Новое антитело со специфичностью к злокачественной опухоли толстой кишки

Новое антитело со специфичностью к злокачественной опухоли толстой кишки

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к связывающей структуре, которая связывается в опухолевых клетках и/или с поверхностью опухолевых клеток; к структуре-мишени, присутствующей и/или экспрессируемой в опухолевых клетках и/или на поверхности опухолевых клеток; к связывающей структуре, которая распознает и блокирует указанную структуру-мишень; к веществу, которое связывается с указанной структурой-мишенью или блокирует экспрессию указанной структуры-мишени; к фармацевтическим композициям, содержащим указанную связывающую структуру, структуры-мишени или вещество в качестве действующего начала; к вакцинным композициям, включающим указанные структуры-мишени в качестве действующего начала; к способу отбора фага; к способам in vitro- и in vivo-диагностики и прогнозирования, а также лечения злокачественных заболеваний человека, предусматривающим использование вышеуказанных веществ.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Трансформация нормальных клеток в клетки злокачественных опухолей ассоциирована с генотипическими и/или фенотипическими изменениями как трансформируемых клеток, так и микроокружения растущей опухоли (Kerbel R.S., 1995). В принципе, некоторые из этих изменений могут распознаваться иммунной системой как опухолеспецифические антигены (TSA) и могут служить основой для опухолеспецифической иммунотерапии. Хотя явления мутаций, лежащие в основе возникновения опухоли и туморигенеза, могут приводить к экспрессии TSA как таковые, однако, вторичные изменения, такие как нарушение регуляции экспрессии и посттрансляционные модификации нормальных антигенов, могут приводить к образованию множества опухолеассоциированных антигенов, которые могут быть использованы в качестве мишеней для иммунотерапии.

Молекулы, ассоциированные с опухолевым фенотипом, могут быть идентифицированы с использованием современных технологий геномики и протеомики, которые предусматривают непосредственное применение самих этих мишеней для идентификации молекулярных модификаций и изменений уровней экспрессии (Williams K.L., 1999). В более косвенном методе опухолеассоциированные антигены (ТАА), характеризующие фенотип опухоли, были также идентифицированы с использованием моноклональных антител, образованных из гибридомы (Kohler G., Milstein С., 1976).

Технология фагового дисплея стала уже известной альтернативой гибридомной технологии, а для некоторых применений она даже является альтернативой методу генерирования моноклональных антител по принципу управляемого антигеном отбора, отличающегося от метода чистого скрининга (Hoogenboom H.R. et al., 1998). Эта технология основана на использовании бактериофаговых частиц, которые несут на своей поверхности конкретный фрагмент антитела, кодируемый их геномом, что позволяет проводить отбор фага и его кодирующей ДНК как генетической упаковки. В случае, если были получены праймеры, комплементарные генам вариабельной тяжелой и легкой цепи антитела, то гены этого антитела, предназначенные для встраивания в фаговые векторы, могут быть амплифицированы полимеразной цепной реакцией (ПЦР) в иммунокомпетентном или неиммунокомпетентном животном любого вида, и может быть сконструирована большая фаговая библиотека антител.

Для отбора фаговых библиотек на клетках получают тканевые срезы и другие биологические материалы, которые генерируют моноклональные антитела или пептиды, связывающиеся с компонентами в используемых сложных антигенных материалах (Hoogenboom H.R. et al., 1998, Tordsson J. et al., 1997). Результатом прямого позитивного отбора с использованием сложных антигенов является отбор специфичностей из общего набора тканевых специфичностей со сдвигом в сторону высокоэкспрессируемых и иммунодоминантных антигенов вплоть до антигенов с высокоаффинными взаимодействиями. Для более точной идентификации дифференциально экспрессированных антигенов, являющихся репрезентативными для данного фенотипа, необходимо использовать субтрактивные подходы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с этим настоящее изобретение относится к связывающей структуре, такой как антитело, связывающееся с опухолевыми клетками, а в частности, с эпителиальными опухолевыми клетками, такими как клетки карциномы толстой кишки, поджелудочной железы, молочной железы и легких. Настоящее изобретение также относится к структурам-мишеням, присутствующим и/или экспрессируемым в опухолевых клетках и/или на поверхности опухолевых клеток.

Настоящее изобретение также относится к новому субтрактивному способу отбора с использованием тканевых срезов или комбинаций срезов тканей и клеток в качестве материалов для отбора фага.

