Химерный ген, содержащий его рекомбинантный вектор и семенной материал, и способы, предусматривающие использование этого гена

Химерный ген, содержащий его рекомбинантный вектор и семенной материал, и способы, предусматривающие использование этого гена

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к манипулированию ферментативной активностью, ответственной за превращение протопорфириногена IX в протопорфирин IX.

Процессы биосинтеза, приводящие к производству хлорофилла и гема, включают ряд общих стадий. Хлорофилл представляет собой поглощающий свет пигмент, присутствующий во всех зеленых фотосинтезирующих организмах. Гем представляет собой кофактор гемаглобина, цитохромов, Р450-оксигеназ со смешанной функцией, пероксидаз и каталаз (см., например, у Lehninger, Biochemistry, Worth Publishers, New York (1975)) и, следовательно, является необходимым компонентом всех аэробных организмов.

Последней общей стадией биосинтеза хлорофилла и гема является окисление протопорфириногена IX в протопорфирин IX. Протопорфириногеноксидаза (обозначенная в данном описании как "протокс") представляет собой фермент, который катализирует эту последнюю стадию окисления (Matringe и др., Biochem. J. 260: 231 (1989)).

Фермент протокс был очищен полностью или частично из многочисленных организмов, включающих дрожжи Saccharomyces cerevisiae (Labbe-Bois и Labbe, Biosynthesis of Heme and Chlorophyll, E. H. Dailey, ред. McGraw Hill: New York, стр. 235-285 (1990)), этиопласты ячменя (Jacobs и Jacobs, Biochem. J. 244: 219 (1987)) и печень мыши (Dailey и Karr, Biochem. 26: 2697 (1987)). Гены, кодирующие протокс, были выделены из двух прокариот: Escherichia coli (Sasarman и др.. Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)) и Bacillus subtilis (Dailey и др., J.Biol. Chem. 269: 813 (1994)). Эти гены не обладают сходной последовательностью; кодируемые ими протеиновые продукты не имеют каких-либо идентичных аминокислотных последовательностей. Протеин E. coli имеет массу приблизительно 21 кДа и связан с клеточной мембраной. Протеин В. subtilis имеет массу 51 кДА и является растворимым, активным в цитоплазме.

Вероятный механизм действия ингибирующих протокс гербицидов включает накопление в хлоропласте протопорфириногена IX. Это накопление, вероятно, приводит к проникновению протопорфириногена IX в цитозоль, где он окисляется с помощью пероксидаздой активности в протопорфирин IX. При экспозиции светом протопорфирин IX может вызвать образование в цитозоле атомарного кислорода. Этот атомарный кислород в свою очередь может привести к образованию других реактивных видов кислорода, которые могут вызвать переокисление липидов и разрушение мембраны, что приводит к быстрой гибели клетки (Lee и др., Plant Physiol. 102: 881 (1993)).

Не все ферменты протоксы чувствительны к гербицидам, которые ингибируют ферменты протоксы растений. Ферменты протоксы, кодируемые генами, выделенными как из Escherichia coli (Sasarman и др., Can. J. Microbiol. 39: 1155 (1993)), так и из Bacillus subtilis (Dailey и др., J.Biol. Chem. 269: 813 (1994), устойчивы к этим гербицидным ингибиторам. Кроме того, были описаны мутанты одноклеточной водоросли Chlamydomonas reinhardtii, устойчивые к фенилимидному гербициду S-23142 (Kataoka и др., J. Pesticide Sci. 15: 449 (1990); Shibata и др., Research in Photosynthesis, том III, N. Murata, ред. Kluwer: Netherlands, стр. 567-570 (1992)). По крайней мере один из этих мутантов, как полагают, имеет измененную активность протокса, который устойчив не только к гербицидному ингибитору, по которому проходил отбор этого мутанта, но также и к другим классам ингибиторов протокса (Oshio и др., Z. Naturforsch. 48с: 339 (1993); Sato и др., ACS Symposium on Porphyric Pesticides, S. Duke, ред. ACS Press: Washington, D.C. (1994)). Также есть данные о том, что мутантная линия клеток табака обладает устойчивостью к ингибитору S-21432 (Che и др., Z. Naturforsch. 48с: 350 (1993)).

Настоящее изобретение относится к химерному гену, включающему молекулу ДНК, кодирующую фермент протопорфириноген-оксидазу (протокс) из прокариота.

