Способ приготовления биологически активного препарата из пантов

Способ приготовления биологически активного препарата из пантов

Реферат

Изобретение относится к производству фармакологических препаратов с выраженной биологической активностью и может быть использовано в косметической промышленности, бальнеологии, а также в медицине и ветеринарии.

Известен способ получения спиртового экстракта пантов путем нагревания до 50°С 15% смеси пантовой муки (измельченные панты) в 50% этиловом спирте и выдержки при этой температуре в течение 3-х часов (см. Сборник научных трудов "Пантокрин", Горно-Алтайск, 1969, с. 18-20). Согласно биохимическим исследованиям спиртового экстракта пантов в нем превалировало содержание липидной фракции, составными частями которой являются жиры, фосфатиды, сульфатиды, цереброзиды, стерины и их производные. Однако из 43,35 г белка, содержащего в 100 г пантовой муки, в экстракт переходило всего 0,15 г (0,35%).

Известен способ гидролитической экстракции пантов в 6 н. соляной кислоте при 160°С в течение 24 часов со степенью извлечения белка всего 0,8%. Кроме этого, высокотемпературный режим разрушает биологически активные вещества, а кислотность предопределяет обязательное наличие операции по нейтрализации кислоты с последующим удалением солей. Следует отметить также, что при обработке кислотами и нагревании происходит необратимое разрушение белка - денатурация (см. Сборник научных трудов "Пантокрин", Горно-Алтайск, 1969, с.29-32).

Известен "Способ приготовления препарата для животных из растительного и животного сырья", включающий последовательное воздействие кислотного и ферментативного гидролиза с последующей фиксацией продукта спиртом и йодом. В качестве животного сырья в способе используют отходы фармпереработки пантов, а в качестве ферментов - пепсин и бычью желчь (см. патент PU 2086244, МКИ А 61 К 35/32). Препарат назван пантогидролизатом. Способ характеризуется многоступенчатостью, применением химикатов, которые после проведения реакции нейтрализации образуют соли, а в связи с тем, что препарат предназначен для внесения в корм животным, соли не выводятся, что не приемлемо при использовании для нужд человека. Процесс длителен (от 4 до 8 дней), а наличие кислотного гидролиза предопределяет необратимое разрушение белка. Кроме этого, при нагревании до 70-75° снижается растворимость белков, так видимое выпадение в осадок для альбумина наступает при 67°С, для глобулинов - 69°С, для фибриногена - 56°С.

Известен способ получения пантолизата, включающий кислотно-ферментативный гидролиз измельченных пантов в искусственном желудочном соке. Процесс ведут при температуре от 20 до 42°С. Однако использование кислоты обуславливает обязательное наличие операции нейтрализации с последующим удалением солей, а также необратимое разрушение белка (см. патент RU 2112396, МКИ A 23 j 1/10, A 23 j 3/34, А 61 К 35/32 - прототип).

Необходима разработка способа приготовления препарата из пантов, характеризуемого простотой и обеспечивающего высокое содержание биологически активных веществ, в частности белков, наследующих основные факторы биологической активности пантов, без использования агрессивных сред в виде кислот и щелочей.

Сущность способа заключается в том, что ферментативный гидролиз измельченных пантов (пантовая мука со степенью размола не более 100 мкм) проводят без использования агрессивных сред в виде кислот и щелочей путем предварительного замачивания пантовой муки водой на 1,5-2 часа (частичный гидролиз) с последующим введением в суспензию ферментативного комплекса суспензии поджелудочной железы. Ферментативный комплекс суспензии поджелудочной железы представляет собой размолотые на гомогенизаторе поджелудочные железы (в свежем или замороженном виде) крупного рогатого скота и содержит ферменты трипсиноген (претрипсин), трипсин А и В, хитотрипсин, карбоксипептидазу и эластазу, расщепляющие белки до аминокислот, аминопепсидазу, расщепляющую полипептиды, амилазу (диастазу), инвертазу и лактазу, превращающие сложные углеводы в простые.

Ферментативный комплекс вводится из расчета 10% к массе пантовой муки, при этом гидролиз проводят в течение 6 часов при 38-40°С, затем полученный гидролизат экстрагируют водой в соотношении 1:5 в течение 6 часов и перед фильтрацией центрифугируют.

Пример. Пантовую муку (размолотые консервированные панты) со степенью размола не более 100 мкм, для обеспечения гомогенной влажной массы, замешивают при комнатной температуре в двойном (массовом) объеме дистиллированной воды. Через 1,5-2 часа прибавляют к полученной суспензии ферментный комплекс суспензии поджелудочной железы (СПЖ) из расчета 10% к массе суспензии. Ферментный комплекс суспензии поджелудочной железы (СПЖ) готовят из поджелудочных желез (в свежем или замороженном виде) крупного рогатого скота путем гомогенизации. После тщательного перемешивания субстрат помещали в термостат и в течение 6 часов выдерживали при температуре 38-40°С. По окончании срока ферментации к субстрату добавляли воду из расчета соотношения субстрата и воды 1:5 и экстрагировали в течение 6 часов на установке РК 5 М с последующим центрифугированием и фильтрацией.