Таким образом, в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к связывающей структуре, которая связывается в опухолевых клетках и/или с поверхностью опухолевых клеток и которая преимущественно представлена CDR-структурами тяжелой цепи, определяемыми в основном аминокислотами 160-165 (CDR1), 180-195 (CDR2), 228-238 (CDR3) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; а дополнительная специфичность связывания обеспечивается одной или несколькими CDR-структурами легкой цепи, определяемыми в основном аминокислотами 23-36 (CDR1), 52-58 (CDR2), 91-100 (CDR3) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к связывающей структуре, которая связывается в опухолевых клетках и/или с поверхностью опухолевых клеток и которая включает одну или несколько последовательностей гипервариабельных участков (определяющих комплементарность областей) (CDR) антитела в легкой цепи, содержащей в основном аминокислоты 23-36 (CDR1), 52-58 (CDR2), 91-100 (CDR3) аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 2 в Списке последовательностей, и CDR-последовательностей в тяжелой цепи, содержащей в основном аминокислоты 160-165 (CDR1), 180-195 (CDR2), 228-238 (CDR3) аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 в Списке последовательностей.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанная связывающая структура содержит все указанные последовательности CDR.

В другом варианте осуществления изобретения указанной связывающей структурой является антитело и/или его фрагменты, которые в других вариантах осуществления изобретения включают вариабельную область легкой цепи, содержащей в основном аминокислоты 1-110 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 в Списке последовательностей, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащей в основном аминокислоты 130-249 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 в Списке последовательностей. В еще одном варианте осуществления изобретения указанное антитело содержит всю аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 в Списке последовательностей.

В одном варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура сильно и/или гомогенно связывается в эпителиальных опухолевых клетках и/или с поверхностью эпителиальных опухолевых клеток, выбранных из группы, состоящей из первичных и/или метастатических клеток карциномы толстой кишки, поджелудочной железы, молочной железы и легких. В другом варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура слабо и/или гетерогенно связывается и/или не связывается с клетками карциномы почек и/или предстательной железы, и/или злокачественной меланомы. В другом варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура сильно связывается с апикальными участками поверхности эпителия толстой кишки и эпителия тонкого кишечника. В еще одном варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура связывается с апикальным участком клеточной поверхности микроворсинок и/или щеточной каемки клеток поверхностного эпителия толстой кишки. В другом варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура слабо и/или умеренно связывается с эпителием молочной железы и/или с окружающей ее соединительной тканью.

В других вариантах осуществления изобретения указанная связывающая структура слабо и/или гетерогенно связывается и/или не связывается с нормальными тканями, включая ткани селезенки, почек, печени, легких, кожи, поджелудочной железы, щитовидной железы, сердечной мышцы и/или ЦНС.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанную связывающую структуру получают путем фагового отбора, где указанный отбор фага в другом варианте осуществления изобретения предусматривает использование комбинации предварительно иммунологически отобранного in vivo спектра связывающих структур, отображенных на фаговых частицах, и субтрактивного отбора фаговых частиц с использованием пар тканей с различными фенотипами. В другом варианте осуществления изобретения указанными последовательностями являются последовательности, происходящие от макака-крабоеда (Масаса fascicularis), где указанные аминокислотные последовательности могут быть, по крайней мере, на 78% (Vl) и на 86% (Vh) идентичны соответствующим аминокислотным последовательностям человека.

В еще одном варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура имеет низкую иммуногенность или вообще не имеет иммуногенности по отношению к человеку.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанная связывающая структура была дериватизирована посредством генетического лигирования с полипептидами и/или посредством химического конъюгирования с органическими или неорганическими химическими молекулами, и/или посредством ди-, олиго- или полимеризации.

В других вариантах осуществления изобретения указанная связывающая структура генетически лигирована или химически конъюгирована с цитотоксическими полипептидами или с цитотоксическими органическими или неорганическими химическими молекулами; или с биологически активными молекулами; или с иммуноактивирующими молекулами.

В других вариантах осуществления изобретения указанная связывающая структура модифицирована для повышения или снижения ее авидности и/или аффинности; или для увеличения ее продуктивности; или для изменения ее фармакокинетических свойств; или для сообщения ей новых фармакокинетических свойств.

