Реагентные системы для детектирования восстановленного кофактора

Реагентные системы для детектирования восстановленного кофактора

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к детектированию анализируемых веществ, в частности к системе реагентов для использования при детектировании анализируемых веществ.

Предшествующий уровень техники

Детектирование анализируемых веществ в физиологических жидкостях, например в крови или в продуктах, полученных из крови, становится все более важным в современном обществе. Часто требуется провести анализы с детектированием анализируемых веществ в клинических лабораторных исследованиях, исследованиях в домашних условиях и т.д., где результаты исследования играют определяющую роль в диагностике и лечении разнообразных болезненных состояний. Представляющие интерес анализируемые вещества включают спирт, формальдегид, глюкозу, глютаминовую кислоту, глицерин, бета-гидроксибутират, L-лактат, лейцин, яблочную кислоту, пировиноградную кислоту, стероиды. Разработаны многочисленные способы и устройства для детектирования анализируемых веществ, предназначенные для использования как в клинических, так и в домашних условиях. В некоторых из способов и устройств, которые разработаны к настоящему воемени, используются системы генерирования сигнала для идентификации представляющего интерес анализируемого вещества в физиологическом образце, таком как кровь.

Одной из систем генерирования сигнала, которая находит применение при детектировании множества различных анализируемых веществ, является система, в которой дегидрогеназа окисляет анализируемое вещество и одновременно восстанавливает кофактор фермента, такой как NAD(P)+. Затем восстановленная форма кофактора, например NAD(P)H, детектируется с помощью последующей реакции с агентом, окисляющим кофактор, например феназин метосульфатом или диафоразой, который переносит электрон к индикатору окисления-восстановления, такому как тетразолийная соль, с получением детектируемого продукта.

Хотя к настоящему времени разработаны разнообразные системы генерирования сигнала для использования при детектировании большого множества различных анализируемых веществ, существует необходимость в дальнейшей разработке таких систем.

Представляющие интерес патенты США включают 4629697; 5126247 и 5902731, а также Raap et al., Histochem. J., 1983.

В патенте США 4629697 раскрыта система для тестирования, имеющая расширенные пределы измерения, и соответствующий способ определения NAD(P)H или подложек, или энзимов, которые взаимодействуют с образованием или расходованием NAD(P)H в жидкостях. Система для тестирования содержит в одно и то же время несколько субстанций, действующих независимо друг от друга в качестве акцепторов электронов по отношению к NAD(P)H и имеющих различные электрохимические потенциалы. Добавление системы для тестирования к раствору пробы приводит к образованию различных конечных продуктов, которые могут быть аналитически дифференцированы и которые могут быть оценены визуально или различными приборами.

В патенте США 5126247 раскрыты не использующие кислород способы, системы и устройства для проведения энзиматической колориметрической оценки и определения биохимических аналитов. В патенте раскрыты две системы, которые позволяют получить менее одного эквивалента красителя на эквивалент подложки, при этом поддерживаются концентрации красителя в пределах, где согласно закону Beer существует линейная зависимость «цвет-концентрация». Одна из систем позволяет получить аналоговый цветовой сигнал из аналогового входного сигнала аналита. Другая система позволяет получить цифровой сигнал из аналогового входного сигнала аналита.

В качестве наиболее близкого аналога заявитель указал патент США 5902731, в котором заявлен реагент для измерения концентрации аналита в гемоглобин содержащей биологической жидкости, такой как кровь. Реагент содержит энзим дегидрогеназы, который имеет специфичность по отношению к аналиту, NAD (никотинамид аденин динуклеотид) или производного NAD, предшественник тетразольного красителя, энзим диафоразы или его аналог, и соль азотистой кислоты. Реагент вызывает образование красителя, что является мерой определения концентрации аналита. Соль азотистой кислоты подавляет помехи при образовании красителя, вызванные гемоглобином (неэнзиматические). Предпочтительно реагент используется для окрашенных полосок для измерения кетоновых тел, таких как бетагидроксибутират.

