурного гена (в случае интрона). Кроме структурного гена и цис-действующего регуляторного элемента, слитая генная конструкция дополнительно содержит различные компоненты, включая сигнал полиаденилирования для повышения скоростей транскрипции или трансляции, последовательность связывания рибосом, интрон и т. д. Дополнительно к этому, слитую генную конструкцию можно обеспечить последовательностью оснований для повышения эффективности встраивания интересующего гена в геном или в определенные сайты и маркерным геном для идентификации встраивания.

Промотор для слитой генной конструкции, который следует использовать при получении трансгенного животного, включает промотор CMV или области, регулирующие экспрессию для генов, экспрессирующихся в белых жировых тканях, таких как гены, кодирующие липопротеинлипазу (LPL), адипсин, белок адипоцитов 2 (аР2) и IDPc. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения используют промотор крысиного происхождения для гена цитозольной фосфоенолпируваткарбоксикиназы (РЕРСК), который экспрессируется как в печени, так и в белых жировых тканях.

Более подробно, получение трансгенного животного, у которого происходит постоянная экспрессия IDPc, начинается с крысиного гена цитозольной РЕРСК. Из этого гена получают последовательность 2,2 т.п.н. в обратном направлении от 5'-конца, содержащую промотор. В прямом направлении от этой последовательности встраивают кДНК мышиной IDPc в смысловой ориентации, чтобы получить слитую генную конструкцию, которую обозначили как pPEPCKIDPc. Существует два вида генов РЕРСК: один кодирует цитозольный фермент, а другой кодирует митохондриальный фермент. В настоящем изобретении использовали последовательность, находящуюся в обратном направлении от 5-конца гена, кодирующего цитозольный РЕРСК (далее называемый «РЕРСК-С»). В печени, кишечнике и почках ткани, где ген РЕРСК-С экспрессируется под контролем этого промотора, определяют в зависимости от регуляторных районов, имеющихся в последовательности, находящейся в обратном направлении от 5'-конца. Последовательность 2,2 т.п.н. в обратном направлении от 5'-конца гена РЕРСК-С, используемая в настоящем изобретении, содержит генную последовательность около 987 нуклеотидов (nt), которая известна как регуляторный район, необходимый для эффективной экспрессии в белой жировой ткани (Hanson, R.W. Annu. Tev. Biochem., 66, 581-611, 1997).

Для получения трансгенных животных полезны мыши, но и любое животное, если его можно сделать трансгенным, полезно в настоящем изобретении, поскольку IDPc представляет собой фермент, экспрессирующийся у всех высших животных.

2. Получение эмбриона

Одной из наиболее важных стадий в получении трансгенного животного является введение слитой генной конструкции в эмбрион. Это введение осуществляют с помощью микроинъекционной системы. При микроинъекции слитой генной конструкции в эмбрион предпочтительно используют автоматическую микроинъекционную систему, которая способна автоматически регулировать количества ДНК до предела 4 пл, поскольку по доле успешных попыток она превосходит традиционные ручные микроинъекционные системы. Мышиный эмбрион, который содержит слитую генную конструкцию IDPc, депонирован в Корейской Коллекции Типовых Культур Корейского Научно-исследовательского института Биологических наук и Биотехнологии (KRIBB) под номером КСТС 0874 ВР 4 ноября 2000 г.

3. Получение трансгенного животного

Далее эмбрион, содержащий слитую генную конструкцию, имплантируют суррогатной матери для получения трансгенного животного. По изобретению имплантацию эмбриона суррогатной матери для удобства проводили на одноклеточной стадии эмбриона, а не на двухклеточной стадии. Немедленно после микроинъекции слитой генной конструкции эмбрион на одноклеточной стадии имплантируют в маточную трубу суррогатной матери, чтобы сократить различные процессы, необходимые для культивирования эмбриона до двухклеточной стадии. Для имплантации в маточную трубу на двухклеточной стадии, например, необходимо культивировать эмбрион в течение одних дополнительных суток в инкубаторе. Чтобы имплантировать эмбрион на двухклеточной стадии в воронку маточной трубы этот эмбрион необходимо вводить глубоко в маточную трубу либо необходимо прокалывать маточную трубу с помощью иглы. Однако имплантацию эмбриона на одноклеточной стадии суррогатной матери можно проводить в условиях, подобных обычным условиям для мышиных эмбрионов, хотя местом имплантации является воронка маточной трубы.