В еще одном варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура является меченой, и ее связывание является специфическим и ингибируется немеченой формой указанной связывающей структуры, но не другими связывающими структурами, причем указанная не ингибирует связывание других связывающих структур, обладающих другими специфичностями.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к последовательности ДНК, кодирующей антитело, определенное выше, то есть антитело, содержащее аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 в Списке последовательностей, где указанная последовательность ДНК включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 в Списке последовательностей.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к структуре-мишени, обнаруживаемой и/или экспрессируемой в опухолевых клетках и/или на поверхности опухолевых клеток, где указанная структура-мишень может быть специфически связана связывающей структурой и способна специфически связываться со связывающей структурой, определенной выше, и с другими связывающими структурами, имеющими аналогичные связывающие свойства.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанная структура-мишень способна специфически блокироваться указанными связывающими структурами и специфически блокировать связывающие структуры.

В других вариантах осуществления изобретения указанная структура-мишень обнаруживается и/или на высоком уровне и/или гомогенно экспрессируется в опухолевых клетках и/или на поверхности эпителиальных опухолевых клеток, выбранных из группы, состоящей из первичных и/или метастатических клеток карциномы толстой кишки, поджелудочной железы, молочной железы и легких.

В еще одном варианте осуществления изобретения указанная структура-мишень обнаруживается и/или слабо и/или гетерогенно экспрессируется и/или не экспрессируется в клетках карциномы почек и/или предстательной железы, и/или злокачественной меланомы.

В другом варианте осуществления изобретения указанная структура-мишень обнаруживается и/или на высоком уровне экспрессируется в апикальных участках поверхностного эпителия толстой кишки и эпителия тонкого кишечника.

В еще одном варианте осуществления изобретения указанная структура-мишень обнаруживается и/или экспрессируется в ассоциации с апикальным участком клеточной поверхности микроворсинок и/или щеточной каемки клеток поверхностного эпителия толстой кишки.

В другом варианте осуществления изобретения указанная структура-мишень обнаруживается и/или слабо и/или умеренно экспрессируется в эпителии молочной железы и/или в окружающей ее соединительной ткани.

В других вариантах осуществления изобретения указанная структура-мишень обнаруживается и/или слабо и/или гетерогенно экспрессируется или не экспрессируется в нормальных тканях, включая ткани селезенки, почек, печени, легких, кожи, поджелудочной железы, щитовидной железы, сердечной мышцы и/или ЦНС.

В другом варианте осуществления изобретения обнаружение и/или экспрессия указанной структуры-мишени ассоциированы с эпителиальной тканью.

В другом варианте осуществления изобретения указанная структура-мишень имеет кажущуюся молекулярную массу в ее нередуцированной форме 90 и/или 220 килодальтон.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к антиидиотипу структуры-мишени, определенной выше, где указанный антиидиотип специфически связан связывающей структурой, обладающей аналогичной специфичностью связывания по отношению к указанной структуре-мишени, и специфически связывается с этой связывающей структурой.

В одном варианте осуществления изобретения указанный антиидиотип специфически блокируется указанными связывающими структурами и специфически блокирует эти структуры.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к связывающей структуре, которая распознает структуру-мишень, определенную выше, и которая имеет органическую химическую природу. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная связывающая структура блокирует связывание указанной связывающей структуры, определенной выше.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к веществу, блокирующему экспрессию структуры-мишени, определенной выше.

В одном из вариантов осуществления изобретения указанным веществом является антисмысловой олигонуклеотид и/или молекула рибозима.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к веществу, которое блокирует функцию структуры-мишени, определенной выше.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в качестве действующего начала, по крайней мере, одну связывающую структуру, определенную выше.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в качестве действующего начала структуру-мишень, определенную выше, или антиидиотип указанной структуры-мишени, определенной выше.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей в качестве действующего начала вещество, определенное выше.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к вакцинной композиции, содержащей в качестве действующего начала структуру-мишень или антиидиотип указанной структуры-мишени, определенной выше.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу фагового отбора, предусматривающему использование комбинации предварительно иммунологически in vivo отобранного набора связывающих структур, представленных на фаговых частицах, и субтрактивный отбор фаговых частиц с использованием пар тканей с различными фенотипами.

В одном из вариантов осуществления указанного способа указанный предварительно отобранный набор связывающих структур включает антитела, происходящие от приматов.

В еще одном варианте осуществления указанного способа указанные пары тканей соответствуют друг другу. Предпочтительно, указанные совместимые пары тканей происходят от того же самого индивидуума.