Краткое изложение сущности изобретения

В основу настоящего изобретения поставлена задача создания системы генерирования сигнала, которая обеспечивает повышенную скорость реакции и более низкую стоимость.

Поставленная задача решена путем создания системы генерирования сигнала, композиции реагентов, тест-полосок и их наборов, а также способа для их использования при детектировании анализируемых веществ в образце.

Система генерирования сигнала характеризуются тем, что содержит по меньшей мере первый и второй агенты для переноса электрона и индикатор окисления-восстановления. В предпочтительном варианте воплощения система содержит белковый и небелковый агенты для переноса электрона, например соединение феназина и диафоразу. Во многих предпочтительных вариантах воплощения системы и наборы дополнительно включают кофактор фермента и фермент, имеющий окислительную активность по отношению к анализируемому веществу, например дегидрогеназу анализируемых веществ. Рассматриваемые системы, композиции реагентов, тест-полоски и наборы используются для детектирования большого количества анализируемых веществ в образце, таком как физиологический образец, например кровь или ее фракция.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется описанием предпочтительных вариантов воплощения со ссылками на чертеж, на котором представлена диаграмма скорости реакции в тест-полоске в зависимости от теоретической ожидаемой скорости реакции для тест-полоски, которая использует как PMS, так и диафоразу, из диаграммы следует, что использование как небелкового, так и белкового агента для переноса электрона, например PMS и диафоразы, обеспечивает неожиданное увеличение скорости реакции согласно изобретению.

Описание предпочтительных вариантов воплощения изобретения

Предложены система генерирования сигнала, композиции реагентов, тест-полоски и их наборы, а также способы для их использования при детектировании анализируемых веществ в образце. Система генерирования сигнала содержит по меньшей мере первый и второй агенты для переноса электрона и индикатор окисления-восстановления. Система включает также белковый и небелковый агенты для переноса электрона, например соединение феназина и диафоразу. Во многих предпочтительных вариантах воплощения система и наборы дополнительно включают кофактор фермента и фермент, имеющий окислительную активность по отношению к анализируемому веществу, например дегидрогеназу анализируемых веществ. Система, композиции реагентов, тест-полоски и наборы находят применение при детектировании большого количества анализируемых веществ в образце, таком как физиологический образец, например кровь или ее фракция.

Система генерирования сигнала, согласно изобретению, предназначена для детектирования наличия восстановленного кофактора фермента в образце. Под системой генерирования сигнала подразумевается совокупность двух или более соединений или молекул, которые при объединении генерируют детектируемый сигнала, указывающий на присутствие и на количество конкретного анализируемого вещества в данном образце. Термин система генерирования сигнала используется в широком смысле для указания как смеси всех реагентов, составляющих систему генерирования сигнала, так и системы, в которой один или несколько реагентов, составляющих ее, являются отделенными от остальных реагентов, например системы, представленной в виде набора.

Существенным признаком системы генерирования сигнала является наличие двух различных агентов для переноса электронов. Агентом для переноса электронов является соединение или молекула, которая может переносить электрон в форме гидридного иона от восстановленного кофактора фермента к индикатору окисления-восстановления. В рассматриваемых системах генерирования сигнала первый из агентов для переноса электрона представляет собой молекулу с низкой молекулярной массой, а второй агент для переноса электрона представляет собой молекулу с высокой молекулярной массой. Низкая молекулярная масса означает молекулярную массу, которая не превосходит приблизительно 2000 дальтон, обычно, приблизительно 1000 дальтон, а во многих случаях, приблизительно 500 дальтон. Высокая молекулярная масса означает молекулярную массу приблизительно 5000 дальтон, а во многих случаях 10000 или 20000 дальтон или выше. Высокая молекулярная масса агента для переноса электронов не превышает приблизительно 100000 дальтон. Агент для переноса электрона с низкой молекулярной массой представляет собой небелковое соединение, в то время как агент для переноса электрона с высокой молекулярной массой представляет собой белковое соединение. Под белковым соединением имеется в виду полипептид или его полимерный миметик.

