Тест-набор для определения лекарственной чувствительности и первичной идентификации микобактерий туберкулеза

Тест-набор для определения лекарственной чувствительности и первичной идентификации микобактерий туберкулеза

Реферат

Изобретение относится к медицинской микробиологии, касается производства диагностических препаратов и может быть использовано при индивидуальном подборе лекарственных препаратов для лечения туберкулеза.

В практических лабораториях России для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза в основном используют среду Левенштейна-Йенсена лабораторного приготовления с добавлением противотуберкулезных препаратов, рекомендованную к применению Приказом МЗ РФ №109 (Приложение 11. Инструкция по унифицированным методам микробиологических исследований при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза) [1]. Однако использование этой среды позволяет получить данные о лекарственной чувствительности возбудителя лишь через 3-5 недель. Кроме этого среды лабораторного приготовления являются нестандартными, что приводит к получению недостоверных результатов.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является набор для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза «Mycobiogramme» производства французской фирмы «BioMerieux» [2], состоящий из пробирок со средой Левенштейна-Йенсена следующего состава, г/л:

калия дигидрофосфат	1,50 г
магния сульфат	0,15 г
магния цитрат	0,38 г
L-аспарагин	2,25 г
глицерин	7,50 мл
крахмал картофельный	18,75 г
малахитовый зеленый	0,25 г
яичная масса	625 мл
дистиллированная вода	375 мл

с добавлением противотуберкулезных препаратов в концентрациях, мкг/мл:

изониазид	0,1
изониазид	1,0
рифампицин	20,0
рифампицин	40,0
стрептомицин	4,0
стрептомицин	10,0
этамбутол	2,0
этамбутол	3,0
ПАСК (парааминосалициловая кислота)	0,5
ПАСК	1,0
пиразинамид	200,0

Определение лекарственной чувствительности микобактерий с использованием набора-прототипа проводят визуально по наличию видимого роста. Этот процесс длительный и занимает от 14 до 28 дней, что значительно осложняет своевременную корреляцию проводимого больному этиотропного лечения. Помимо этого набор - дорогостоящий и недоступен большинству практических лабораторий России.

Задачей настоящего изобретения является создание тест-набора для ускоренного определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза с их одновременной первичной идентификацией по появлению красной окраски.

Поставленная задача решается тем, что разработан тест-набор для определения лекарственной чувствительности и первичной идентификации микобактерий туберкулеза на основе среды Левенштейна-Йенсена с добавлением противотуберкулезных препаратов, отличающийся тем, что набор состоит из 8 флаконов со средой Левенштейна-Йенсена, дополнительно содержащей нитрат натрия или нитрат калия в концентрации 0,6-1,2 г/л, а крахмал - в растворимой форме в концентрации 15,0-20,0 г/л, при этом четыре флакона, предназначенные для определения лекарственной чувствительности, дополнительно содержат противотуберкулезные препараты, первый флакон - изониазид в концентрации 1 мкг/мл, второй флакон - рифампицин в концентрации 40 мкг/мл, третий - стрептомицин в концентрации 10 мкг/мл, четвертый - этамбутол в концентрации 2 мкг/мл, два флакона, предназначенные для первичной идентификации микобактерий туберкулеза, один из которых дополнительно содержит салицилат натрия в концентрации 1000 мкг/мл, а другой - 2-тиофенкарбоксигидразид в концентрации 2 мкг/мл, два флакона являются контрольными, и дополнительно набор содержит один флакон с реактивом Грисса для регистрации результатов по появлению красной окраски.

Предлагаемый тест-набор по сравнению с прототипом характеризуется короткими сроками 2-7 суток определения лекарственной чувствительности микобактерий по появлению красной окраски, возможностью в эти же сроки провести идентификацию микобактерий. Это достигается за счет

1) введения в среду Левенштейна-Йенсена крахмала в растворимой форме, что улучшает ростовые свойства среды, повышает скорость роста микобактерий, сокращает сроки учета результатов и не влияет на критические концентрации противотуберкулезных препаратов (табл.1, 2),

2) введения в среду нитрата натрия или калия, а в состав тест-набора реактива Грисса, что позволяет провести учет результатов по появлению красной окраски, не дожидаясь видимого роста микобактерий на среде.

