Штамм бактерий brevibacillus laterosporus вкпм в-7768, используемый для борьбы с тараканами, и биологический препарат "торнам" на основе этого штамма

Штамм бактерий brevibacillus laterosporus вкпм в-7768, используемый для борьбы с тараканами, и биологический препарат "торнам" на основе этого штамма

Реферат

Изобретение относится к промышленной биотехнологии, в частности к производству и применению биологических инсектицидов.

Тараканы являются весьма серьезными вредителями. Широко известны синантропные виды тараканов, экологическая ниша которых связана с жизнедеятельностью человека. В России особенно распространены рыжий таракан, или прусак (Blattella germanica), и черный таракан (Blatta orientalis). Широкий спектр питания, способность к быстрым перемещениям, в том числе и по подземным коммуникациям, попеременный контакт с продуктами питания человека и всевозможными отходами, определяют значение тараканов не только как неприятных насекомых, имеющих санитарно-гигиеническое значение, но и как переносчиков возбудителей инфекционных и паразитарных заболеваний человека и домашних животных. Тараканы разносят различные бактерии и яйца паразитирующих червей. Бактерии, вызывающие дизентерию и другие кишечные заболевания человека, переносятся ими как на поверхности усиков и ног, так и внутри кишечного тракта, из которого выходят вместе с экскрементами. Продукты жизнедеятельности тараканов - экскременты, выделения, шкурки перелинявших личинок - являются источниками аллергенов и причиной возникновения аллергических заболеваний. Поэтому борьба с тараканами представляет важное звено в системе санитарно-эпидемиологических мероприятий [1].

Тараканы наносят также серьезный экономический ущерб, т.к. проникают во все виды транспорта, заселяют компьютерную, измерительную и другие виды аппаратуры и систем связи. Согласно экспертным данным до 30% повреждений компьютерных сетей вызываются тараканами.

Действующим токсичным началом большинства используемых для борьбы с тараканами инсектицидов являются синтетические химические вещества, относящиеся к группам фосфорорганических соединений (ФОС), карбаматов и пиретроидов [1, 2]. ФОС и синтетические пиретроиды являются нервно-паралитическими ядами не только для насекомых, но и для теплокровных животных и человека. Большинство применяемых в настоящее время химических инсектицидов относятся ко II и III классам опасности (высокоопасные и умеренно опасные соединения). Кроме того, существует очень важная проблема возникновения резистентности тараканов к химическим инсектицидам [1, 3]. Повышение норм расхода химических инсектицидов не всегда приводит к положительным результатам [4].

Альтернативу химическим препаратам могут составить экологически безопасные биологические инсектициды на основе микроорганизмов, их применение может снизить загрязнение окружающей среды высокотоксичными химическими инсектицидами и исключить проблему возникновения устойчивости насекомых к широко применяемым химическим пестицидам. В настоящее время в мире отсутствует информация о биологических инсектицидах для борьбы с тараканами. В России в списке инсектицидных препаратов, разрешенных Минздравом РФ (1995-2002 г.) для уничтожения синантропных тараканов, который включает более 300 наименований, нет ни одного биологического инсектицида [1].

В качестве биологического средства для борьбы с тараканами мы предлагаем штамм Brevibacillus laterosporus и разработанный на его основе инсектицидный препарат "Торнам". В литературе отсутствуют данные о штаммах Brevibacillus laterosporus, обладающих инсектицидной активностью против тараканов, поэтому в качестве ближайшего аналога был выбран токсичный для тараканов штамм Bacillus thuringiensis P185L8, продуцирующий белковые кристаллические токсины и вызывающий 80%-ную гибель рыжих тараканов через 10-12 дней после обработки [5]. Необходимо отметить, что инсектицидный эффект оказывает только раствор белковых кристаллов штамма-аналога, полученный после обработки спорокристаллической смеси штамма карбонатным буфером рН 11-11,5, содержащим 0,5% 2-меркаптоэтанола, а не нативная культуральная жидкость [5].