Интерес представляют разнообразные небелковые агенты для переноса электрона с низкой молекулярной массой, выбранные из группы, состоящей из флавинов, таких как рибофлавин (RBF), аллоксазин (ALL) и люмихром (LC); феназинов, таких как феназин, феназин метосульфат (PMS), феназин этосульфат, метоксифеназин метосульфат и сафранин; метил-1,4-нафтола (менадион), фенотиазинов, таких как РТ и его катионный радикал, РТ+, тионин (ТН), азур А (АА), азур В (АВ), азур С (АС), метиленовый голубой (MB), метиленовый зеленый (MG) и толуидиновый голубой О (TOL); феноксазинов, таких как феноксазин (РОА), основной голубой 3 (ВВ3) и крезиловый ярко-голубой ALD (ВСВА), бензо-α-феназоксоний хлорид (Medola голубой); индофенолов, таких как 2,6-дихлорфенол индофенол (DCIP); и индаминов, таких как Bindschedler зеленый и фениленовый голубой. Особенный интерес представляют феназиновые соединения, например PMS, феназин этосульфат, метоксифеназин метосульфат и сафранин, где PMS представляет собой небелковый агент для переноса электрона с низкой молекулярной массой.

Белковый агент для переноса электрона с высокой молекулярной массой представляет собой фермент, который способен к окислению восстановленного кофактора, например NAD(P)H, и одновременно восстанавливает индикатор окисления-восстановления. Этот фермент для переноса электрона представляет собой диафоразу, такую как липоевая дегидрогеназа, ферредоксин-NADP редуктаза, липоамид дегидрогеназа, NADPH дегидрогеназа. Разнообразные диафоразы являются доступными и могут быть использованы в рассматриваемых системах генерирования сигнала, они включают бацилловую диафоразу, клостридиевую диафоразу, диафоразу вибриона, диафоразу свиньи.

В рассматриваемых системах генерирования сигнала отношение первого агента для переноса электрона ко второму агенту выбирается для ускорения скорости реакции по сравнению с контролем, например с системой генерирования сигнала, с одним агентом для переноса электрона только с PMS или диафоразой. Как правило, отношение первого агента для переноса электрона ко второму агенту в рассматриваемых системах изменяется от приблизительно 0,001 до 10, предпочтительно от приблизительно 0,01 до 1,0 и более часто от приблизительно 0,05 до 0,5 (нмоль/ед.).

Дополнительно системы генерирования сигнала содержат индикатор окисления-восстановления. Под индикатором окисления-восстановления подразумевается соединение, которое может восстанавливать агенты для переноса электрона, с получением детектируемого хромогенного продукта. Когда индикатор окисления-восстановления является хромогеном, пригодные для использования хромогены представляют собой любое соединение, способное изменять цвет при восстановлении одного или нескольких электронов, т.е. хромогены принимают электроны от агентов для переноса электрона.