Настоящее изобретение, кроме того, включает рекомбинантные векторы, содержащие химерные гены, которые главным образом содержат промотор, а именно, промотор, активный в растении, функционально связанный с молекулой ДНК, кодирующей фермент протопорфириноген-оксидазу (протокс) из прокариота по изобретению. Химерный ген по изобретению может в дополнение к этому также включать сигнальную последовательность, функционально связанную с молекулой ДНК, причем эта сигнальная последовательность способна направлять протеин, кодируемый молекулой ДНК, в хлоропласт или в митохондрию.

При трансформации этим геном растений получаются семена растений с измененной активностью протокса, которые устойчивы или по крайней мере толерантны к ингибированию концентрациями гербицида, которые в норме ингибируют естественную активность протокса в растении. У этих растений может быть изменена активность протокса за счет сверхэкспрессии фермента протокса дикого типа или экспрессии молекулы ДНК, кодирующей толерантный к гербициду фермент протокс. Этот толерантный к гербициду фермент протокс может представлять собой модифицированную форму фермента протокса, которая в естественных условиях встречается в прокариоте. Растениями могут служить однодольные и двудольные растения, но прежде всего гибридные растения. Предпочтительными являются такие растения, которые могут представлять собой потенциальные мишени для ингибирующих протокс гербицидов, в частности такие важные сельскохозяйственные культуры, как кукуруза и другие зерновые культуры, такие, как пшеница, овес, рожь, сорго, рис, ячмень, просо, густой травяной покров (дерн или газонные травы), кормовые травы и т.п., а также хлопчатник, табак, сахарный тростник, сахарная свекла, масличный рапс и соя.

Кроме того, настоящее изобретение включает семенной материал, включающий материал для размножения растений, обработанный защитным покрытием и прежде всего защитным покрытием, содержащим препарат, выбранный из группы, состоящей из гербицидов, инсектицидов, фунгицидов, бактерицидов, нематоцидов, моллюскицидов или их смесей.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу борьбы с ростом нежелательной растительности, включающему обработку популяции растения с измененной активностью протокса, устойчивой к ингибированию гербицидом в концентрациях, которые обычно ингибируют встречающуюся в естественных условиях активность протокса в этом растении, эффективным количеством ингибирующего протокс гербицида. Растения, подлежащие защите описанным способом, прежде всего представляют собой таковые, которые могут быть потенциальными мишенями для ингибирующих протокс гербицидов, в частности такие важные сельскохозяйственные культуры, как, например, кукуруза и другие зерновые культуры, такие, как пшеница, овес, рожь, сорго, рис, ячмень, просо, густой травяной покров (дерн или газонные травы), кормовые травы и т.п., а также хлопчатник, сахарный тростник, сахарная свекла, масличный рапс и соя. Гербициды, которые относятся к ингибиторам протокса, представляют собой таковые, выбранные из группы, состоящей из арилурацила, дифенилового эфира, оксидиазола, имида, фенилпиразола, производного пиридина, фенопилата и О-фенилпирролидин- и пиперидинкарбаматных аналогов этого фенопилата.

Изобретение дополнительно включает способ получения клетки-хозяева и прежде всего клетки, выбранные из группы, состоящей из клеток растений, бактериальных клеток, дрожжевых клеток и клеток насекомых, стабильно трансформированных рекомбинантной молекулой ДНК, содержащей пригодный промотор, функционирующий в соответствующей клетке-хозяине, функционально связанный со структурным геном, кодирующим немодифицированный или модифицированный фермент протокс, причем клетка-хозяин обладает способностью экспрессировать эту молекулу ДНК. Пригодными организмами-хозяевами, которые могут быть использованы для скрининга библиотек экспрессии кДНК и для которых мутанты с дефицитом активности протокса либо доступны, либо могут быть получены традиционными способами. Такие организмы-хозяева включают, но не ограничены ими, E.coli (Sasarman и др., J. Gen. Microbiol. 113: 297 (1979)), Salmonella typhimurium (Xu и др., J. Bacteriol. 174: 3953 (1992)) и Saccharomyces cerevisiae (Camadro и др., Biochem. Biophys. Res. Comm. 106: 724 (1982)).