Анализ данных проведенных исследований по испытанию различных способов экстракции пантов показал, что на выход в экстракт биологически активных веществ оказывает влияние природа экстрагента и его концентрация. Так при экстракции пантов водным раствором в экстракт переходит до 50% белковой фракции. При использовании в качестве экстрагента 40% этилового спирта выход белковой фракции составил 44,7%, при 70%-ном спирте - 35,5% белков. Экстракция белковых компонентов слабыми растворами спирта (ниже 30%) приводит к тому, что при охлаждении экстракта происходит желирование. Кроме этого, уже при применении 50% спирта начинает наблюдаться частичная денатурация белка, а под действием низких температур (например, в процессе приготовления готовой формы препарата) - выпадение в осадок. Сравнительный выход экстрактивных веществ в (%) из пантов в зависимости от способа экстракции (вида экстрагента) приведен (в пересчете на абсолютно сухое вещество) в таблице 1.

Таблица 1
Показатели	Способ экстракции
Водный экстракт	40% раствором этинола	70% раствором этинола
Выход экстрактивных веществ	17,2	13,41	11,68
в том числе: белковая фракция	8,08	5,99	4,15
зола	0,34	0,26	0,23
липидная фракция	0,08	0,15	0,40
Прочие составляющие	8,5	7,01	6,9

В целях определения оптимального времени режимов ферментации пантового сырья через каждые 2 часа проводили отбор проб с последующей экстракцией и аминокислотным анализом по схеме, отраженной в таблице 2.

Таблица 2
Время экстракции, час	Время ферментации, час
2	4	6	8	10
2	+	+	+	+	+
4	+	++	++	++	++
6	++	++	+++	+++	+++
8	+++	+++	+++	+++	+++
+ - + + + рост степени экстракции

Как видно из таблицы 2, после 6 часов экстрагирования субстрата ферментированного в течение 2, 4, 6, 8 или 10 часов результат практически не изменялся, т.е. показатели аминокислотного состава экстрактов увеличивались по мере увеличения время экстракции до 6 часов. Оптимальный режим процесса, таким образом, характеризовался шестью часами ферментации при шестичасовой экстракции. Динамика накопления свободных (св.) аминокислот (г/100 г белка) в пантовом субстрате в зависимости от продолжительности ферментации при воздействии ферментативного комплекса (СПЖ) и 6-часовой экстракции приведена в таблице 3.

Таблица 3
Аминокислота	Продолжительность ферментации, час
2	4	6	8
Св.	Полн.	Св.	Полн.	Св.	Полн.	Св.	Полн.
Незаменимые,г/100 г белка	10,1	21,22	10,41	20,83	17,6	33,8	14,51	36,4
Изолейцин	0,6	1,6	0,6	1,6	1,7	4,1	0,5	1,5
Лейцин	2,1	3,9	2,1	3,7	4.4	7,4	3,0	8,3
Лизин	2,1	3	2,3	3,1	1,3	2,7	2,7	7,7
Метионин + цистин	0,73	1,22	0,73	1,18	1,4	1,9	1,15	1,3
Тирозин + фенилаланин	1,7	5,2	1,5	5,4	4,8	7,5	3,0	7,6
Треонин	1,6	2,3	1,4	2,4	1,1	3,2	1,0	3,2
Триптофан	0,07	0,9	0,08	0,25	0,5	1,1	0,06	0,8
Валин	1,2	3,1	1,7	3,2	2,4	5,9	3,1	6,0
Заменимые, г/100 г белка	6,5	64,8	12,8	64,6	17,0	59,1	17,2	56,2
Аланин	0,7	7,6	1,5	7,7	2,4	6,3	2,3	6,8
Аспарагиновая кислота	0,2	6,9	0,9	6,7	1,8	10,5	3,2	9,6
Гистидин	1,4	7,9	1,2	7,6	1,5	3,9	1,6	4,9
Глицин	0.2	12,0	2,6	12,2	0,8	7,9	2,6	8,4
Глутаминовая кислота	0,9	13,9	2,2	138	3,9	11,8	3,8	14,6
Пролин	0,1	7,7	1,5	7,5	1,1	7,4	0,9	3,3
Серин	0,5	2,7	0,6	2,8	1,8	4,9	1,3	3,7
Итого:	16,6	86,2	23,21	85,43	34,6	92,9	31,71	92,6
E/N	1,44	0,31	0,78	0,31	0,91	0,54	0,80	0,62

Из приведенных табличных данных видно, что степень конверсии белка в субстрат возрастает в процессе ферментации в течение 6 часов. Результат восьмичасовой деятельности процесса ферментации, вероятно в связи с обратимостью процесса, был ниже в среднем на 9,4%, а четырехчасовая ферментация обеспечила 67 % выход белковой фракции по отношению к шестичасовому процессу.