В других вариантах осуществления изобретения указанные ткани используют в форме замороженных и/или фиксированных формалином/залитых в парафин тканевых срезов, и/или их фрагментов, и/или клеточных суспензий.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу in vitro гистопатологической диагностики и прогнозирования злокачественных заболеваний человека, где образец подвергают контакту, по крайней мере, с одной из связывающих структур, описанных выше, и с индикатором. Указанным образцом является, предпочтительно, образец тканей, который перед приготовлением среза был заморожен и/или фиксирован формалином и залит в парафин.

В некоторых вариантах осуществления изобретения указанный способ предусматривает типирование опухоли, скрининг опухоли, диагностику и прогнозирование развития опухоли, а также мониторинг состояний, предшествующих образованию злокачественных опухолей.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу in vitro-диагностики и прогнозирования злокачественного заболевания человека, предусматривающему оценку концентраций, по крайней мере, одной связывающей структуры, определенной выше, в физиологических жидкостях.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу in vitro-диагностики и прогнозирования злокачественного заболевания человека, предусматривающему оценку концентраций антиген-содержащей структуры-мишени, определенной выше, или антиидиотипа указанной структуры-мишени, определенной выше, в физиологических жидкостях.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу in vitro-диагностики и прогнозирования злокачественного заболевания человека, предусматривающему оценку концентраций в физиологических жидкостях комплекса а) антиген-содержащей структуры-мишени, определенной выше, или антиидиотила указанной структуры-мишени, определенной выше, и b) по крайней мере, одной связывающей структуры, определенной выше.

В еще одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу in vivo-диагностики и прогнозирования злокачественного заболевания человека, предусматривающему определение локализации, по крайней мере, одной связывающей структуры, определенной выше, в опухолевых отложениях у исследуемого пациента. В одном из вариантов осуществления изобретения перед указанным определением индивидууму вводят указанную связывающую структуру. В другом варианте осуществления изобретения указанная связывающая структура аккумулируется в метастазах опухоли. В еще одном варианте осуществления изобретения указанный способ является количественным.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественного заболевания человека, предусматривающему введение пациенту, по крайней мере, одной связывающей структуры, определенной выше.

В других вариантах осуществления указанного способа указанную связывающую структуру модифицируют посредством генетического присоединения к молекулам с получением комбинированной молекулы, обладающей измененными фармакокинетическими свойствами, или посредством дериватизации.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественного заболевания человека, предусматривающему введение пациенту структуры-мишени, определенной выше. В одном из вариантов осуществления указанного способа вырабатывается иммунный ответ на указанную структуру-мишень.

В других вариантах осуществления изобретения указанную структуру-мишень модифицируют посредством генетического и/или химического присоединения к молекулам с получением комбинированной молекулы, обладающей измененными фармакокинетическими свойствами, или посредством генетического и/или химического присоединения к молекулам с получением комбинированной молекулы, обладающей измененными иммуногенными и/или антигенными свойствами, либо посредством дериватизации, либо посредством генетической модификации. В других вариантах осуществления изобретения указанную структуру-мишень смешивают с другими молекулами с получением смеси, обладающей измененными иммуногенными свойствами, или с адъювантами.

В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения злокачественного заболевания человека, предусматривающему введение пациенту вещества, определенного выше. В других вариантах осуществления изобретения указанное вещество модифицируют посредством генетического и/или химического присоединения к молекулам с получением комбинированной молекулы, обладающей измененными фармакокинетическими свойствами, или посредством дериватизации. В одном из вариантов осуществления изобретения к указанному веществу вырабатывается иммунный ответ. В других вариантах осуществления указанного способа указанное вещество модифицируют посредством генетического и/или химического присоединения к молекулам для получения комбинированной молекулы, обладающей измененными иммуногенными и/или антигенными свойствами; или посредством генетической модификации. В других вариантах осуществления изобретения указанное вещество смешивают с другими молекулами для получения смеси, обладающей измененными иммуногенными свойствами, или с адъювантами.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В способе отбора настоящего изобретения в качестве материалов для фагового отбора используют тканевые срезы или комбинации тканевых срезов и клеток. Слабо фиксированные тканевые срезы должны представлять собой биологический материал с высокой степенью консервативности исходной структуры и фенотипа.