В другом варианте последовательности, кодирующие протокс, могут быть выделены в соответствии с хорошо известными способами, основанными на гомологии их последовательности. В этих способах всю или часть известной кодирующей протокс последовательности применяют в качестве зонда, который селективно гибридизируется с другими кодирующими протокс последовательностями, присутствующими в популяции клонированных фрагментов геномной ДНК или фрагментов кДНК (т.е. библиотек геномной или кДНК) из выбранного организма. Такие способы включают скрининг на основе гибридизации посеянных на пластинке библиотек ДНК (либо бляшек, либо колоний; см., например, у Sambrook и др., ред., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) и ПЦР-амплификацию с использованием олигонуклеотидных праймеров, соответствующих доменам последовательности, сохранившимся среди известных аминокислотных последовательностей протокса (см., например, у Innis и др., ред., PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)). Эти способы наиболее пригодны для выделения кодирующих протокс последовательностей из организмов, родственных организму, из которого имеет происхождение последовательность зонда. Последовательности протокса прокариота по настоящему изобретению могут подвергаться манипуляциям в соответствии со стандартными методами генной инженерии для достижения любой поставленной цели. Например, полная последовательность протокса или ее части могут применяться в качестве зондов, способных к специфической гибридизации с последовательностями, кодирующими протокс, и с матричными РНК. Для достижения специфической гибридизации в различных условиях такие зонды включают последовательности, которые являются уникальными среди кодирующих протокс последовательностей, и предпочтительно имеют длину по крайней мере 10 нуклеотидов и наиболее предпочтительно по крайней мере 20 нуклеотидов. Такие зонды могут применяться для амплификации и анализа кодирующих протокс последовательностей из выбранного организма путем хорошо известного процесса цепной полимеразной реакции (ПЦР). Этот метод может быть пригоден для выделения дополнительных кодирующих протокс последовательностей из требуемого организма или в качестве диагностического метода для определения присутствия в организме кодирующих протокс последовательностей и для выявления взаимосвязи измененных кодирующих последовательностей с определенными вредными условиями, такими, как аутосомное доминантное нарушение у имеющих пониженные уровни активности протокса людей, что характеризуется как нейропсихическими симптомами, так и повреждениями кожи (Brenner и Bloomer, New Engl. J. Med. 302: 765 (1980)).

Специфичные для протокса зонды гибридизации также могут быть использованы для картирования положения нативного(ных) гена(ов) протокса в геноме выбранного организма с использованием стандартных методов, основанных на селективной гибридизации зонда с геномными последовательностями протокса. Эти методы включают, но не ограничены ими, идентификацию полиморфизмов ДНК, выявленных или содержащихся внутри последовательности зонда для протокса, и применение таких полиморфизмов для последующего отщепления гена протокса от других маркеров с известным положением на карте в картируемой популяции, полученной в результате самооплодотворения гибрида двух полиморфных родительских линий (см., например, у Helentjaris и др., Plant. Mol. Biol. 5: 109 (1985); Sommer и др., Biotechniques 12: 82 (1992); D'Ovidio и др., Plant. Mol. Biol. 15: 169 (1990)). Хотя можно ожидать, что любая последовательность протокса будет пригодна в качестве зонда для картирования генов протокса, предпочтительными зондами являются такие последовательности протокса из организмов, которые наиболее близкородственны к выбранному организму, и наиболее предпочтительными зондами являются таковые последовательности протокса из выбранного организма. Можно ожидать, что картирование таким образом генов протокса будет наиболее целесообразным для целей селекции растений. Например, на основе знания о положении на генетической карте мутантного гена протокса, который обусловливает устойчивость к гербицидам, могут быть идентифицированы фланкирующие маркеры ДНК из соответствующей генетической карты (см., например, у Helentjaris, Trends Genet. 3: 217 (1987)). При интрогрессии признака устойчивости к гербицидам в новую селектируемую линию эти маркеры могут быть затем применены для мониторинга длины сцепленной с протоксом фланкирующей хромосомной ДНК, еще присутствующей в родительской форме, с которой гибрид скрещивают вновь после каждого круга обратного скрещивания.

Специфичные для протокса зонды гибридизации также могут применяться для количественной оценки уровней мРНК протокса в организме с использованием стандартных методов, таких, как назерн-блоттинг. Этот метод может быть пригоден в качестве способа диагностики для обнаружения измененных уровней экспрессии протокса, что может быть связано с определенными вредными условиями, такими, как аутосомное доминантное нарушение у людей, характеризующееся как нейропсихическими симптомами, так и повреждениями кожи, имеющих пониженные уровни активности протокса (Brenner и Bloomer, New Engl. J. Med. 302: 765 (1980)).

