Способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода enterobacter

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и пищевой промышленности. Предложен способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Enterobacter. Способ включает получение латекса типа ядро-оболочка, где ядро - полистирольный латекс, а оболочка - латекс сополимера стирола и метакрилата цинка при массовом соотношении звеньев 1:0,8-1:0,4, сенсибилизацию латекса моноклональными антителами фракции IgG2a и IgG2b в 0,01 М глициновом буфере при рН 7,2-8,8 без предварительной выдержки и инкубацию сначала при 36,5-37°С в течение 100-120 мин, а затем при 6-8°С в течение 20 ч. Предложенный способ позволяет сократить время получения диагностикума, при этом полученный диагностикум обладает специфичностью 98±1,0 при чувствительности до 10 пг/мл, а время получения результата исследования составляет не более 10 мин. 5 табл.

Реферат

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и пищевой промышленности.

Известен способ получения диагностикума для определения антигенов вируса гепатита В, согласно которому латекс сополимера стирола и метакрилат цинка сенсибилизируют антителами в 0,1 М глициновом буфере, рН которого 7,0, а затем осуществляют инкубацию при 37°С в течение 2-8 ч. (Чайка Н.А., Горбачев Е.Н. Применение реакции агглютинации сенсибилизированного латекса для диагностики вирусных инфекций. Вопросы вирусологии, 1985, №5, с.516-523).

Данный способ позволяет достаточно быстро получить диагностикум, выявляющий вирус гепатита В при концентрации 1 мг/мл. К недостаткам диагностикума относятся: невысокая чувствительность, специфичность - 68,02±0,88 и длительное время получения результата - 20 мин.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерии рода Enterobacter с использованием антительного диагностикума (US 5316911 A1, 31.05.1994).

Технической задачей изобретения является сокращение времени получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Enterobacter, при высоких значениях чувствительности, специфичности и сокращения времени получения результата при его применении.

Техническая задача изобретения решается при получении диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Enterobacter, причем вначале получают латекс типа ядро-оболочка. Например, реактор продувают 30 мин азотом, загружают: 10% стирола, 0,1% персульфата калия, 89,9% воды, термостатируют, перемешивая при 70°С 7 ч до полной конверсии мономера. В полученный латекс вводят 0,2% стирола, 0,1% метакрилата цинка и 0,05% персульфата калия. Латекс перемешивают до растворения всех компонентов и затем термостатируют при 70°С 2 ч.

Частицы полученного латекса состоят из двух частей: внутреннее ядро-полистирол, наружная оболочка (0,2-20% от массы всей частицы) - статический сополимер стирола и метакрилата цинка в массовом соотношении 1:0,8-1:0,4. Массовое соотношение между звеньями метакрилата цинка и стирола, входящего как в ядро, так и в оболочку, составляет 1-12:100.

Далее проводят сенсибилизацию латекса моноклональными антителами фракции IgG2а и IgG2b фирм "Biogenesis" UK и "Chemicon" USA и др. в 0,01 М глициновом буфере, рН которого 7,2-8,8 до полного связывания, при отсутствии предварительной выдержки латекса в буфере, с последующей инкубацией сначала при 36,5-37°С в течение 100-120 мин, а затем при 6-8°С в течение 20 ч.

Сокращение времени получения диагностикума достигнуто за счет выбора параметров сенсибилизации и инкубации без предварительной выдержки латекса в буфере.

На получение диагностикума с высокой чувствительностью и специфичностью влияют: рН буферного раствора, в котором осуществляют сенсибилизацию, начальная температура инкубации, начальное время инкубации, температура завершения инкубации, время завершения инкубации. В таблице 1 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от величины рН глицинового буфера при начальной температуре инкубации 36,7±0,2°С в течение 110±5 мин, а затем при 7±0,4°С в течение 20±0,5 ч.

Таблица 1
Количество исследованийрН глицинового буфераЧувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
11007,0125000
21007,260000
31008,010000
41008,840000
51009,080000

В таблице 2 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от начальной температуры инкубации при рН буфера, равном 8,0, начальном времении инкубации 110±5 мин, а затем при 7±0,4°С в течение 20±0,5 ч.

Таблица 2
Количество исследованийНачальная температура инкубацииЧувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
18736°С20000
28736,5°С10000
38737°С10000
48737,5°С20000

В таблице 3 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от начального времени инкубации при рН буфера, равном 8,0, начальной температуре инкубации, равной 36,7±0,2°С, и температуре завершения инкубации, равной 7±0,4°С, в течение 20±0,5 ч.

Таблица 3
Количество исследованийНачальная время инкубации (мин)Чувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
1879030000
28710010000
3871105000
4871205000
58713020000

В таблице 4 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от температуры завершения инкубации при рН буфера, равном 8,0, начальной температуре инкубации, равной 36,7±0,2°С, в течение 110±5 мин и времени завершения инкубации 20±0,5 ч.

Таблица 4
Количество исследованийТемпература завершения инкубацииЧувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
1875°С30000
2876°С10000
3877°С5000
4878°С5000
5879°С20000

Специфичность и чувствительность полученных диагностикумов для определения эндотоксина бактерий рода Enterobacter проверяли в реакции агглютинации латекса с сыворотками крови доноров, не содержащими эндотоксин, больных сердечно-сосудистыми заболеваниями, не подтвержденными бактериологическими посевами, и больных гнойно-воспалительными заболеваниями. Учет результата реакции проводился по степени активированных частиц:

1. Максимальная степень-крупные хлопья на прозрачном фоне - 4-я степень активированных частиц (4СА) (положительный результат).

2. Средняя степень - хлопья или крупные зерна на слегка мутном фоне - 3-я степень активированных частиц (3СА) (положительный результат).

3. Минимальная степень - много зерен на мутном фоне - 2-я степень активированных частиц (2СА) (положительный результат).

4. Контроль - абсолютно мутный фон или единичные зерна - 1-я степень активированных частиц (1СА) (отрицательный результат).

В таблице 5 приведены результаты исследований.

Таблица 5
Исследуемые сывороткиКоличество исследованийРезультат определения эндотоксина бактерий рода Enterobacter
Entero. spp.Entero. aero.Entero. cloa.Entero. alpha.
пол.отр.пол.отр.пол.отр.пол.отр.
1Донорские30-30-30-30-30
2Больных сердечно-сосудистыми заболеваниями24420222222-24
3Больных гнойно-воспалительными заболеваниями18612117216-18

Специфичность полученного диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Enterobacter составляет 98±1,0 при чувствительности до 10 пг/мл, при этом время получения результата исследования не более 10 мин. Время получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Enterobacter сокращено с нескольких месяцев до нескольких часов.

Способ получения диагностикума для определения эндотоксина бактерий рода Enterobacter с использованием антительного диагностикума на латексном носителе, отличающийся тем, что в качестве носителя используют латекс типа ядро-оболочка, где ядро - полистирольный латекс, а оболочка - латекс сополимера стирола и метакрилата цинка при массовом соотношении звеньев 1:0,8-1:0,4, который сенсибилизируют моноклональными антителами в 0,01 М глициновом буфере при рН 7,2-8,8 до полного связывания, без предварительной выдержки латекса, а затем инкубируют сначала при 36,5-37°С в течение 100-120 мин, а затем при 6-8°С в течение 20 ч.