Индикаторы окисления-восстановления выбраны из группы, состоящей из оксазинов, тиазинов и тетразолийных солей. Особый интерес представляют тетразолийные соли, которые способны принимать захваченный гидрид от агентов для переноса электрона, с образованием окрашенного формазанового продукта. Во многих случаях эти соли имеют особенность - они являются бледно-желтыми в окисленной форме, но принимают четко видимые цвета при восстановлении электрона и преобразовании в формазановые красители. Тетразолийные соединения или соли, которые представляют особый интерес, включают 2-(2'безотиазолил)-5-стирил-3-(4'-фталгидраэидил)тетразолий (BSPT); 2-безотиазолил-(2)-3,5-дифенил тетразолий (BTDP); 2,3-ди(4-нитрофенил)тетразолий (DNP); 2,5-дифенил-3-(4-стирилфенил)тетразолий (DPSP); дистирил тетразолий нитроголубой (DS-NBT); 3,3'-[3,3'-диметокси-(1,1'-бифенил)-4,4'-диил]-бис[2-(4-нитрофенил)-5-фенил]-2Н тетразолий (NBT); 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н тетразолий (МТТ); 2-фенил-3-(4-карбоксифенил)-5-метил тетразолий (РСРМ); тетразолиевый голубой (ТВ); тиокарбамил тетразолий нитроголубой (TCNBT); тетразолий тетранитроголубой (TNBT); тетразолиевый фиолетовый (TV); 2-бензотиазотиазолил-3-(4-карбокси-2-метоксифенил)-5-[4-(2-сульфоэтилкарбамоил)фенил]-2Н-тетразолий (WST-4); 2,2'-дибензотиазолил-5,5'-бис[4-ди(2-сульфоэтил)карбамоилфенил]-3,3'-(3,3'-диметокси-4,4'-бифенилен)дитетразолий, динатриевая соль (WST-5); 2-(п-нитрофенил)-3-(п-йодфенил)-5-фенилтетразолий хлорид (INT); и тому подобное. WST-5 является предпочтительным во многих воплощениях, поскольку он легко растворяется в водной среде, которая наиболее совместима с биологическими образцами. Кроме того, получаемое формазановое соединение проявляет сильное спектральное поглощение в лилово-голубой области, что уменьшает необходимость в коррекции фонового сигнала от гемоглобина. Другие пригодные для использования тетразолийные соли описаны в патентах США №№4490465; 4491631; 4598042; 4351899; 4271265; 4,247,633; 4223090; 4215917; 4142938; 4024021; 3867259; 3867257; 3791931; и 4254222.

Описанные выше системы генерирования сигнала способны детектировать восстановленный кофактор фермента в образце, в частности, в водном образце, а более конкретно, в физиологическом образце, например в цельной крови, или в ее фракции, или продукте. Множество различных восстановленных кофакторов фермента могут детектироваться с использованием систем генерирования сигнала, где репрезентативные восстановленные кофакторы ферментов включают восстановленные формы следующих кофакторов: бета-никотинамид аденин динуклеотид (бета-NAD), бета-никотинамид аденин динуклеотид фосфат (бета-NADP), тионикотинамид аденин динуклеотид, тионикотинамид аденин динуклеотид фосфат, никотинамид 1,N6-этеноаденин динуклеотид, никотинамид 1,N6-этеноаденин динуклеотид фосфат и пирроло-хинолин хинон (PQQ). Указанные системы генерирования сигнала предпочтительны для детектирования NADH или NAD(P)H.

Восстановленный кофактор фермента является таким, который получается после окисления представляющего интерес анализируемого вещества в образце. Следовательно, рассматриваемые системы генерирования сигнала также включают кофактор фермента и фермент, окисляющий анализируемое вещество, который способен к окислению анализируемого вещества и к одновременному восстановлению кофактора фермента. Представляющие интерес кофакторы ферментов включают те, которые описаны выше, то есть бета-никотинамид аденин динуклеотид (бета-NAD), бета-никотинамид аденин динуклеотид фосфат (бета-NADP), тионикотинамид аденин динуклеотид, тионикотинамид аденин динуклеотид фосфат, никотинамид 1,N6-этеноаденин динуклеотид, никотинамид 1,N6-этеноаденин динуклеотид фосфат и пирроло-хинолин хинон (PQQ). Кофакторы ферментов, которые могут быть включены в рассматриваемую систему генерирования сигнала, включают NADH или NAD(P)H.

Фермент, окисляющий анализируемое вещество, присутствующий в системе генерирования сигнала, обязательно зависит от природы анализируемого вещества, которое должно детектироваться с помощью системы. Ферменты, окисляющие анализируемые вещества, включают алкоголь дегидрогеназу для спирта, формальдегид дегидрогеназу для формальдегида, глюкоза дегидрогеназу для глюкозы, глюкоза-6-фосфат дегидрогеназу для глюкоза-6-фосфата, глютамат дегидрогеназу для глютаминовой кислоты, глицерин дегидрогеназу для глицерина, бета-гидроксибутират дегидрогеназу для бета-гидроксибутирата, гидроксистероид дегидрогеназу для стероида, L-лактат дегидрогеназу для L-лактата, лейцин дегидрогеназу для лейцина, малат дегидрогеназу для яблочной кислоты и пируват дегидрогеназу для пировиноградной кислоты. Таким образом, фермент, окисляющий анализируемое вещество, как правило, представляет собой дегидрогеназу.