Для рекомбинантного получения фермента в организме хозяина кодирующая протокс последовательность может быть встроена в полигенный экспрессирующий вектор, сконструированный для выбранного хозяина и интродуцированный в хозяина, где его получают рекомбинантным образом. Выбор специфических регуляторных последовательностей, таких, как промотор, сигнальная последовательность, 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности и энхансер, может быть осуществлен специалистом в данной области техники. Полученная молекула, содержащая отдельные элементы, связанные в соответствующей рамке считывания, может быть встроена в вектор, способный к трансформации клетки-хозяина. Пригодные для этой цели векторы экспрессии и способы рекомбинантного получения протеина хорошо известны для организмов-хозяев, таких, как E.coli (см., например, у Studier и Moffatt, J. Mol. Biol. 189: 113 (1986); Brosius, DNA, 8: 759 (989)), дрожжи (см., например, у Schneider и Guarente, Meth. Enzymol. 194: 373 (1991)) и клетки насекомых (см., например, у Luckow и Summers, Bio/Technol. 6: 47 (1988)). Конкретные примеры включают такие плазмиды, как Bluescript (фирма Stratagene, La Jolla, CA), pFLAG (фирма International Biotechnolosies, Inc., New Haven, CT), pTrcHis (фирма Invitrogen, La Jolla, CA) и бакуловирусные векторы экспрессии, например, имеющие происхождение из генома вируса ядерного полиэдроза Autographica californica (AcMNPV). Предпочтительной системой бакуловирус/насекомое являются клетки pVI11392/Sf21 (фирма Invitrogen, La Jolla, CA).

Полученный рекомбинантным путем фермент протокс пригоден для различных целей. Например, он может применяться для обеспечения ферментативной активности протокса in vitro. Он также может применяться в анализе in vitro для скрининга новых соединений с гербицидной активностью, мишень для которых ранее не была выявлена, с целью определения, могут ли они ингибировать протокс. Такой анализ in vitro также может быть применен в качестве более общего скрининга для идентификации химических соединений, ингибирующих активность протокса и, следовательно, являющихся потенциальными гербицидами. В другом варианте полученный рекомбинантным путем фермент протокс может применяться для дальнейшего изучения его связи с известными ингибиторами, чтобы рационально сконструировать новые ингибирующие гербициды, а также толерантные к гербицидам формы фермента.

Обычно ингибирующее действие в отношении протокса определяют путем измерения флуоресценции при длинах волн от приблизительно 622 до 635 нм после возбуждения длинами волн от приблизительно 395 до 410 нм (см., например, у Jacobs и Jacobs, Enzyme 28: 206 (1982); Sherman и др., Plant Physiol. 97: 280 (1991)). Этот анализ основан на том факте, что протопорфирин IX представляет собой флуоресцирующий пигмент, а протопорфириноген IX является нефлуоресцирующим. Экстракты протеина получают из выбранных субклеточных фракций, например, из этиопластов, митохондрий, микросом или плазматических мембран путем дифференциального центрифугирования (см., например, Lee и др., Plant Physiol. 102: 881 (1993); Prado и др.. Plant Physiol. 65: 956 (1979); Jackson и Moore в Plant Organelles, Reid ред., стр. 1-12; Jacobs и Jacobs, Plant Physiol, 101: 1181 (1993)). Протопорфириноген получают путем восстановления протопорфирина амальгамой натрия, как описано у Jacobs и Jacobs (1982). Реакционные смеси обычно состоят из 100 мМ HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота) (рН 7,5), 5 мМ ЭДТК, 2 мМ ДТТ (дитиотреитол), приблизительно 2 М протопорфириногена IX и приблизительно 1 мг/мл экстракта протеина. До начала ферментативной реакции к экстракту фермента добавляют растворы ингибитора в различных концентрациях, например, в 1 мМ, 100 мкМ, 10 мкМ, 1 мкМ, 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 100 пМ. После добавления экстракта протеина в течение нескольких минут регистрируют флуоресценцию и в области линейного изменения вычисляют тангенс угла наклона кривой (скорость реакции). Значение IC₅₀ определяют путем сравнения тангенса угла наклона реакции в условиях ингибирования с таковым в контрольной реакции.

Протокс можно использовать в анализе по выявлению устойчивых к ингибитору мутантов протокса. Типичный анализ включает следующие стадии:

(а) инкубирование первого образца протокса и его субстрата, т.е. протопорфириногена IX, в присутствии второго образца, содержащего ингибитор протокса;

(б) измерение ферментативной активности протокса из стадии (а);

(в) инкубирование первого образца мутированного протокса и его субстрата в присутствии второго образца, содержащего тот же самый ингибитор протокса;

(г) измерение ферментативной активности мутированного протокса из стадии (в); и

(д) сравнение ферментативной активности мутированного протокса с таковой, обеспечиваемой немутированным протоксом.