Задачи заявляемой группы изобретений:

- получить штамм бактерий, обладающий более высокой, чем ближайший аналог, инсектицидной активностью против тараканов,

- разработать на его основе эффективный биологический препарат для борьбы с тараканами.

Задачи решены путем:

- получения штамма бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7768; обладающего высокой инсектицидной активностью против тараканов,

- разработки биологического препарата "Торнам" для борьбы с тараканами, включающего в качестве активного начала культуральную жидкость штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7768, содержащую 2-8×10⁸ КОЕ/мл (КОЕ-колонии образующая единица), а в качестве целевых добавок гелеобразователи (агар, глицерин, вазелиновое масло), пищевые аттрактанты (овсяная мука, пивные дрожжи, подсолнечное масло, сахар, ванилин), консервант (бензойная кислота) и воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:

культуральная жидкость штамма бактерий Brevibacillus
laterosporus ВКПМ В-7768 (2-8×108 КОЕ/мл)	1-10
агар	1-2
глицерин	10-20
вазелиновое масло	4-6
овсяная мука	8-12
пивные дрожжи	4-6
подсолнечное масло	3-5
сахар	2-5
ванилин	0,5
бензойная кислота	0,5
вода	остальное

Заявляемый штамм получен без применения мутагенов из выделенного из природных источников штамма Brevibacillus laterosporus путем селекции по признаку инсектицидной активности против тараканов и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-7768.

Штамм Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7768 имеет следующие характеристики.

1. Культурально-морфологические признаки.

Грамположительные подвижные палочки, перитрихи, размером 0,5-0,7×2,5-5,0 мкм, цепочек не образуют. Хорошо спорулирует на жидких и твердых питательных средах.

В качестве твердых питательных сред использовали агаризованные среды NBY, LB и ДПС.

Состав среды NBY, мас.%:

питательный бульон	0,8
дрожжевой экстракт	0,3
агар	2,0
вода	остальное

Состав среды LB, мас.%:

бакто-триптон	1,0
бакто-дрожжевой экстракт	0,5
NaCl	1,0
агар	2,0
вода	остальное

Состав среды ДПС, мас.%:

дрожжи	3,0
кукурузная мука	1,5
агар	2,0
вода	остальное

При культивировании на агаризованных средах NBY, LB, ДПС через 48 часов при температуре 28-30°С штамм образует округлые колонии диаметром 3-4 мм белого цвета. Через 72 часа роста на указанных питательных средах штамм образует споры. В процессе споруляции образуется каноэвидная структура, примыкающая к споре. Свободные споры имеют эллиптическую форму. Размер спор 0,9-1,2×1,5-1,7 мкм. Характерной особенностью штамма является наличие параспоральных кристаллических включений ромбической формы размером 0,4-0,6 мкм.

2. Физиолого-биохимические свойства.

Штамм образует каталазу. Гидролизует казеин и желатину, не гидролизует крахмал. Мочевину не расщепляет. Не сбраживает сахарозу, арабинозу, ксилозу, лактозу. Сбраживает глюкозу, мальтозу, маннит, фруктозу. Глюкозу сбраживает без газа. Не образует ацетоина. Образует лецитиназу, твин-эстеразу. Растет в присутствии лизоцима.

3. Инсектицидные свойства штамма.

Штамм ВКПМ В-7768 характеризуется высокой специфичностью инсектицидного действия против рыжих тараканов Blattella germanica. Он вызывает гибель 100% тараканов уже через 7 суток после введения культуральной жидкости штамма, содержащей 2-8×10⁸ КОЕ/мл, в диету тест-насекомых. В отличие от ближайшего аналога заявляемый штамм Brevibacillus laterosporus В-7768 применяют в виде культуральной жидкости без дополнительной обработки (табл.1).