Указанный способ был разработан и применен с использованием иммунной фаговой библиотеки для злокачественных опухолей толстой кишки в целях субтрактивного отбора на соответствующих аутологичных парах тканей толстой кишки и злокачественных опухолей толстой кишки, взятых от шести различных пациентов. Одно из отобранных специфических антител, называемое здесь К293, обнаруживало гомогенную реакцию со всеми опухолями, используемыми в данном отборе, но крайне ограниченную реакцию с нормальной толстой кишкой. Клоны с картиной К293-специфичности часто обнаруживались в последних циклах отбора, что позволяло предположить о функциональности данного субтрактивного метода, основанного на использовании данных тканей.

Преимущественная экспрессия К293-распознаваемых опухолеассоциированных антигенов (ТАА) с помощью опухолевых фенотипов, развивающихся у пациентов, в отличие от in vitro-культивированных опухолевых клеточных линий, подчеркивают преимущество и целесообразность использования тканевых срезов в качестве материала для отбора, проводимого в целях идентификации реагентов для новых и терапевтически подходящих опухолеассоциированных антигенов.

Кроме того, антитело К293 продемонстрировало высокую степень реактивности по отношению к клеткам карциномы толстой кишки, поджелудочной железы, легких и молочной железы и в высокой степени ограниченную реактивность при тестировании на широкой панели нормальных тканей. Была продемонстрирована реактивность клеточной поверхности, и наряду с этим наблюдалось отсутствие заметных уровней антигена в кровотоке, что дало основание предположить, что указанный антиген является подходящим для его нацеливания на опухоль. Этот факт также подтверждается гибридом "Fab К293-суперантиген SEA (D227A)", который продемонстрировал предварительную очевидность направленной терапевтической активности в "гуманизированной" SCID-модели с использованием гетеротрансплантированных опухолевых клеток человека.

И наконец, может быть осуществлена аффинная хроматография с использованием иммобилизованных фрагментов антитела К293 и очистка белковой фракции. Фракции, выявленные с помощью гель-фильтрации в невосстанавливающем ДСН-геле в виде полосы м.м. 35-40 кДа, пептического гидролиза и секвенирования полученных последовательностей трех пептидных фрагментов, подтвердили гомологию с GAPDH, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой.

Настоящее исследование позволяет разработать стратегию для идентификации фенотипических различий между нормальными и патологическими тканями и опосредованной идентификации генов, кодирующих дифференциально экспрессированные молекулы. Эта стратегия была применена для идентификации антигенов, ассоциированных со злокачественной опухолью толстой кишки, и антител, реагирующих с указанными антигенами. В более широкой перспективе разработанный способ может быть также применен в других областях исследования с использованием пар тканей, таких как нормальные ткани и воспалительные ткани, или зрелые и незрелые ткани для идентификации воспалительного заболевания или маркеров и мишеней для определения стадии развития.

Эффективность использования тканевых срезов в качестве антигенного источника для субтракции фаговых библиотек оценивали на модельных системах. Полная субстракция одного кодированного фагом связывающего антитела из другого может быть достигнута с использованием фага, кодирующего антитела scFv, представляющие собой широкореактивные (С215) и опухоль-специфические (1F) антитела. Этот последний способ является слегка упрощенным вариантом, поскольку антиген 1F слабо экспрессируется, но не полностью отсутствует на ткани тонкой кишки (Tordsson et al., находится на рассмотрении). Следовательно, малая субстракция также фага 1F может приводить к редуцированному разделению двух специфических фагов.

Кроме того, если вместо культивированных интактных клеток Соlо205 для стадии позитивного отбора использовали фиксированные ацетоном тканевых срезов опухоли Соlо205, растущих у мышей SCID (и тканевые срезы матки для стадии негативного отбора), то выход фага 1F снижался в 12-16 раз по сравнению с выходом фага С215 (фиг.2, данные не приводятся). Это можно объяснить тем, что антиген 1F чувствителен к фиксации, или тем, что связывание scFv фага 1F чувствительно к жестким промывкам, используемым в методе отбора, основанном на использовании тканей.

Добавление стадии негативного отбора с использованием срезов матки не влияло на относительный выход фага С215 и 1F из клеток в отличие от проведения лишь позитивного отбора (Tordsson et al., находится на рассмотрении), что подтверждает специфичность данной системы и негативную реакцию с тканями матки, наблюдавшуюся ранее в иммуногистохимическом анализе, проведенном с использованием указанных специфических антител.