Используя полученное таким образом трансгенное животное, исследовали активность IDPc in vivo в отношении следующих показателей:

1. Увеличение жирового тела придатка яичка

Через 23 недели после рождения гетерозиготные трансгенные мыши F₁ выросли больше, чем контрольные мыши. При анатомировании определили, что у гетерозиготных трансгенных мышей F₁ значительно увеличен размер жирового тела придатка яичка, причем масса тела была в 14 раз выше, чем у контрольных мышей. Кроме того, при разделке на волокна у трансгенных мышей на спинах наблюдали кожные тучные клетки большего размера и в большем количестве по сравнению с контрольными мышами. При полном удалении кожи живота у трансгенных мышей наблюдали значительное увеличение жирового тела придатка яичка (см. фиг.4).

2. Скорость экспрессии гена, показательного для ожирения

Проводили исследование, оказывает ли экспрессия гена IDPc влияние на экспрессию генов, показательных для ожирения. В жировом теле придатка яичка мышей, трансгенных по гену IDPc, обнаруживали экспрессию введенного рекомбинантного гена IDPc параллельно с экспрессией их эндогенного гена IDPc, что демонстрировало, что суммарная экспрессия IDPc повышена. Кроме того, обнаружили повышение экспрессии генов, показательных для ожирения, таких как гены, кодирующие белок адипоцитов 2 (аР2), адипсин, липопротеинлипазу (LPL), лептин, фактор некроза опухоли α (TNF-α) и активируемый пролифератором пероксисом рецептор γ (PPARγ), обо всех из которых известно, что они проявляют повышенную экспрессию, способствуя дифференциации тучных клеток (Hwang, С.S. et al., Ann. Rev. Cell Dev. Biol., 13, 231-259, 1997; Lemberger, Т. et al., Annu. Rev. Cell Dev. Bid., 12, 225-362, 1996; Spiegelman, В.М. et al., Cell, 87, 377-389, 1996).

В свете недавнего сообщения (Spiegelman, В.М. et al., Cell, 87, 377-389, 1996), показавшего, что PPARγ служит в качестве основного фактора транскрипции как при дифференциации тучных клеток, так и при биосинтезе липидов, повышение экспрессии генов, показательных для ожирения, таких как гены, кодирующие аР2, адипсин, LPL, лептин и/или TNF-α, у мышей, трансгенных по IDPc, является результатом повышения экспрессии гена PPARγ. Следовательно, можно сделать вывод, что повышение активности IDPc, связанное с активной экспрессией гена IDPc, и сопутствующее повышение уровня НАДФН, вызывает сильное повышение экспрессии гена PPARγ, который необходим как для дифференциации жировых клеток, так и для биосинтеза липидов (см. фиг.5). В свою очередь, с учетом сообщения (Kirn, J.В. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 4333-4337, 1998), в котором раскрыто, что повышение уровня лиганда, необходимого для активации PPARγ, стимулирует экспрессию самого гена PPARγ, эти результаты приводят к выводу, что повышение активности IDPc и уровня НАДФН, который является продуктом этого фермента, сначала стимулирует продуцирование полиненасыщенных жирных кислот, которые служат в качестве лигандов, способных индуцировать активацию PPARγ, и затем, в ответ на это, индуцирует экспрессию самого гена PPARγ, таким образом повышая уровень экспрессии генов, показательных для дифференциации, таких как гены, кодирующие ар2, адипсин, LPL и лептин, которые вовлечены в дифференциацию различных жировых клеток и, в конечном счете, вызывают ожирение и жировую инфильтрацию печени.