3) использования в составе тест-набора одного флакона с салицилатом натрия и одного флакона с 2-тиофенкарбоксигидразидом, совокупность которых позволяет провести первичную идентификацию анализируемой культуры микобактерий (табл.3).

Таблица 1Влияние используемой формы крахмала на скорость роста M.tuberculosis
Микобактерии	Время культивирования при 37°С (сут.)	Контрольный флакон (Среда Левенштейна-Йенсена с нитратом натрия или калия)
крахмал в растворимой форме	крахмал картофельный (из прототипа)
М.tuberculosis 1	7	Красная окраска	Окраски нет
М.tuberculosis 2	7	Красная окраска	Розовая окраска
М.tuberculosis 3	7	Розовая окраска	Окраски нет
M.tuberculosis 4	6	Красная окраска	Розовая окраска
M.tuberculosis 5	5	Розовая окраска	Окраски нет
M.tuberculosis 6	5	Розовая окраска	Окраски нет
M.tuberculosis 7	6	Красная окраска	Окраски нет
M.tuberculosis 8	6	Красная окраска	Окраски нет
M.tuberculosis 9	4	Розовая окраска	Окраски нет
Красная окраска - характеризует интенсивный рост культурыРозовая окраска - характеризует слабый рост культурыОкраски нет - отсутствие роста культуры

Таблица 2Влияние формы крахмала на результаты определения лекарственной чувствительности M.tuberculosis
Исследуемый изолят	Срок наблюдения	Крахмал	Контроль	Контроль	Изониазид	Рифампицин	Стрептомицин	Этам-бутол	Натрия салицилат	ТКГ
М.tuberculosis H37Ra	7	Раств. форма	+	+	-	-	-	-	-	+
7	Карт.	+	+	-	-	-	+	-	+
М.tuberculosis Академия	7	Раств. форма	+	+	-	-	-	-	-	+
7	Карт.	+	+	+	-	+	-	-	+
М.tuberculosis 138	7	Раств. форма	+	+	-	-	+	-	-	+
7	Карт.	+	+	-	-	+	+	-	+
М.tuberculosis 8	7	Раств. форма	+	+	+	-	-	-	-	+
7	Карт.	+	+	+	+	-	-	-	+
M.tuberculosis 118	7	Раств. форма	+	+	-	+	-	-	-	+
7	Карт.	+	+	+	+	-	+	-	+
* + - наличие красной окраски во флаконах- - отсутствие красной окраски во флаконах

Пример 1.

Приготовление питательной среды. Навески ниже перечисленных ингредиентов питательной среды:

калия дигидрофосфат	1,50 г
натриянитрат	1,00 г
магния сульфат	0,15 г
магния цитрат	0,38 г
L-аспарагин	2,25 г
глицерин	7,50 мл
крахмал в растворимой форме	18,75 г
малахитовый зеленый	0,25 г

растворяют в указанной последовательности в 375 мл дистиллированной воды при подогревании, не доводя до кипения, и стерилизуют в автоклаве 20 мин при температуре 121°С.

После охлаждения к основе питательной среды добавляют 625 мл яичной массы, фильтруют.

Пример 2.

Питательную среду готовят, как описано в примере 1, но ингредиенты, отличающие среду от среды Левенштейна-Йенсена: калия нитрат и крахмал в растворимой форме, используют в следующих концентрациях:

калия нитрат	1,2 г
крахмал растворимый	20,0 г

Пример 3.

Питательную среду готовят, как описано в примере 1, но натрия нитрат и крахмал в растворимой форме, используют в следующих концентрациях:

калия нитрат	0,6 г
крахмал растворимый	15,0 г

Пример 4.

Приготовленную питательную среду в соответствии с примерами 1, 2, 3 разливают поровну в восемь стерильных колб.

В шесть колб вносят при перемешивании один из следующих препаратов:

изониазид - 0,125 мг,

рифампицин - 5 мг,

стрептомицин - 1,25 мг,

этамбутол - 0,25 мг,

натрия салицилат - 125 мг,

2-тиофенкарбоксигидразид (ТКГ) - 0,25 мг

для получения конечных концентраций изониазида - 1 мкг/мл, рифампицина - 40 мкг/мл, стрептомицина - 10 мкг/мл, этамбутола - 2 мкг/мл салицилата натрия - 1000 мкг/мл, ТКГ - 2 мкг/мл. Затем содержимое всех восьми колб разливают в стерильные флаконы и проводят термокоагуляцию.