Реакционная смесь и условия реакции являются теми же, что и для анализа по выявлению ингибиторов протокса (ингибиторный анализ) со следующими модификациями. Во-первых, мутант протокса, полученный аналогично описанному выше, заменяют в одной из реакционных смесей на протокс дикого типа в ингибиторном анализе. Во-вторых, ингибитор протокса дикого типа присутствует в обеих реакционных смесях. В-третьих, мутированную активность (ферментативная активность в присутствии ингибитора и мутированного протокса) и немутированную активность (ферментативная активность в присутствии ингибитора и протокса дикого типа) сравнивают для определения, наблюдается ли существенное увеличение ферментативной активности в мутированной активности по отношению к немутированной активности. Мутированная активность представляет собой любую меру ферментативной активности мутированного фермента протокса в присутствии пригодного субстрата и ингибитора. Немутированная активность представляет собой любую меру ферментативной активности фермента протокса дикого типа в присутствии пригодного субстрата и ингибитора. За достоверное увеличение принимают увеличение ферментативной активности, превышающее предел погрешности техники измерения, предпочтительно приблизительно двукратное увеличение по сравнению с активностью фермента дикого типа в присутствии ингибитора, более предпочтительно приблизительно пятикратное увеличение, наиболее предпочтительно увеличение более чем приблизительно в десять раз.

Гербициды, которые ингибируют протокс, включают многие различные по структуре классы молекул (Duke и др., Weed Sci. 39: 465 (1991); Nandihalli и др., Pesticide Biochem. Physiol. 43: 193 (1992); Matringe и др., FEBS Lett. 245: 35 (1989); Yanase и Andoh, Pesticide Biochem. Physiol. 35: 70 (1989)), включая дифениловые эфиры {например, ацифлуорфен, 5-[2-хлор-4-(трифторметил)фенокси]-2-нитробензойная кислота; ее метиловый эфир; или оксифлуорфен, 2-хлор-1-(3-этокси-4-нитрофенокси)-4-(трифторбензол), оксидиазолы (например, оксидиазон, 3-[2,4-дихлор-5-(1-метилэтокси)фенил]-5-(1,1-диметилэтил)-1,3,4-оксадиазол-2-(3Н)-он), циклические имиды (например, S-23142, N-(4-хлор-2-фтор-5-пропаргилоксифенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид, хлорфталим, N-(4-хлорфенил)-3,4,5,6-тетрагидрофталимид), фенилпиразолы (например, ТНПП-этил, этил-2-[1-(2,3,4-трихлорфенил)-4-нитропиразолил-5-окси]пропионат; М&В 39279), производные пиридина (например, LS 82-556) и фенопилат и его O-фенилпирролидино- и пиперидинкарбаматные аналоги.

Наиболее важные дифениловые эфиры представляют собой таковые общей формулы

где R обозначает -COONa (формула II), -CONHSO₂CH₃ (формула III) или -СООСН₂СООС₂Н₅ (формула IV; см. у Maigrot и др., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 47-51 (1989)).

Дополнительными, представляющими интерес дифениловыми эфирами являются таковые, где R обозначает

(формула Va; см. у Hayashi и др., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 53-58 (1989)).

Дополнительным, представляющим интерес дифениловым эфиром является таковой формулы:

(формула IVb; бифенокс, см. Dest и др., Proc. Northeast Weed Sci. Conf. 27: 31 (1973)).

Также важным является класс гербицидов, известных как амиды, имеющие общую формулу

где Q обозначает

или или или

или или

(см. у Hemper и др., (1995) в "Proceedings of the Eighth International Congress of Pesticide Chemistry", Ragdale и др., ред., Amer. Chem. Soc., Washington, D.C., стр. 42-48 (1994)),

и R₁ обозначает Н, Cl или F, R₂ обозначает Cl и R₃ обозначает необязательно замещенный простой эфир, тиоэфир, сложный эфир, амино- или алкильную группу. В другом варианте R₂ и R₃ вместе могут образовывать 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо. Примерами имидных гербицидов, представляющих особый интерес, являются

(см. у Miura и др., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 35-40 (1993)),

Гербицидная активность вышеуказанных соединений описана в Proceedings of 1991 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (формулы Х и XVI), Proceedings of 1993 Brighton Crop Protection Conference, Weeds (British Crop Protection Council) (формулы XII и XIII), в патенте США 4746352 (формула XI) и в Abstracts of the Weed Science Society of America, том.33, стр. 9 (1993) (формула XIV).

Наиболее предпочтительными имидными гербицидами являются таковые, классифицированные как арилурацилы и имеющие общую формулу

где R обозначает группу (С₂-С₆алкенилокси)карбонил-С₁-С₄алкил, как описано в патенте США 5183492, включенном в настоящее описание в качестве ссылки.