Согласно изобретению также предусмотрена композиция реагентов для детектирования по меньшей мере восстановленного кофактора фермента, а во многих случаях и анализируемого вещества в образце. Композиции реагентов могут быть флюидом, например водным, или сухими композициями, причем чаще композиции реагентов являются сухими композициями.

Композиции реагентов представляют собой такие композиции, которые включают первый и второй агенты для переноса электрона и индикатор окисления-восстановления, эти компоненты описаны выше. Указанные композиции реагентов пригодны для детектирования восстановленных кофакторов ферментов, например NAD(P)H в образце. Однако композиции реагентов дополнительно включают кофактор фермента и фермент, окисляющий анализируемое вещество.

Согласно изобретению также предусмотрены тест-полоски с реагентами для детектирования наличия анализируемых веществ в образце. В частности, предложены сухие полоски для анализируемого вещества в цельной крови, например бета-гидроксибутирата, глюкозы и тому подобное.

Тест-полоска с реагентами содержит твердую подложку и размещенную на ней сухую композицию реагентов, которая изготовлена из всех соединений-реагентов, необходимых для генерирования детектируемого сигнала в присутствии анализируемого вещества. Сухая композиция реагентов на тест-полоске включает следующие элементы: фермент, окисляющий анализируемое вещество, кофактор фермента, первый и второй агенты для переноса электрона и индикатор окисления-восстановления.

Как правило, тест-полоски содержат мембранный слой для анализа, который зафиксирован на твердой подложке. Подложка может быть изготовлена из полистирола, нейлона или полиэстрома, или металлического листа, или любого другого пригодного для использования материала. Слой для анализа предпочтительно содержит материал, впитывающий влагу, например фильтровальную бумагу или полимерную мембрану.

КОМПОЗИЦИЯ РЕАГЕНТОВ ассоциирована со слоем для анализа, например, она может быть нанесена на слой для анализа, включена в слой для анализа. Полоска может также представлять собой более сложную систему, например, когда слой для анализа размещен между подложкой и поверхностным слоем, при этом один или несколько реагентов, используемых для обработки образца, могут присутствовать в поверхностном слое. Дополнительно на тест-полоске могут быть выполнены каналы для потоков.

Тест-полоски могут быть изготовлены любым известным способом. Одним из способов является погружение по меньшей мере части полоски в водную композицию, которая включает все элементы композиции реагентов, которые должны присутствовать в слое для анализа тест-полоске. Удобно погружать часть полоски в водную композицию, выдерживать там в течение достаточного периода времени, и затем высушивать. При этом получают тест-полоску со слоем для анализа с реагентами.

Водная композиция включает различные элементы композиции реагентов, которые должны быть введены в слой для анализа тест-полоски, причем различные элементы присутствуют в количествах, достаточных для обеспечения желаемого количества реагентов в композиции, которая создается, на слое для анализа.

Концентрация небелкового агента для переноса электрона, присутствующего в водной композиции, изменяется в пределах от приблизительно 1 мкМ до 1000 мкМ, обычно от приблизительно 10 мкМ до 500 мкМ.

Концентрация белкового агента для переноса электрона в водной композиции изменяется в пределах от приблизительно 50 ед. до 3000 ед., обычно от приблизительно 100 ед. до 1000 ед. Концентрация окислительно-восстановительного реагента, присутствующего в водной композиции, изменяется в пределах от приблизительно 3 мМ до 36 мМ, обычно от приблизительно 6 мМ до 24 мМ. Концентрация кофактора фермента изменяется в пределах от приблизительно 1,5 мМ до 28 мМ, обычно от приблизительно 3,5 мМ до 14 мМ. Концентрация фермента, окисляющего анализируемое вещество, изменяется в пределах от приблизительно 100 ед. до 2000 ед., а обычно от приблизительно 200 ед. до 1000 ед. Другие компоненты, которые могут присутствовать в водной композиции, используемые для приготовления тест-полоски с реагентами, включают хлорид натрия, хлорид магния, Tris, PSSA, Tetronic 1307, Crotein-SPA, сахарозу, натриевую соль оксамовой кислоты, и тому подобное.