Тест-набор комплектуют в соответствии с составом:

Питательная среда (контроль)	- 2 флакона,
Питательная среда с 1 мкг/мл изониазида	- 1 флакон,
Питательная среда с 40 мкг/мл рифампицина	- 1 флакон,
Питательная среда с 10 мкг/мл стрептомицина	- 1 флакон,
Питательная среда с 2 мкг/мл этамбутола	- 1 флакон,
Питательная среда с 1000 мкг/мл салицилата натрия	- 1 флакон,
Питательная среда с 2 мкг/мл ТКГ	- 1 флакон,
Реактив Грисса	- 1 флакон.

Хранение тест-набора осуществляют в темном месте при температуре 2-8°С не более 5 месяцев.

Пример 5.

Определение лекарственной чувствительности культур микобактерий проводят параллельно на предлагаемом тест-наборе и на наборе-прототипе. На тест-наборе дополнительно осуществляют первичную идентификацию микобактерий туберкулеза. Определение лекарственной чувствительности и первичную идентификацию микобактерий туберкулеза осуществляют методом, основанным на способности микобактерий туберкулеза восстанавливать нитраты в нитриты. Нитраты легко определяются с помощью реактива Грисса, который вызывает появление красной окраски. Определение лекарственной чувствительности микобактерий с использованием набора-прототипа осуществляют методом пропорций по наличию видимого роста.

Восемь флаконов с питательными средами предлагаемого тест-набора засевают культурами микобактерий туберкулеза в соответствии с Приказом МЗ РФ №109. Пробирки с питательными средами набора-прототипа засевают в соответствии с инструкцией по применению.

Учет результатов на прототипе проводят через 14-28 суток инкубирования посевов по наличию визуального роста микобактерий, на предлагаемом тест-наборе - через 2-7 суток по изменению окраски путем внесения реактива Грисса в виде водного 7,5% раствора реактива Грисса в количестве 0,5 мл или в сухом виде в количестве нескольких кристалликов в каждый из 8 флаконов тест-набора. Культура считается чувствительной к противотуберкулезному препарату, если во флаконе с данным препаратом не происходит появления красной окраски (при интенсивной окраске в контрольном флаконе). Культура считается устойчивой при появлении красной окраски во флаконе с противотуберкулезным препаратом.

Первичную идентификацию микобактерий туберкулеза проводят по появлению красной окраски во флаконе с ТКГ и отсутствию красной окраски во флаконе с салицилатом натрия. Нетуберкулезные микобактерии, обладающие способностью восстанавливать нитраты в нитриты, вызывают одновременное появление красной окраски во флаконах и с салицилатом натрия, и с ТКГ.

Результаты испытаний трех примеров тест-набора получились идентичными и представлены в таблицах 3,4.

Таблица 3Определение лекарственной чувствительности и первичная идентификация микобактерий
Исследуемый изолят	Срок наблюдения	Контроль	Натрия салицилат	ТКГ	Изониазид	Рифампицин	Стрептомицин	Этам-бутол
М. tuberculosis H37Ra	7	*+	-	+	-	-	-	-
М. tuberculosis 135	7	+	-	+	+	+	+	+
М. tuberculosis	6	+	-	+	+	-	-	-

Исследуемый изолят	Срок наблюдения	Контроль	Натрия салицилат	ТКГ	Изониазид	Рифампицин	Стрептомицин	Этам-бутол
138
М. kansasii 413	7	+	+	+	+	-	+	+
М. fortuitum 12	2	+	+	+	+	+	+	+
+ - наличие изменения окраски во флаконах- - отсутствие изменения окраски во флаконах

Данные, представленные в таблицах, позволяют охарактеризовать исследуемые культуры, как штамм М. tuberculosis H37Ra, чувствительный к четырем лекарственным препаратам; клинический изолят М. tuberculosis 135, устойчивый к изониазиду, рифампицину, стрептомицину, этамбутолу; клинический изолят М. tuberculosis 138, устойчивый к изониазиду, а также М. kansasii 413, устойчивый к изониазиду, стрептомицину, этамбутолу и М. fortuitum 12, устойчивый ко всем четырем противотуберкулезным препаратам, что полностью совпадает с результатами, полученными на наборе-прототипе.