В заключение можно сделать вывод, что, несмотря на отсутствие оптимального опухоль-специфического фага в данной модели, была продемонстрирована эффективность и специфичность в отношении адсорбции фага на ткани, что дает основу для разработки схемы субтрактивного отбора. Кроме того, повторение стадии адсорбции в каждом раунде отбора (с минимальной потерей выхода фага) или между раундами отбора будет приводить к увеличению эффективности адсорбции.

Поскольку отбор библиотеки был осуществлен перед тем, как был продемонстрирован тот факт, что повторяемые стадии негативной адсорбции в каждом раунде субстрактивного отбора были более эффективными, то во всех семи раундах отбора использовались только однократные адсорбции. Это может не быть недостатком. Можно ожидать, что различные мощности негативного отбора, достигаемые при проведении различного числа адсорбции в каждом раунде отбора, должны действовать подобно настройке. Благодаря этому можно добиться постепенного сдвига выхода отбора от антител против высоко (широко) экспрессируемых антигенов (отсутствие негативной адсорбции) в сторону антител против явно дифференциально экспрессированных антигенов (повторный негативный отбор).

Однако данные, полученные в экспериментах на моделях настоящего изобретения, показали, что сила позитивного отбора значительно выше, чем сила негативного отбора. Кроме того, некоторые из этих специфичностей были обнаружены при низких частотах в узком "окне" одного или двух раундов отбора, после которых, как было очевидно, продолжающиеся раунды отбора насыщали фильтр отбора, и состав специфических антител изменялся в сторону широко реактивных антител.

Наблюдения, проведенные в процессе субтрактивного отбора библиотек, включали множество раундов отбора, необходимых для получения высокого процента связывающего фага. Это должно быть сопоставимо с 2-3 раундами, обычно достаточными при позитивном отборе на клетках или тканевых срезах. Этот факт указывает на то, что данный отбор служил в качестве эффективного фильтра для большинства специфичностей в данной библиотеке и может служить основой для разработки оптимальной стратегии отбора. Так, например, меньший коэффициент обогащения позволяет использовать большее число опухолей перед достижением оптимального раунда отбора. Это должно сдвигать отбор в сторону идентификации обычно экспрессированных опухолеассоциированных антигенов.

Большинство моноклональных антител против опухолеассоциированных антигенов представляет собой мышиные антитела, продуцированные с использованием гибридомной технологии. Однако ответы антител, которые идентифицируют различия между малыми изменениями нормальных антигенов человека, таких как аллоантигены, в большинстве случаев успешно вырабатываются у человека и видов, близких к человеку.

Только часто встречающиеся ТАА являются особенно ценными мишенями для иммунотерапии большого числа пациентов. Это исключает возникновение уникальных мутаций, специфичных для опухоли отдельного индивидуума, хотя они представляют собой истинные опухолеспецифические антигены. Поскольку часто экспрессированные опухолеспецифические антигены в большинстве случаев являются нормальными или минимально модифицированными (например, посттрансляционно модифицированными) антигенами, то приматы, иммунизированные человеческими опухолями, могут быть превосходным источником антител к указанным опухолеассоциированным антигенам.

При объединении таких наборов с субтрактивным фаговым отбором может оказаться целесообразным последующее разделение данного набора, и выбор специфичностей может быть лучше проконтролирован. Идентификация совершенно отличной серии противоопухолевых антител из иммунной библиотеки злокачественных опухолей толстой кишки при субтрактивном отборе настоящего изобретения, основанном на использовании тканей, в отличие от прямого позитивного отбора (Tordsson et al., находится на рассмотрении), подтверждает эту гипотезу.

Отобранные клоны, представленные специфическим антителом К293, продемонстрировали в высокой степени гомогенное окрашивание всех тканей карциномы толстой кишки, включенных в данный протокол отбора, и очень ограниченную реактивность с эпителием нормальной толстой кишки. Фильтр для субтрактивного отбора, который определял узкую фенотипическую специфичность для обеспечения соответствующего отбора (прохождения), обнаруживал небольшое различие между нормальным эпителием и злокачественным эпителием толстой кишки, которое было аналогичным у шести пациентов, то есть пациентов, у которых брали каждую соответствующую пару тканей. Из анализа на специфичность было очевидно, что критерии, установленные для данного фильтра, почти полностью выполняются специфическим антителом типа К293.

