Способ получения диагностикума для выявления общего эндотоксина грамотрицательных бактерий

Способ получения диагностикума для выявления общего эндотоксина грамотрицательных бактерий

Реферат

Изобретение относится к медицине, ветеринарии и пищевой промышленности.

Известен способ получения диагностикума для определения антигенов вируса гепатита В, согласно которому латекс сополимера стирола и метакрилат цинка сенсибилизируют антителами в 0,1М глициновом буфере, рН которого 7,0, а затем осуществляют инкубацию при 37°С в течение 2-8 ч (Чайка Н.А., Горбачев Е.Н. Применение реакции агглютинации сенсибилизированного латекса для диагностики вирусных инфекций. Вопросы вирусологии, 1985, №5, с.516-523).

Данный способ позволяет достаточно быстро получить диагностикум, выявляющий вирус гепатита В при концентрации 1 мкг/мл. К недостаткам диагностикума относятся: невысокая чувствительность, специфичность - 68,02±0,88 и длительное время получения результата - 20 мин.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ получения диагностикума для определения эндотоксинов грамотрицательных бактерий с использованием антительного диагностикума (US 5316911 A1, 31.05.1994).

Технической задачей изобретения является сокращение времени получения диагностикума для определения эндотоксина при высоких значениях чувствительности, специфичности и сокращения времени получения результата при его применении.

Техническая задача изобретения решается при получении диагностикума для определения эндотоксина, причем вначале получают латекс типа ядро-оболочка. Например, реактор продувают 30 мин азотом, загружают: 10% стирола, 0,1% персульфата калия, 89,9% воды, термостатируют, перемешивая при 70°С 7 ч до полной конверсии мономера. В полученный латекс вводят 0,2% стирола, 0,1% метакрилата цинка и 0,05% персульфата калия. Латекс перемешивают до растворения всех компонентов и затем термостатируют при 70°С 2 ч.

Частицы полученного латекса состоят из двух частей: внутреннее ядро - полистирол, наружная оболочка (0,2-20% от массы всей частицы) - статический сополимер стирола и метакрилата цинка в массовом соотношении 1:0,8-1:0,4. Массовое соотношение между звеньями метакрилата цинка и стирола, входящего как в ядро, так и в оболочку, составляет 1-12:100.

Далее проводят сенсибилизацию латекса моноклональными антителами фракции IgG2а и IgG2b фирм «Biogenesis» UK и «Chemicon», USA, и др. в 0,01 М глициновом буфере, рН которого 8,2-8,6, до полного связывания, при отсутствии предварительной выдержки латекса в буфере, с последующей инкубацией сначала при 36-38°С в течение 120-180 мин, а затем при 2-8°С в течение 1-20 ч.

Сокращение времени получения диагностикума достигнуто за счет выбора параметров сенсибилизации и инкубации без предварительной выдержки латекса в буфере.

На получение диагностикума с высокой чувствительностью и специфичностью влияют: рН буферного раствора, в котором осуществляют сенсибилизацию, начальная температура инкубации, начальное время инкубации, температура завершения инкубации, время завершения инкубации. В таблице 1 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от величины рН глицинового буфера при начальной температуре инкубации 37°С в течение 150 мин, а затем 5°С в течение 10 ч.

Таблица 1
№	Количество исследований	рН глицинового буфера	Чувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
1	105	8,0	10000
2	105	8,2	5000
3	105	8,4	2500
4	105	8,6	4000
5	105	8,8	10000

В таблице 2 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от начальной температуры инкубации при рН буфера, равном 8,4, начальном времени инкубации, равном 150 мин, а затем 5°С в течение 10 ч.

Таблица 2
№	Количество исследований	Начальная температура инкубации	Чувствительность диагностикумов (микробные тела / мл )
1	105	35,5°С	75000
2	105	36°С	50000
3	105	37°С	5000
4	105	38°С	1000
5	105	38,5°С	50000

В таблице 3 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от начального времени инкубации при рН буфера, равном 8,4, начальной температуре инкубации, равной 37°С, и температуре завершения инкубации, равной 5°С, в течение 10 ч.

Таблица 3
№	Количество исследований	Начальное время инкубации (мин)	Чувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
1	105	90	5000
2	105	120	1000
3	105	150	1000
4	105	180	1000
5	105	210	25000

В таблице 4 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от температуры завершения инкубации при рН буфера, равном 8,4, начальной температуре инкубации, равной 37°С, начальном времени инкубации, равном 150 мин, и времени завершения инкубации, равном 10 ч.

Таблица 4
№	Количество исследований	Температура завершения инкубации	Чувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
1	105	1°C	75000
2	105	2°С	50000
3	105	5°С	10000
4	105	8°С	1000
5	105	10°С	50000

В таблице 5 приведены данные зависимости чувствительности диагностикумов от времени завершения инкубации при рН буфера, равном 8,4, начальной температуре инкубации, равной 37°С, начальном времени инкубации, равном 150 мин, и температуре завершения инкубации, равной 5°С.

Таблица 5
№	Количество исследований	Время завершения инкубации (ч)	Чувствительность диагностикумов (микробные тела/мл)
1	105	1	25000
2	105	5	10000
3	105	10	5000
4	105	15	10000
5	105	20	20000

Специфичность и чувствительность полученных диагностикумов для определения эндотоксина грамотрицательных бактерий проверяли в реакции агглютинации латекса с сыворотками крови доноров, больных сердечно-сосудистыми заболеваниями, больных гнойно-воспалительными заболеваниями. Учет результата реакции проводился по степени активированных частиц:

1. Максимальная степень - крупные хлопья на прозрачном фоне - 4 степень активированных частиц (4СА) (положительный результат).

2. Средняя степень - хлопья или крупные зерна на слегка мутном фоне - 3 степень активированных частиц (3СА) (положительный результат).

3. Минимальная степень - много зерен на мутном фоне - 2 степень активированных частиц (2СА) (положительный результат),

4. Контроль - абсолютно мутный фон или единичные зерна - 1 степень активированных частиц (1СА) (отрицательный результат).

В таблице 6 приведены результаты исследований.

Таблица 6
Исследуемая сыворотка	Количество исследований	Результат
Доноры (не содержащие эндотоксина)	115	100% - отр.
Больные сердечно-сосудистыми заболеваниями (подтвержденные бактериологическими посевами)	140	99% - полож., 1% - отр.
Больные гнойно-воспалительными заболеваниями	27	98% - полож., 2%-отр.

Специфичность полученного диагностикума для выявления эндотоксина составляет 99±0,89 при чувствительности 10 пг/мл, при этом время получения результата исследования не более 10 мин. Время получения диагностикума для определения эндотоксина сокращено с нескольких месяцев до нескольких часов.

Способ получения диагностикума для определения эндотоксина грамотрицательных бактерий с использованием антительного диагностикума на латексном носителе, отличающийся тем, что в качестве носителя используют латекс типа ядро-оболочка, где ядро - полистирольный латекс, а оболочка - латекс сополимера стирола и метакрилата цинка при массовом соотношении звеньев 1:0,8-1:0,4, который сенсибилизируют моноклональными антителами в 0,01 М глициновом буфере при рН 8,2-8,6 до полного связывания, без предварительной выдержки латекса, а затем инкубируют сначала при 36-38°С в течение 120-180 мин, а затем при 2-8°С в течение 1-20 ч.