Множество различных анализируемых веществ может детектироваться с использованием заявленного способа, причем анализируемые вещества включают те, что описаны выше, например, спирт, формальдегид, глюкозу, глютаминовую кислоту, глицерин, бета-гидроксибутират, L-лактат, лейцин, яблочную кислоту, пировиноградную кислоту, стероиды. Рассматриваемые способы могут быть использованы для определения наличия, а часто и концентрации, анализируемых веществ во множестве различных физиологических образцов, таких как моча, слезы, слюна, они могут быть использованы для определении концентрации анализируемых веществ в крови или во фракциях крови, например, в образцах, полученных из крови, а более конкретно из цельной крови.

Существенным признаком заявленного способа является то, что системы генерирования сигнала, которые включают как первый, так и второй агенты для переноса электрона, обеспечивают ускорение времени реакции по сравнению с контрольной системой, которая включает в себя один агент для переноса электрона. Как правило, скорость реакции увеличивается в 1-3 раза, в зависимости от отношения PMS и диафоразы. Более того, скорость реакции больше, чем теоретическая или предсказанная скорость, которая ожидалась бы на основе сложения скоростей, обеспечиваемых индивидуальными агентами для переноса электрона, в 1-3 раза. Когда скорость реакции измеряется в K/S в секунду (смотри примеры ниже), это значение для реакции, в которой используются рассматриваемые системы генерирования сигнала, изменяется в пределах от приблизительно 0,01 до 10, предпочтительно от приблизительно 0,05 до 5, и более предпочтительно от приблизительно 0,1 до 2.

Образец и система генерирования сигнала объединяются в реакционной смеси, реакция протекает в течение времени, достаточного для формирования сигнала, указывающего на присутствие (а часто, и на количество) анализируемого вещества в образце. Получаемый в результате сигнал детектируется и приводится в соответствие с присутствием (а часто, и с количеством) анализируемого вещества в образце. В самом широком смысле реакционная смесь может быть приготовлена в кювете или другом удобном средстве для размещения флюида. Во многих вариантах указанные выше стадии имеют место на тест-полоске с реагентами, как описано выше.

При осуществлении способа согласно изобретению на первой стадии осуществляют нанесение некоторого количества физиологического образца на тест-полоску. Количество физиологического образца, например крови, которое наносится на тест-полоску, может изменяться, но, как правило, находится в пределах от приблизительно 2 мкл до 40 мкл, обычно, от приблизительно 5 мкл до 20 мкл. Количество образца крови, которое наносится на тест-полоску, может быть относительно малым и составляет от приблизительно 2 мкл до 40 мкл, предпочтительно от приблизительно 5 мкл до 20 мкл. Когда физиологический образец представляет собой кровь, могут исследоваться образцы со множеством различных гематокритов, при этом гематокрит может изменяться в пределах от приблизительно 20% до 65%, предпочтительно от приблизительно 25% до 60%.

После нанесения образца на тест-полоску происходит взаимодействие с элементами системы генерирования сигнала с получением детектируемого продукта, который присутствует в количестве, пропорциональном исходному количеству представляющего интерес анализируемого вещества, присутствующего в образце. Определяется количество детектируемого продукта, то есть сигнал, получаемый с помощью системы генерирования сигнала, и это количество приводится в соответствие с количеством анализируемого вещества в исходном образце. В некоторых случаях используются автоматические инструменты. На этой стадии полученная концентрация анализируемого вещества учитывает составляющую от параллельных реакций, например, путем соответствующей калибровки инструмента.