3. Идентификация отложения липидов в организме

Обнаружили, что трансгенные мыши проявляют активность IDPc в 2,7 и 1,4 раза выше соответственно в печени и в жировом теле придатка яичка по сравнению с активностью IDPc в этих органах у контрольных мышей (см. фиг.6в). Таким образом, отношение НАДФН к суммарному пулу НАДФ ([НАДФН]/[НАДФ⁺]+[НАДФН]) повышается при повышении ферментативной активности IDPc (см. фиг.6г). Масса трансгенных мышей была увеличена на 35% или более по сравнению с массой нормальных мышей (см. фиг.6а), при этом более значительно было увеличено жировое тело придатка яичка у трансгенных мышей по сравнению с контрольными мышами (см. фиг.6д). Изменений в массе печени, тем не менее, не обнаружили (см. фиг.6б).

Кроме того, измерили, что уровни триглицеридов и суммарного холестерина в крови трансгенных мышей были в 1,8 и 2,4 раза выше, чем эти показатели у контрольных мышей (см. фиг.6е). Как и в крови, уровни как триглицеридов, так и холестерина в печени у трансгенных мышей были повышены (см. фиг.6ж). Уровень лептина, белка, продуцируемого главным образом тучными клетками, в крови определили как в два раза более высокий у трансгенных мышей, чем у контрольных мышей (см. фиг.6з).

Кроме того, наблюдали, что трансгенные мыши имеют печень, в которой отложилось большее количество жиров по сравнению с контрольными мышами. Другое значительное увеличение у трансгенных мышей по сравнению с контрольными обнаружили в размере жировых клеток в жировом теле придатка яичка (см. фиг.7а и 7б).

Как объясняется выше, прирост массы трансгенных мышей, которые проявляют более активную экспрессию гена IDPc, объясняется повышением количества жира в организме, и различные показательные для ожирения гены более активно экспрессируются в жировых тканях трансгенных мышей, чем в таковых у контрольных мышей. Например, наблюдалось значительное повышение уровня PPARγ, фактора транскрипции, активирующего транскрипцию генов, которые кодируют ферменты, ответственные за биосинтез липидов. Следовательно, повышение экспрессии гена IDPc сначала приводит к продуцированию больших количеств НАДФН, который необходим для биосинтеза жирных кислот, и, таким образом, дает возможность этому избытку липидных производных индуцировать активацию и экспрессию гена PPARγ, который, в свою очередь, активирует экспрессию генов, показательных для ожирения, и, в конце концов, вызывает ожирение у трансгенных по IDPc мышей. Между тем, повышение экспрессии гена и активности IDPc, а также уровня НАДФН в клетках увеличивает активность ферментов, которые вовлечены в биосинтез холестерина, а также ферментов, активирующих биосинтез липопротеинов через повышение уровней липидов, с получением больших количеств соединений холестерина, в которых холестерин связан с липопротеинами.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к способу отбора веществ, ингибирующих ферментативную активность и экспрессию гена изоцитратдегидрогеназы, и, таким образом, эффективных для лечения болезней обмена веществ, таких как ожирение, гиперлипидемия и жировая инфильтрация печени.

На основании ферментативных функций, раскрытых выше, в настоящем изобретении предложено лечение болезней обмена веществ, вызванных повышением уровней жира in vivo, таких как ожирение, гиперлипидемия и жировая инфильтрация печени, при котором используют тот факт, что повышение ферментативной активности и экспрессии гена изоцитратдегидрогеназы способствует биосинтезу НАДФН, активирующего в свою очередь PPARγ и повышающего in vivo уровни жирных кислот, сквалена и холестерина.