Таблица 1Сравнительная характеристика заявляемого штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7768 и штамма - ближайшего аналога
Штаммы	Сравниваемые показатели	Эффективность действия против тараканов
Форма кристаллов	Мол. масса кристаллических белков, кДа	Спектр инсектицидного действия
В. thuringiensis PS185L8 [Payne et al., 1994]	Аморфные	165, 105, 86, 69, 33, 30	Тараканы Blattella germanica	80% гибель тараканов через 10-12 дней после введения в диету раствора кристаллов
Brevibacillus laterosporus B-7768	Ромбовидные, квадратные, гексагональные	130, 65	Тараканы Blattella germanica	100% гибель тараканов через 7 дней после введения в диету культуральной жидкости штамма (2-8×108 КОЕ/мл)

4. Поддержание и хранение штамма.

Поддержание штамма проводят на косяках с агаризованной средой NBY, которые пересевают каждые две недели. Лиофилизированные образцы штамма хранят в холодильнике при температуре +4°С в течение 6 и 12 месяцев. Через 6 и 12 месяцев хранения проверяют сохранность основных характеристик штамма (КОЕ/мл; ЛК₅₀ КЖ, где КЖ - культуральная жидкость, а ЛК₅₀ - летальная концентрация, вызывающая 50%-ную гибель тараканов). Результаты, представленные в табл.2, показывают, что при хранении лиофилизированных образцов штамма в течение 1 года его продуктивность и инсектицидная активность снижаются незначительно.

Таблица 2Проверка показателей штамма Brevibacillus laterosporus B-7768 в процессе хранения
Хранение, месяц	КОЕ/мл	ЛК50(%КЖ)
0	4,0×108	0,70(0,36-1,21)
6	3,9×108	0,72(0,36-1,25)
12	3,8×108	0,74(0,40-1,27)
Примечание: в скобках указаны значения 95%-ного доверительного интервала

5. Состав биологического препарата "Торнам" для борьбы с тараканами.

На основе заявляемого штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ B-7768 разработан биологический препарат для борьбы с тараканами, названный нами "Торнам". Препарат представляет собой биологический инсектицид с содержанием активного начала - культуральной жидкости штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ B-7768 в количестве 2-10×10⁶ КОЕ/г препарата. Он также включает ряд компонентов, придающих препарату необходимые потребительские свойства, а именно: гелеобразную структуру (гелеобразователи - агар, глицерин, вазелиновое масло), пищевую привлекательность для насекомых (пищевые аттрактанты - овсяную муку, пивные дрожжи, подсолнечное масло, сахар, ванилин), стабильность (консервант - бензойную кислоту) и воду.

Заявляемый препарат имеет форму гель-пасты. Преимуществом такой препаративной формы является то, что ее желеобразная основа при нанесении на поверхности длительное время не высыхает и привлекает тараканов как увлажненная пища. В состав геля введен глицерин. Система инсектицид - глицерин - вода пролонгирует действие препарата на поверхностях, уменьшает скорость адсорбции поверхностью и испарение инсектицида [1, 6].

Способ получения инсектицидного препарата включает семь этапов последовательного введения ингредиентов при перемешивании (пример 3).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культивирование штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ B-7768.

Для культивирования штамма В-7768 используют колбы Эрленмейера объемом 750 мл, которые заполняют 50 мл стерильной среды ГД, имеющей следующий состав, мас.%:

гидролизные дрожжи	4,5
остальное	вода
рН	6,8-7,2

Среду готовят на питьевой (водопроводной) воде. Готовую среду кипятят 10 мин, остужают до комнатной температуры, доводят значение рН до 6,8, разливают в колбы по 50 мл и стерилизуют в автоклаве при давлении 0,8 атм при температуре 120°С с выдержкой в течение 30 мин. После стерилизации колбы охлаждают до +20°С и контролируют путем отбора проб стерильность и рН.

В 50 мл стерильной среды ГД добавляют 2 мл посевного материала, выращенного на среде ГД со встряхиванием (250 об/мин) при температуре 29-30°С в течение 72 часов и имеющего концентрацию жизнеспособных клеток и спор 2×10⁸ КОЕ/мл. Культуру для получения биомассы выращивают в тех же условиях, что и посевной материал. Каждые сутки (после 24 часов роста) отбирают пробы для микробиологического контроля, который включает проверку состояния культуры и отсутствия посторонней микрофлоры. К 72 часам культивирования титр культуры штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7768 составляет 2×10⁸ КОЕ/мл.