Согласно изобретению также предусмотрены наборы для осуществления заявленного способа. Наборы содержат систему генерирования сигнала, указанную выше, причем компоненты системы генерирования сигнала могут быть объединены в одну композицию реагентов или разделены, то есть, находиться в отдельных контейнерах. В некоторых вариантах воплощения изобретения система генерирования сигнала находится в наборе в форме тест-полоски с реагентами, как описано выше. Рассматриваемые наборы могут дополнительно включать средства для получения физиологического образца. Например, когда физиологический образец представляет собой кровь, набор может дополнительно включать средства для получения образца крови - устройство для перфорации пальца, средства для приведения в действия устройства для перфорации пальца. Кроме того, наборы могут включать контрольный раствор или стандартный раствор, например, контрольный раствор анализируемого вещества, который содержит стандартизованную концентрацию анализируемого вещества. В определенных вариантах воплощения изобретения наборы содержат автоматизированный инструмент для определения количества продукта, получаемого на полоске после нанесения образца, и определения соответствия между детектируемым продуктом и количеством анализируемого вещества в образце. Наконец, наборы включают инструкции для использования компонентов при определении концентрации анализируемого вещества в физиологическом образце. Инструкции могут быть представлены на одном или более элементов, включая упаковку, вкладыш, контейнеры, присутствующие в наборах.

А. Приготовление кетоновой тест-полоски

0,8 мкм нейлоновую мембрану фирмы Cuno (Meridien, СТ) погружали в реагент, раскрытый в Таблице 1, до насыщения.

Таблица 1
Компонент	Количество
Вода	100 мл
Tris(гидроксиметил)аминометан	1,2 грамм
Хлорид натрия (MW 56.44, Sigma St. Louis. МО)	560 мг
Хлорид магния (MW 203, Sigma, St. Louis, МО)	2,5 грамм
PSSA. Натриевая соль полистиролсульфоновой кислоты, (MW 70,000)	3 грамм
Crotem-SPA (Croda Inc., Parsippany, NJ)	3 грамм
Натриевая соль оксамовой кислоты	250 мг
Tetronic 1307 (BASF Corporation, Mount Olive, NJ)	2 грамм
Сахароза (MW 342.30, Aldrich Chemicals, Milwaukee WI)	5 грамм
NAD (MW 663.4, N7004, Sigma. St. Louis, МО)	450 мг
D-3-гидроксибутират дегидрогеназа	50.000 ед.
WST-5 (MW 1331.37, Dojmdo, Japan)	1.8 грамм
Диафораза	0-15000 ед.
Феназин метосульфат (PMS)	0-3 мг

Избыток реагента осторожно удалили (соскребли) с помощью стеклянной палочки. Полученную в результате мембрану подвесили для сушки при 56°С в печи в течение 10 минут. Porex (толщиной 0,6 мм) пропитали в 5% растворе нитрита, а затем подвесили для сушки при 100°С в печи в течение десяти часов. Наконец, мембрану ламинировали между основой из полиэстера (0,4 мм полиэстер Melenex® от ICI America, Wilmington DE) и Porex, пропитанным нитритом.

В. Анализы

Анализ осуществляли следующим образом.

10 мкл водных образцов, содержащих 40 мг/дл (D) β-гидроксибутирата, исследовали на полосках, как описано выше. Полоски варьировали с точки зрения количества PMS и/или диафоразы, присутствующей на полоске. 10 мл водный образец наносился на свежеприготовленную тест-полоску. Полоску вставляли в рефлектометр и осуществляли сбор данных. Коэффициент отражения исследуемой полоски отслеживали на 660 нм через односекундные интервалы в течение двух минут. Затем данные перемещали из буфера памяти рефлектометра в персональный компьютер с помощью модифицированного последовательного кабеля. Скорость реакции вычисляли на основе начальной скорости в K/S, в диапазоне, где профиль реакции является линейным. Результаты в Таблице 2 представляют собой среднюю величину от пяти повторений. При каждом индивидуальном анализе наблюдается скорость реакции K/S/сек, где K/S представляет собой величину коэффициента отражения.