Эукариотические клетки ранее были использованы для субтрактивных отборов в целях идентификации антигенов клеточной поверхности. Однако, в отличие от использования клеток для фагового отбора, тканевые срезы позволяют идентифицировать реагенты для всех компонентов тканей, экспрессируемых in vivo, включая антигены, регулируемые факторами внешней среды или структурами, окружающими ткань, которые невозможно или трудно репродуцировать in vitro.

Две из четырех протестированных клеточных линий злокачественных опухолей толстой кишки не экспрессировали какого-либо детектируемого уровня антигена К293 ни в in vitro-культивированных клетках, ни in vivo у мышей SCID. Кроме того, другие пять клеточных линий, культивированные in vitro, были негативными по экспрессии антигена (данные не показаны).

Очевидно, что постоянная и гомогенная экспрессия, наблюдаемая для антигена К293 во взятых от пациентов опухолях, в значительной степени снижается в случае, когда клетки злокачественных опухолей толстой кишки культивируют in vitro. Кроме того, указанная экспрессия не может быть индуцирована при росте клеток in vivo в ксеногенном хозяине.

Гибридный белок K293FabSEA/Ell представляет собой формат для расширенного анализа на специфичность К293, что позволяло увеличивать чувствительность и уменьшать фон. Было показано, что эта конструкция взаимодействует с большим числом карцином толстой кишки, молочной железы и легких. У большинства из этих опухолей анализ на K293FabSEA/E11 был на 90% или более положительным для злокачественных клеток. Эта реакция не ограничивалась лишь первичными опухолями, поскольку высокая частота возникновения метастазов злокачественных опухолей толстой кишки также обнаруживала сильную реактивность. С другой стороны, в клетках злокачественных опухолей предстательной железы или почек не наблюдалось какой-либо реакции, и наблюдалась лишь ограниченная реакция в злокачественной меланоме.

Реактивность нормальных тканей была обнаружена только в апикальной части эпителия толстой и тонкой кишки, в железистом эпителии и в окружающей его строме в нормальной молочной железе.

Электронная микроскопия ясно показала, что K293FabSEA/E11 связывается с антигеном, который экспрессировался на клеточной поверхности как нормальных, так и злокачественных клеток. В нормальной слизистой толстой кишки реакция локализуется в апикальной клеточной поверхности, относящейся к микроворсинкам поверхностных эпителиальных клеток. Апикальное окрашивание также преобладает в высокодифференцированных опухолях, тогда как низко-умеренно дифференцированные опухоли давали гомогенно положительную реакцию на всех участках клеточной поверхности.

Хотя K293FabSEA/E11 не реагировал с муциноподобным материалом в опухолевых железистых образованиях, указанный антиген не мог быть детектирован в пуле плазмы, взятой от пациентов со злокачественными опухолями толстой кишки. Этот пул обнаруживал высокие уровни антигена СА242 злокачественных опухолей толстой кишки, что указывало на высокую опухолевую нагрузку у этих пациентов. Поскольку K293FabSEA/E11 давал сильную положительную реакцию для 12 из 12 проанализированных первичных опухолей и для 3/4 метастазов толстой кишки, то это свидетельствует о том, что указанный эпитоп не экспрессируется в высокой степени на циркулирующем антигене.

K293FabSEA/E11 обнаруживает некоторые свойства, которые привлекают к нему интерес как к кандидату для нацеливания на опухоль, а именно: 1) он распознает высокую частоту позитивных первичных опухолей и метастазов, 2) он демонстрирует ограниченную реактивность по отношению к нормальным тканям, 3) он связывается с антигеном, который экспрессируется на поверхности опухолевых клеток, и 4) он связывается с антигеном, который не детектируется в периферической крови больных злокачественными опухолями.

Возможное использование K293FabSEA/E11 для нацеливания на опухоль, кроме того, было подтверждено в терапевтическом эксперименте с использованием мыши SCID, несущей "гуманизированную" опухоль. По сравнению с гибридным ненацеливающим контрольным белком FabSEA, K293FabSEA/E11 обнаруживал более чем 80%-ное снижение роста опухолей LS174Т в брюшной полости. Иммуногистохимическая оценка необработанных опухолей LS174T, растущих у мышей SCID, указывала на то, что с использованием K293FabSEA/E11 лишь 50% злокачественных клеток давали положительный результат (данные не приводятся). Это указывает на то, что некоторые K293Fab-негативные опухолевые клетки могут быть потенциально разрушены в результате эффекта воздействия на ближайшее окружение, возможно, путем высвобождения цитокина