Пример 2.

Оценка инсектицидной активности заявляемого штамма.

Штамм ВКПМ В-7768 выращивают, как указано в примере 1. Культуральную жидкость, содержащую 2×10⁸ КОЕ/мл, последовательно разводят стерильной дистиллированной водой в 5, 25, 125 и 625 раз, 1 мл каждого образца вносят в диету нимф 1-2 возраста тараканов Blattella germanica. В садок помещают по 30 тест-насекомых. Испытания проводят в трех биологических повторностях. В контрольных вариантах в диету насекомых вносят 1 мл воды. Подсчет смертности нимф тараканов проводят через 7 суток после обработки.

Гибель насекомых в % (Pi) вычисляют по формуле

Pi=Пi/По×100%,

где Пi - количество погибших насекомых;

По - общее количество насекомых.

За конечный результат принимают среднее арифметическое значение гибели насекомых, в %, определенное по результатам параллельных опытов.

Расчет ЛК₅₀ и статистическую обработку полученных результатов осуществляют с использованием компьютерной программы "Probit" [7] с учетом гибели нимф тараканов в контроле.

Результаты проверки инсектицидной активности штамма В-7768 представлены в табл.3.

Данные, представленные в таблице 3, показывают, что штамм обладает высоким уровнем инсектицидного действия, а именно культуральная жидкость штамма, содержащая 2×10⁸ KOE/мл, вызывает 100%-ную гибель насекомых через 7 суток после введения в диету. Среднее значение ЛК₅₀ заявляемого штамма против нимф тараканов составляет 0,71% культуральной жидкости. Так как инсектицидная активность штамма - ближайшего аналога против тараканов определяется раствором кристаллических белков, отсутствуют данные для сравнения ЛК₅₀ культуральной жидкости. Однако сравнение гибели тест-насекомых (в %) в зависимости от продолжительности обработки заявляемым штаммом и штаммом - ближайшим аналогом (табл.1) показывает большую эффективность инсектицидного действия заявляемого штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМВ-7768.

Пример 3. Приготовление препарата "Торнам" и определение его инсектицидной активности.

Штамм Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7768 культивируют, как указано в примере 1, а затем полученную культуральную жидкость используют для приготовления препарата при следующем соотношении компонентов, мас.%:

культуральная жидкость штамма бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7768 (2×108 КОЕ/мл)	5
агар	1
глицерин	20
вазелиновое масло	4
овсяная мука	8
пивные дрожжи	6
подсолнечное масло	3
сахар	5
ванилин	0,5
бензойная кислота	0,5
вода	остальное

Получение инсектицидного препарата включает семь последовательных этапов:

1. Получение смеси культуральной жидкости штамма с глицерином осуществляют путем добавления глицерина и перемешиванием системы в течение 2 мин при 500 об/мин.

2. Получение смеси культуральной жидкости с глицерином и вазелиновым маслом осуществляют путем добавления вазелинового масла к системе при перемешивании в течение 2 мин при 500 об/мин.

3. Приготовление 4%-ного водного раствора агара осуществляют непосредственно перед получением препарата путем растворения агара в горячей воде (80-90°С) при непрерывном перемешивании в течение 10 мин.

4. К смеси по п.2 добавляют 4%-ный водный раствор агара после его охлаждения до 40°С при непрерывном перемешивании в течение 2 мин при 500 об/мин.

5. Добавление к смеси по п.4 пищевых компонентов препарата (овсяная мука, пивные дрожжи, сахар, ванилин, растительное масло) осуществляют при непрерывном перемешивании в течение 5 мин при 500 об/мин.

6. Добавление к смеси по п.5 консерванта (бензойная кислота) осуществляют путем перемешивания в течение 5 мин при 500 об/мин.