В Таблице 2 представлены результаты.

Таблица 2
Препарат DAD и PMS, по отдельности	DAD и PMS, приготовленные вместе
DADед./мл	Скорость (K/S/сек)	PMS (мкм)	Скорость (K/S/сек)	По отдельности+ (K/S/сек)	DAD ед./мл	PMS (мкм)	Вместе (K/s/сек)
150	0.0166	10	0.013	0.0296	150	10	0.0385
300	0.0392	20	0.0225	0.0617	300	20	0.1054
600	0.0943	40	0.0484	0.1427	600	40	0.3095
900	0.1666	60	0.078	0.2446	900	60	0.5861
1200	0.1787	80	0.1085	0.2872	1200	80	0.9107
1500	0.2866	100	0.13	0.4166	1500	100	Слишком быстро*
+ Теоретическая скорость, то есть скорость, предсказанная на основе суммы скоростей реакций, осуществляемых при наличии диафоразы и PMS по отдельности.* Реакция является слишком быстрой, и сложно определить скорость точно.

С. Зависимость скорости реакции от теоретической скорости

В Таблице 3 приведено сравнение действительной скорости реакции и ожидаемой или теоретической скорости реакции для описанных выше анализов.

Таблица 3
Теоретическая скорость реакции (K/S в сек)	Фактическая скорость реакции (K/S в сек)
0.0296			0.0385
0.0617			0.1054
0.1427			0.3095
0.2446			0.5861
0.2872			0.9107

На чертеже приведена диаграмма зависимости наблюдаемой скорости от теоретической скорости.

Из диаграммы следует, что скорость реакции системы генерирования сигнала тест-полоски ускоряется в присутствии как PMS, так и диафоразы, величина наблюдаемого ускорения неожиданно больше, чем предсказанная величина ускорения на основе суммы скоростей реакций систем, включающих PMS или диафоразу по отдельности.

Из приведенных выше результатов ясно, что заявленное изобретение обеспечивает значительное и неожиданное увеличение скорости реакции при детектировании анализируемого вещества на основе окисления анализируемого вещества и сопутствующего восстановления индикатора окисления-восстановления. Кроме того, согласно изобретению получен более экономичный способ детектирования анализируемого вещества по сравнению с известными способами, основанными на диафоразе как агенте для переноса электрона.

1. Система генерирования сигнала для детектирования наличия восстановленного кофактора в образце, содержащая сухую композицию реагентов, включающую первый агент для переноса электрона с низкой молекулярной массой и второй агент для переноса электрона с высокой молекулярной массой, способные к окислению восстановленного кофактора, причем отношение первого агента ко второму агенту находится в пределах от 0,001 до 10, индикатор окисления-восстановления.

2. Система генерирования сигнала по п.1, отличающаяся тем, что первый агент для переноса электрона представляет собой соединение для переноса электрона с низкой молекулярной массой.

3. Система генерирования сигнала по п.2, отличающаяся тем, что соединение для переноса электрона с низкой молекулярной массой представляет собой соединение феназина.

4. Система генерирования сигнала по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что второй агент для переноса электрона представляет собой соединение для переноса электрона с высокой молекулярной массой.

5. Система генерирования сигнала по п.4, отличающаяся тем, что соединение для переноса электрона с высокой молекулярной массой представляет собой белковое соединение.

6. Система генерирования сигнала по п.5, отличающаяся тем, что белковое соединение представляет собой фермент.

7. Система генерирования сигнала по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что индикатор окисления-восстановления представляет собой тетразолийное соединение.

8. Система генерирования сигнала по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что сухая композиция реагентов присутствует на тест-полоске.

9. Способ детектирования наличия анализируемых веществ в образце, заключающийся в том, что используют систему генерирования сигнала, содержащую сухую композицию реагентов по любому из предыдущих пп.1-8.

10. Набор для детектирования наличия анализируемых веществ в образце, содержащий систему генерирования сигнала по любому из пп.1-8.