Также важными являются гербициды, имеющие общую формулу:

(формула XVIII; тиадиазимин)

(см. у Weiler и др., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 29-34 (1993));

(формула XIX; карфентразон)

(см. у Van Saun и др., Brighton Crop Protection Conference-Weeds: 19-22 (1993));

N-замещенные пиразолы общей формулы:

(см. публикации международных заявок WO 94/08999,

WO 93/10100 и патент США 5405829, переданный

фирме Schering);

N-фенил пиразолы, такие, как

(формула XXI; нипираклофен)

(см. стр. 621 в "The Pesticide Manual", 9-е изд., ред. C.R. Worthing, British Crop Protection Council, Surrey (1991));

и 3-замещенные-2-арил-4,5,6,7-тетрагидроиндазолы (Lyga и др., Pesticide Sci. 42: 29-36 (1994)).

Уровни гербицида, которые обычно являются достаточными для ингибирования активности протокса, соответствуют нормам расхода, известным в данной области техники и частично зависящим от внешних факторов, таких, как окружающая среда, время и способ обработки. Например, в случае имидных гербицидов, представленных формулами V-IX, ив частности таковых, представленных формулами X-XVIII, интервал норм расхода составляет от 0,0001 до 10 кг/га, предпочтительно от 0,005 до 2 кг/га. Эта норма расхода или концентрация гербицида может различаться в зависимости от требуемого действия и конкретного используемого соединения и может быть определена способами, известными в данной области техники.

Итак, описанные в заявке растения, ткани растения и семена растения являются толерантными к гербицидам, которые ингибируют активность протокса, встречающуюся в этих растениях в естественных условиях, причем толерантность обусловлена измененной ферментативной активностью протокса. Характерные растения включают любые растения, которые обрабатывают этими гербицидами в соответствии с их обычным предназначением. Предпочтительными являются важные сельскохозяйственные культуры, т.е. важные представители покрытосемянных и голосемянных растений, такие, как хлопчатник, соя, рапс, сахарная свекла, кукуруза, рис, пшеница, ячмень, овес, рожь, сорго, просо, густой травяной покров (дерн или газонные травы), кормовые травы, дернообразующие злаки и т.п.

Под "измененной ферментативной активностью протокса" понимают ферментативную активность протокса, отличную от таковой, которая встречается в растении в естественных условиях (т.е. активность протокса, которая встречается в естественных условиях в отсутствие прямого или косвенного воздействия человека на эту активность), устойчивую к гербицидам, которые ингибируют активность, встречающуюся в естественных условиях. Измененная ферментативная активность протокса может быть придана растению по изобретению путем увеличения экспрессии протокса дикого типа, чувствительного к гербицидам, экспрессии в растении измененного, толерантного к гербицидам эукариотического фермента протокса, экспрессии в растении немодифицированной или модифицированной бактериальной формы фермента протокса, которая является устойчивой к гербицидам, или комбинацией этих способов.

Получение измененной активности фермента протокса путем увеличения экспрессии приводит к достижению уровня протокса в клетке растения, по крайней мере достаточного для преодоления ингибирования роста, вызываемого гербицидом. Уровень экспрессируемого протокса обычно по крайней мере в два раза, предпочтительно в пять раз, более предпочтительно по крайней мере в десять раз превышает количество, экспрессируемое в естественных условиях. Увеличенная экспрессия может быть обусловлена множественными копиями гена протокса дикого типа; множественным распространением кодирующей протокс последовательности внутри гена протокса (т.е. амплификацией гена) или мутацией в некодирующей регуляторной последовательности эндогенного гена протокса в клетке растения. Растения, обладающие такой измененной ферментативной активностью, могут быть получены направленной селекцией в растениях. Этот способ известен в данной области техники. См., например, патент США 5162602 на имя Somers и др., патент США 4761373 на имя Anderson и др. и указанные в них ссылки. Эти растения также могут быть получены с помощью методов генной инженерии, известных в данной области техники.