Таблица 4Сроки определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза
Исследуемый материал	Сроки окончания наблюдения (сутки)	Совпадение результатов (%) по чувствительности
тест-набор	прототип
М tuberculosis 129	7	28	100
М. tuberculosis 131	6	28	100
М. tuberculosis 106	7	28	100
M. tuberculosis 112	5	28	100
M. tuberculosis 107	5	21	100

Исследуемый материал	Сроки окончания наблюдения (сутки)	Совпадение результатов (%) по чувствительности
тест-набор	прототип
М. tuberculosis 104	7	28	100
М. tuberculosis 156	6	28	100
M. tuberculosis 161	7	28	100
M. tuberculosis 130	7	28	100
M. tuberculosis 147	7	28	100
M. fortuitum 12	2	14	100
M. tuberculosis H37Ra	7	21	100
M. tuberculosis 135	5	21	100
M. tuberculosis 138	5	28	100

Из приведенных данных видно, что использование предлагаемого тест-набора приводит к сокращению сроков определения лекарственной чувствительности микобактерий до 2-7 суток по отношению к 14-28 суткам на наборе-прототипе при 100% совпадении результатов. Кроме определения лекарственной чувствительности предлагаемый тест-набор позволяет провести дополнительно первичную идентификацию микобактерий туберкулеза.

Предлагаемый тест-набор нетрудоемок и удобен в использовании, не требует дополнительного оборудования и специальной подготовки персонала, и что немаловажно, дешев, а по срокам определения лекарственной чувствительности приближается к автоматизированным системам типа ВАСТЕС.

Разработана технология и организовано производство промышленного изготовления тест-набора в удобной упаковке для транспортировки и последующей работы. Промышленное производство с осуществлением входного контроля сырья и контроля конечного продукта позволяет производить стандартные недорогие тест-наборы. Проведены клинические испытания тест-набора в пяти регионах страны при исследовании около 1000 клинических изолятов микобактерий туберкулеза, получены положительные результаты. Оформлен пакет научно-технической документации на производство тест-набора, который находится на утверждении в Фармакопейном комитете.

Использование во фтизиобактериологических лабораториях предлагаемого тест-набора промышленного изготовления позволит ускорить определение лекарственной чувствительности микобактерий, увеличить надежность получаемых результатов, а также даст возможность получать сравниваемые данные по регионам для точной оценки эпидемической ситуации в стране. А удобная форма выпуска в герметично закрытых флаконах и достаточный срок хранения позволяет доставлять и использовать тест-наборы в самых отдаленных регионах страны.

Источники информации

1. О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации. Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.03 г.

2. Culture Media Manual, bio Merieux, 1994 Edition.

Тест-набор для определения лекарственной чувствительности и первичной идентификации микобактерий туберкулеза на основе среды Левенштейна-Йенсена с добавлением противотуберкулезных препаратов, отличающийся тем, что набор состоит из 8 флаконов со средой Левенштейна-Йенсена, дополнительно содержащей нитрат натрия или нитрат калия в концентрации 0,6-1,2 г/л, а крахмал - в растворимой форме в концентрации 15,0-20,0 г/л, при этом четыре флакона, предназначенные для определения лекарственной чувствительности, дополнительно содержат противотуберкулезные препараты, первый флакон - изониазид в концентрации 1 мкг/мл, второй флакон - рифампицин в концентрации 40 мкг/мл, третий - стрептомицин в концентрации 10 мкг/мл, четвертый - этамбутол в концентрации 2 мкг/мл, два флакона, предназначенные для первичной идентификации микобактерий туберкулеза, один из которых дополнительно содержит салицилат натрия в концентрации 1000 мкг/мл, а другой - 2-тиофенкарбоксигидразид в концентрации 2 мкг/мл, два флакона являются контрольными, и дополнительно набор содержит один флакон с реактивом Грисса для регистрации результатов по появлению красной окраски.