В этой связи весьма полезна спектрофотометрия. Более подробно, сначала спектрофотометр устанавливают на нулевую оптическую плотность при 340 нм, используя смесь реакционного буфера десятикратной концентрации и трижды дистиллированной воды. После этого прозрачную кювету, содержащую 10х буфер, тестируемый образец и трижды дистиллированную воду, устанавливают в спектрофотометр, добавляют в эту кювету изоцитратдегидрогеназу и проводят измерение изменения оптической плотности при 340 нм во времени.

Поскольку оптическая плотность быстрее снижается в кювете, содержащей более высокую концентрацию образца, ингибирующего активность фермента, анализ спектрофотометрических данных позволяет производить отбор ингибиторов изоцитратдегидрогеназы.

Пять образцов, то есть никотиновую кислоту, никотинамид, бупропион, метилизолимонную кислоту и щавелево-яблочную кислоту, тестировали на ингибиторную активность в отношении изоцитратдегидрогеназы. В первых двух образцах не обнаружили ингибиторной активности, тогда как бупропион проявлял небольшой ингибиторный эффект. Напротив, установили, что метилизолимонная кислота и щавелево-яблочная кислота обладают явной ингибиторной активностью в отношении активности изоцитратдегидрогеназы.

В следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению НАДФН в стимуляции биосинтеза липидов, холестерина и сквалена и активации PPARγ, учитывающему то первое открытие согласно настоящему изобретению, что искусственное повышение уровня НАДФН в клетках вызывает значительное ожирение и гиперлипидемию и повышает уровень триглицеридов в клетках.

ПРИМЕРЫ

Лучшего понимания настоящего изобретения можно достичь в свете следующих примеров, которые приведены для иллюстрации, но не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1: Выделение и секвенирование гена IDPc

1-1. Выделение кДНК мышиной IDPc

Зонд для идентификации кДНК IDPc мыши получили, используя кДНК IDPc крысы, о которой недавно сообщали (Jennings et al., J. Biol. Chem., 169, 21328-23134, 1994). Смысловой праймер, последовательность №1 в перечне последовательностей, синтезировали на основе 532-550 нуклеотидов гена IDPc крысы, а антисмысловой праймер, последовательность №2 в перечне последовательностей, - на основании нуклеотидов 1263-1245. Отдельно мРНК, выделенную из печени крысы, превращали в кДНК с помощью обратной транскриптазы. Используя праймеры, ПЦР начинали с предварительной денатурации при 94°С в течение 4 мин и проводили 25 циклов денатурации при 94°С по 1 мин, отжига при 50°С в течение 1 мин и удлинения при 72°С в течение 2 мин, за которым следовало удлинение при 72°С в течение дополнительных 10 мин, причем в качестве матрицы использовали 100 нг библиотеки кДНК. В результате амплифицировали последовательность ДНК 0,8 т.п.н. Этот продукт ПЦР клонировали в pCR II (Invitrogen Co.). Вставки клонов секвенировали для идентификации гена IDPc крысы.

Молекулярное клонирование кДНК IDPc мыши начинали с гибридизации в бляшках библиотеки кДНК мышиных клеток NIH3T3 (Stratagene) с геном IDPc крысы, меченым [α-³²P]dCTP-, в качестве зонда. Все процессы гибридизации и отмывки проводили при 65°С. Для первичного скрининга фаг библиотеки кДНК при 5×10⁴ БОЕ (бляшкообразующих единицах) смешивали с 3×10⁸ клеток Е.coli XL1-blue при 37°С в течение 15 мин. После того, как эту смесь фага и хозяина хорошо перемешали с 7 мл мягкой агарозной среды (0,7% агароза, 1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl), ее наливали в чашку на 150 мм с агарозой TYM-Ap (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, 1,5% агар, 10 мМ MgSO₄, ампициллин 50 мкг/мл), давали отвердеть и инкубировали при 37°С в течение 12 часов. После образования зон фаговых бляшек чашку хранили при 4°С в течен