Устойчивость белков очень различна. Гидролиз приводит к распаду полипептидных связей с образованием свободных аминокислот. Ферменты, разрушающие пептидные связи (протеазы) обладают обычно селективным действием, так что при гидролизе с участием фермента могут образовываться вместо отдельных аминокислот высокомолекулярные продукты.

Наибольшая сбалансированность аминокислотного состава (E/N - 0,91) достигалась также в результате ферментативного гидролиза пантовой муки в течение 6 часов.

При дальнейшем увеличении времени ферментации (до 10 часов) изменения в обогащении гидролизата свободными аминокислотами не значительны.

Исследование образцов экстракта на спектрометре Н-ЯМЗ-500 мГц при температуре 30°С показало, что экстракт представляет собой многокомпонентную смесь, в состав которой входят вещества с энергией смещения 8,41-6,47, характерной для свободных аминокислот, пептидов и низкомолекулярных белков. В диапазоне 4,0-3,72 представлены ароматические аминокислоты и пептиды, а в диапазоне 3,5-1,0 - спирты и липиды.

Анализ полученных при ионообменной хромотографии белковых фракций показал наличие спектра белковых компонентов с широким диапазоном молекулярных масс, две основные полосы спектра соответствовали белкам с молекулярной массой 15000 и 30000 дальтон.

Посредством обращеннофазовой хромотографии в экстракте выявлено 39 низкомолекулярных пептидов.

Обнаружение в составе экстракта биологически активной фракции, содержащей комплексы нуклеотидов с пептидами, связанной с гормональной активностью, привело к идентификации в нем значительного количества нуклеотидных компонентов (таблица 4).

Таблица 4
Нуклеотиды
Урацилнуклеотиды	Мочевая кислота	Ксантин	Гипоксантин	Гуаниннуклеотиды	Адениннуклеотиды
мг/г	%	мг/г	%	мг/г	%	мг/г	%	мг/г	%	мг/г	%
71,8	68,0	1,5	1,4	5,6	5,3	18,6	17,8	6,9	6,5	0,8	1,0

Нуклеотиды являются регуляторами метаболизма, посредниками действия многих гормонов. Эти вещества участвуют в образовании генетического аппарата и оказывают стимулирующее действие на защитные функции организма, обладают противоопухолевым действием.

Для анализа липидного состава проводили экстракцию липидов по Фолчу. Тонкослойная хромография выявила фосфолипид, совпадающий по своей подвижности с фосфотидилхолином из яичного желтка, его содержание составило 0,06 мкмоль/мл. Хромотография нейтральных липидов выявила вещество с подвижностью эфиров холестерина (менее 0,01 мкмоль/мл), триглицеридов 0,84 мкмоль/мл и свободных жирных кислот (0,5 мкмоль/мл).

Кроме этого, в экстракте обнаружены гормоны, данные по содержанию которых представлены в таблице 5.

Таблица 5
Трийодтрионин Т3, нм/л	Тироксин Ти, нМ	КортизолнМ/л	ЭстрадиолнМ/л	ПрогестероннМ/л	ТестостероннМ/л
5,84	67,0	74,42	0,76	0,48	61,35

Методом эмиссионной атомной спекроскопии выявлено присутствие значительных количеств кальция, натрия, магния и следы алюминия, кремния, меди, железа и марганца. Хелатные комплексы органических веществ с металлами переменной валентности, входящими в состав золы пантов, способны образовывать системы высокой биологической активности, среди них можно отметить роль магния, железа, меди, кобальта, йода и калия.

В результате исследований химического состава препарата из пантов, полученного заявленным способом, установлено, что препарат "пантолизат" представляет сложенную многокомпонентную смесь, включающую белки и аминокислоты, липиды, углеводы, минеральные вещества, гормоны и другие вещества, в комплексе обладающие выраженной биологической активностью.

Заявленный способ прост в применении, характеризуется низкой энерго-материалоемкостью и доступностью используемых составляющих при высоком выходе биологически активных веществ без использования агрессивных средств и может быть использован для производства косметических средств, а также в ветеринарии, медицине и бальнеологии.

Способ приготовления биологически активного препарата из пантов, включающий ферментативный гидролиз измельченных пантов и фильтрацию гидролизата, отличающийся тем, что используют пантовую муку со степенью размола не более 100 мкм, при этом перед ферментацией муку замешивают при комнатной температуре в двойном объеме дистиллированной воды, через 1,5-2 ч добавляют ферментативный комплекс суспензии поджелудочной железы из расчета 10% к массе муки и перемешивают, а гидролиз проводят в течение 6 ч при 38-40°С, затем полученный гидролизат экстрагируют водой в соотношении 1:5 в течение 6 ч и перед фильтрацией центрифугируют.