Способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода pseudomonas

Способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода pseudomonas

Реферат

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и пищевой промышленности.

Известен способ получения диагностикума для определения антигенов вируса гепатита В, согласно которому латекс сополимера стирола и метакрилат цинка сенсибилизируют антителами в 0,1 М глициновом буфере, рН которого 7,0, а затем осуществляют инкубацию при 37°С в течение 2-8 ч (Чайка Н.А., Горбачев Е.Н. Применение реакции агглютинации сенсибилизированного латекса для диагностики вирусных инфекций. Вопросы вирусологии, 1985, №5, с.516-523).

Данный способ позволяет достаточно быстро получить диагностикум, выявляющий вирус гепатита В при концентрации 1 мкг/мл. К недостаткам диагностикума относятся: невысокая чувствительность, специфичность - 68,02±0,88 и длительное время получения результата - 20 мин.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерии рода Pseudomonas с использованием антительного диагностикума (US 5316911 A1, 31.05.1994).

Технической задачей изобретения является сокращение времени получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Pseudomonas при высоких значениях чувствительности, специфичности и сокращения времени получения результата при его применении.

Техническая задача изобретения решается при получении диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Pseudomonas, причем вначале получают латекс типа ядро-оболочка. Например, реактор продувают 30 мин азотом, загружают: 10% стирола, 0,1% персульфата калия, 89,9% воды, термостатируют, перемешивая при 70°С 7 ч до полной конверсии мономера. В полученный латекс вводят 0,2% стирола, 0,1 метакрилата цинка и 0,05% персульфата калия. Латекс перемешивают до растворения всех компонентов и затем термостатируют при 70°С 2 ч.

Частицы полученного латекса состоят из двух частей: внутреннее ядро - полистирол, наружная оболочка (0,2-20% от массы всей частицы) - статический сополимер стирола и метакрилата цинка в массовом соотношении 1:0,8-1:0,4. Массовое соотношение между звеньями метакрилата цинка и стирола, входящего как в ядро, так и в оболочку, составляет 1-12:100.

Далее проводят сенсибилизацию латекса моноклональными антителами фракции IgG2a и IgG2b фирм «Biogenesis» UK и «Chemicon» USA в 0,01 М глициновом буфере, рН которого 7,2-8,8, до полного связывания, при отсутствии предварительной выдержки латекса в буфере, с последующей инкубацией сначала при 37-37,5°С в течение 60-90 мин, а затем при 2-8°С в течение 1-22 ч.

Сокращение времени получения диагностикума достигнуто за счет выбора параметров сенсибилизации и инкубации без предварительной выдержки латекса в буфере.

На получение диагностикума с высокой чувствительностью и специфичностью влияют: рН буферного раствора, в котором осуществляют сенсибилизацию, начальная температура инкубации, начальное время инкубации, температура завершения инкубации, время завершения инкубации. В таблице 1 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от величины рН глицинового буфера при начальной температуре инкубации 37,2±0,2°С в течение 75±5 мин, а затем при 5±0,4°С в течение 22+0,5 ч.

Таблица 1
№	Количество исследований	рН глицинового буфера	Чувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
1	100	7,0	125000
2	100	7,2	50000
3	100	8,0	10000
4	100	8,8	40000
5	100	9,0	80000

В таблице 2 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от начальной температуры инкубации при рН буфера, равном 8,0, начальном времени инкубации 75±5 мин, а затем при 5±0,4°С в течение 22±0,5 ч.

Таблица 2
№	Количество исследований	Начальная температура инкубации	Чувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
1	91	36,5°С	30000
2	91	37°С	10000
3	91	37,5°С	10000
4	91	38°С	20000

В таблице 3 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от начального времени инкубации при рН буфера, равном 8,0, начальной температуре инкубации, равной 37,2±0,2°С, и температуре завершения инкубации, равной 5±0,4°С в течение 22±0,5 ч.

Таблица 3
№	Количество исследований	Начальное время инкубации (мин)	Чувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
1	91	50	50000
2	91	60	20000
3	91	75	10000
4	91	90	10000
5	91	100	40000

В таблице 4 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от температуры завершения инкубации при рН буфера, равном 8,0, начальной температуре инкубации, равной 37,2±0,2°С в течение 75±5 мин, и времени завершения инкубации 22±0,5 ч.

Таблица 4
№	Количество исследований	Температура завершения инкубации	Чувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
1	91	1°С	30000
2	91	2°С	10000
3	91	5°С	5000
4	91	8°С	5000
5	91	9°С	20000

Специфичность и чувствительность полученных диагностикумов для определения эндотоксина бактерий рода Pseudomonas проверяли в реакции агглютинации латекса с сыворотками крови доноров, не содержащими эндотоксин, больных сердечно-сосудистыми заболеваниями, не подтвержденными бактериологическими посевами, и больных гнойно-воспалительными заболеваниями. Учет результата реакции проводился по степени активированных частиц.

1. Максимальная степень - крупные хлопья на прозрачном фоне - 4-я степень активированных частиц (4СА) (положительный результат).

2. Средняя степень - хлопья или крупные зерна на слегка мутном фоне - 3-я степень активированных частиц (3СА) (положительный результат).

3. Минимальная степень - много зерен на мутном фоне - 2-я степень активированных частиц (2СА) (положительный результат).

4. Контроль - абсолютно мутный фон или единичные зерна - 1-я степень активированных частиц (1СА) (отрицательный результат).

В таблице 5 приведены результаты исследований.

Специфичность полученного диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Pseudomonas составляет 98±0,2 при чувствительности до 10 пг/мл, при этом время получения результата исследования не более 10 мин. Время получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Pseudomonas сокращено с нескольких месяцев до нескольких часов.

Способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Pseudomonas с использованием антительного диагностикума на латексном носителе, отличающийся тем, что в качестве носителя используют латекс типа ядро-оболочка, где ядро - полистирольный латекс, а оболочка - латекс сополимера стирола и метакрилата цинка при массовом соотношении звеньев 1:0,8-1:0,4, который сенсибилизируют моноклональными антителами в 0,01 М глициновом буфере при рН 7,2-8,8 до полного связывания, без предварительной выдержки латекса, а затем инкубируют сначала при 37-37,5°С в течение 60-90 мин, а затем при 2-8°С в течение 22 ч.