7. Получение конечной гелеобразной формы препарата (гель-паста) осуществляют путем перемешивания смеси компонентов, полученной по п.6, с водой в течение 5 мин при 500 об/мин.

В табл.4 представлена характеристика полученного препарата - инсектицидной гель-пасты "Торнам" для борьбы с тараканами.

Таблица 4Свойства и некоторые параметры полученного инсектицидного препарата
Показатели	Характеристика
1. Внешний вид	Гель-паста
2. Цвет	Серо-бежевый
3.Запах	Специфический
4.рН	5,5-6,0
5. КОЕ/г препарата	10×106
6. Плотность (г/мл)	1,2

При тестировании инсектицидной активности 0,1 г приготовленного препарата используют в качестве диеты для 30 нимф тараканов. В контрольных вариантах опыта насекомым дают стандартную диету (хлеб и воду). Результаты испытаний рассчитывают по гибели насекомых, в процентах, через 5, 7 и 9 суток после начала опыта (табл.5).

Приведенные в табл.5 данные демонстрируют, что препарат "Торнам" вызывает 100%-ную гибель нимф рыжего таракана Blattella germanica уже через 7 суток.

Таблица 5Инсектицидная активность препарата
Вариант опыта	Гибель насекомых (в %) через
5 суток	7 суток	9 суток
Контроль (стандартная диета)	0	0	0
Биологический инсектицидный препарат	80,0±5,0	100	100

Таким образом, получен штамм бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7768, превосходящий известные ранее штаммы по инсектицидной активности против тараканов. На его основе разработан эффективный биологический инсектицид гель-паста "Торнам" для борьбы с тараканами, не имеющий аналогов. Гелеобразная структура, высокая инсектицидная активность и стабильность обеспечивают биологическому инсектициду гель-пасте "Торнам" высокие потребительские качества. Согласно данным токсиколого-гигиенической оценки биоинсектицид "Торнам" признан малотоксичным и отнесен к IV классу опасности.

Список литературы

1. Дремова В.П., Алешо Н.А. Синантропные тараканы. Биология, экология, контроль численности. М.: ЗАО "НКФ РЭТ", 2003.

2. Мельников Н.Н., Новожилов К.В., Белан С.Р. Пестициды и регуляторы роста растений. Справочник. М.: Химия, 1995.

3. Рославцева С.А. Резистентность синантропных тараканов к инсектицидам и применение препаратов, содержащих авермектины и фипронил. // Дез. дело. 2002. №2. С.46-50.

4. Рославцева С.А. Микрокапсулированные инсектициды - новая перспективная препаративная форма. // Агрохимия, 1992. №10. С.122-126.

5. Payne J.M., Kennedy M. K., Randall J.B., Brower D.O. 1994. Bacillus thuringiensis isolates active against cockroaches and genes encoding cockroach-active toxins. United States Patent 5302387.

6. Терехова З.А. Инсектогели - перспективная форма применения пиретроидов. // Мед.паразитол. 1995. №1. С.29-32.

7. Liberman H.R. 1983. Estimating LD₅₀ using the probit technique: A BASIS computer program. Drug Chem. Tox.6:111-116.

1. Штамм бактерий Brevibacillus laterosporus, используемый для борьбы с тараканами, хранящийся во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-7768.

2. Биологический препарат для борьбы с тараканами, включающий в качестве активного начала культуральную жидкость штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7768, содержащую 2-8×10⁸ КОЕ/мл, а в качестве целевых добавок гелеобразователи - агар, глицерин, вазелиновое масло; пищевые аттрактанты - овсяная мука, пивные дрожжи, подсолнечное масло, сахар, ванилин; консервант - бензойную кислоту и воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Культуральная жидкость штамма Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-7768, содержащая 2-8×108 КОЕ/мл	1-10
Агар	1-2
Глицерин	10-20
Вазелиновое масло	4-6
Овсяная мука	8-12
Пивные дрожжи	4-6
Подсолнечное масло	3-5
Сахар	2-5
Ванилин	0,5
Бензойная кислота	0,5
Вода	Остальное