Увеличенная экспрессия чувствительного к гербицидам протокса также может быть получена путем стабильной трансформации клетки растения рекомбинантной или химерной молекулой ДНК, содержащей промотор, способный стимулировать экспрессию связанного структурного гена в клетке растения, сцепленного с гомологичным или гетерологичным структурным геном, кодирующим протокс. Понятие "гомологичность" подразумевает, что ген протокса выделяют из организма, таксономически идентичного клетке растения-мишени. Понятие "гетерологичность" подразумевает, что ген протокса выделяют из организма, таксономически отличного от клетки растения-мишени. Гомологичные гены протокса могут быть получены путем комплементации бактериального или дрожжевого ауксотрофного мутанта библиотекой экспрессии кДНК из растения-мишени. См., например, пример 1 и у Snustad и др., Genetics 120: 1111-1114 (1988) (глутамин-синтаза кукурузы); у Delauney и др., Mol. Genet. 221: 299-305 (1990) (пирролин-5-карбоксилатредуктаза сои); у Frisch и др., Mol. Genet. 228: 287-293 (1991) (дигидродипиколинат-синтаза кукурузы); у Eller и др., Plant Mol. Biol. 18: 557-566 (1992) (3-изопропилмалат-дигидрогеназа хлоропласта рапса); в Ргос. Natl. Acad. Sci, USA 88: 1731-1735 (1991); у Minet и др., Plant J. 2: 417-422 (1992) (дигидрооротат-дегидрогеназа) и ссылки, указанные в этих публикациях. Другие известные способы включают скрининг библиотек геномной или кДНК высших растений, например, в отношении последовательностей, которые перекрестно гибридизируются с зондами специфичных нуклеиновых кислот, или скрининг библиотек экспрессии для получения ферментов протокса, которые вступают в перекрестную реакцию со специфичными зондами-антителами. Предпочтительный способ включает комплементацию ауксотрофного мутанта hemG E. coli библиотекой кДНК кукурузы или Arabidopsis thaliana.

Примеры промоторов, способных функционировать в растениях или в клетках растений, т.е. таковых, способных стимулировать экспрессию связанных структурных генов, таких, как протокса, в растительных клетках, включают промоторы 19S или 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и двойные промоторы CaMV; промоторы нопалин-синтазы; промоторы протеина, связанного с патогенезом (PR); промоторы малой субъединицы рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы (ssuRUBISCO) и т.п. Предпочтительными являются промотор актина риса (McElroy и др., Mol. Gen. Genet. 231: 150 (1991)), промотор убикитина кукурузы (ЕР 0342926; Taylor и др. Plant Cell Rep. 12: 491 (1993)) и промотор Рг-1 из табака, Arabidopsis или кукурузы (см. международную заявку PCT/IB95/00002 на имя Ryals и др., полностью включенную в данное описание в качестве ссылки). Также предпочтительными являются промотор 35S и усиленный или двойной промотор 35S, такой, как описанный у Кау и др., Science 236: 1299-1302 (1987), и двойной промотор 35S, клонированный в pCGN2113, депонированный под номером АТСС 40587, которые описаны в европейской заявке ЕР-А 0392225, соответствующие данные из которой, относящиеся к настоящему изобретению, полностью включены в данное описание в качестве ссылки. Сами промоторы могут быть модифицированы в соответствии с известными в данной области техники методиками таким образом, чтобы манипулировать длиной промотора для повышения экспрессии протокса.

Сигнальные или транзитные пептиды могут быть слиты с последовательностью, кодирующей протокс, в химерных конструкциях ДНК по изобретению, чтобы направить транспорт экспрессируемого фермента протокса в требуемое место действия. Примеры сигнальных пептидов включают таковые, сцепленные в естественных условиях с протеинами, связанными с патогенезом, например, PR-1, PR-2 и т.п. См., например, Раупе и др., Plant Mol. Biol. 11: 89-94 (1988). Примеры транзитных пептидов включают транзитные пептиды хлоропласта, такие, как описанные у von Heijne и др., Plant Mol. Biol. 9: 104-126 (1991); Mazur и др., Plant Physiol. 85: 1110 (1987); Vorst и др., Gene 65: 59 (1988), и транзитные пептиды митохондрий, такие, как описанные у Boutry и др., Nature 328: 340-342 (1987). Предполагают, что транзитные пептиды хлоропласта и митохондрий будут наиболее приемлемы для настоящего изобретения, так как ферментативная активность протокса обычно содержится в митохондриях и хлоропласте. Наиболее предпочтительными для применения являются транзитные пептиды хлоропласта, поскольку существует предположение, что ингибирование ферментативной активности протокса в хлоропластах является первичной основой действия ингибирующих протокс гербицидов (Witkowski и Hallihg, Plant Physiol. 87: 632 (1988); Lehnen и др., Pestic. Biochem. Physiol. 37: 239 (1990); Duke и др., Weed Sci. 39: 465 (1991)). Сюда также включены последовательности, которые приводят к локализации кодируемого протеина в различных клеточных компартментах, таких, как вакуоли. См., например, у Neuhaus и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10362-10366 (1991) и Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 21-53 (1991). Соответствующие данные из этих публикаций, относящиеся к настоящему изобретению, полностью включены в данное описание в качестве ссылки.

Химерная(ые) конструкция(и) ДНК по изобретению может(гут) содержать множественные копии промотора или множественные копии структурных генов протокса. Кроме того, конструкция (и) может(гут) включать кодирующие последовательности для маркеров и кодирующие последовательности для других пептидов, таких, как сигнальные или транзитные пептиды, каждый в соответствующей рамке считывания с другими функциональными элементами в молекуле ДНК. Получение таких конструкций соответствует обычному уровню техники в данной области.

Пригодные маркеры включают пептиды, обусловливающие устойчивость к гербициду, антибиотику или лекарству, такие, как обусловливающие, например, устойчивость к гигромицину, канамицину, G418, гентамицину, линкомицину, метотрексату, глифосфату, фосфинотрицину или т.п. Эти маркеры могут применяться для отделения клеток, трансформированных химерными конструкциями ДНК по изобретению, от нетрансформированных клеток. Другими пригодными маркерами являются пептидные ферменты, которые можно легко обнаружить с помощью реакции визуально, например, с помощью цветной реакции, в их число входят луцифераза, β-глюкуронидаза или β-галактозидаза.

Измененную активность фермента протокса можно также получить путем генерирования или идентификации модифицированных форм выделенной кодирующей протокс последовательности, имеющей по крайней мере одно аминокислотное замещение, дополнение или делецию, которые кодируют измененный фермент протокс, устойчивый к гербициду и ингибирующий неизмененную, встречающуюся в естественных условиях форму (т.е. формы, встречающиеся в естественных условиях, не подвергавшиеся манипуляциям со стороны человека либо непосредственно с помощью методологии рекомбинантной ДНК, либо косвенным путем с помощью избирательной селекции и т.д.). Гены, кодирующие такие ферменты, могут быть получены с помощью различных стратегий, известных в данной области техники. Первая общая стратегия включает технику прямого или непрямого мутагенеза микроорганизмов. Например, пригодный для генетических манипуляций микроорганизм, такой, как Е. coli или S. cerevisiae, может быть подвергнут неспецифическому мутагенезу in vivo с помощью, например, УФ-излучения или этил- или метилметансульфоната. Методы мутагенеза описаны, например, у Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1972); Davis и др.. Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); Sherman и др., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1983); и в патенте США 4975374 (на имя Goodman и др.). Микроорганизм, выбранный для мутагенеза, содержит ген протокса с нормальной чувствительностью к гербицидам и зависит от активности протокса, обусловленной этим геном. Подвергнутые мутагенезу клетки выращивают в присутствии гербицида в концентрациях, которые ингибируют немодифицированный фермент протокс. Колонии подвергнутого мутагенезу микроорганизма, которые в присутствии ингибитора растут лучше, чем не подвергнутый мутагенезу микроорганизм (т.е. проявляющие устойчивость к ингибитору), отбирают для дальнейшего анализа. Гены протокса из этих колоний выделяют либо путем клонирования, либо с помощью амплификации с использованием полимеразной цепной реакции и определяют их последовательности. Последовательности, кодирующие измененный фермент протокс, затем клонируют вновь в микроорганизме для подтверждения их способности обусловливать устойчивость к ингибитору.

Второй метод получения мутантных, несущих устойчивость к гербициду аллелей фермента протокса, включает прямую селекцию в растениях. Например, воздействие ингибитора протокса, такого, как описан выше, на подавление роста растений, таких, как Arabidopsis, соя или кукуруза, может быть выявлено путем помещения семян, стерилизованных с использованием известных в данной области техники методов, на чашки в простую минимальную солевую среду, содержащую возрастающие концентрации ингибитора. Такие концентрации составляют 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30, 110, 300, 1000 и 3000 частей на миллион (част./млн). Самую низкую дозу, при которой можно наблюдать воспроизводимое существенное ингибирование роста, применяют для последующих экспериментов.

Мутагенез растительного материала может быть использован для увеличения частоты, с которой устойчивые аллели встречаются в выбранной популяции. Подвергнутый мутагенезу семенной материал может быть получен из различных источников, включая химический или физический мутагенез семян или химический или физический мутагенез пыльцы (см. Neuffer, в Maize for Biological Research, Sheridan, изд. Univ. Press, Grand Forks, ND., стр. 61-64 (1982)), которую затем применяют для оплодотворения рас