Инкапсулирование полипептидов в матрицу крахмала

Инкапсулирование полипептидов в матрицу крахмала

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение заявляет приоритет по первой заявке США №60/026855 с датой подачи 30 сентября 1996 г. Указанная первая заявка на изобретение включена в настоящую заявку в объеме, не противоречащем данной заявке.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Полисахаридные ферменты

И прокариотные, и эукариотные клетки используют полисахаридные ферменты для резервного хранения. В прокариотной клетке первичным резервным полисахаридом является гликоген. Хотя гликоген родственен крахмалу, обнаруживаемому в большинстве сосудистых растений, он обладает другой длиной цепи и степенью полимеризации. Во многих растениях крахмал используется в качестве первичного резервного полисахарида. Крахмал хранится в различных тканях растения, вырабатывающего крахмал. В большинстве случаев крахмал состоит из двух компонентов; одним является амилоза, а другим - амилопектин. Амилоза образуется в виде линейных глюканов, а амилопектин - в виде разветвленных цепей глюканов. Типичный крахмал состоит на 25% из амилозы и на 75% из амилопектина. Изменение в растении соотношения между амилозой и амилопектином может повлиять на свойства крахмала. Кроме того, крахмалы из различных растений часто обладают различными свойствами. Кукурузный крахмал и картофельный крахмал, по-видимому, различаются по наличию или отсутствию фосфатных групп. Свойства крахмала некоторых растений различаются вследствие мутаций, введенных в геном растения. Мутантные крахмалы хорошо известны для кукурузы, риса и гороха и др.

Изменения в степени разветвленности крахмала или в соотношениях компонентов крахмала приводят к различающимся характеристикам крахмала. Одной из характеристик крахмала является формирование гранул крахмала, которые образуются, в частности, в листьях, корнях, клубнях и семенах. Эти гранулы образуются в процессе синтеза крахмала. Некоторые синтетазы крахмала, в особенности синтетаза, иммобилизованная на грануле крахмала, синтетазы растворимого крахмала и ветвящие ферменты, представляют собой белки, которые "инкапсулируются" в гранулу крахмала при ее формировании.

Использование кДНК клонов гликогенсинтетаз животных и бактерий описано в Международной патентной заявке № GB 92/01881. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности описаны в литературе. В частности, нуклеотидную последовательность для гена, кодирующего гликогенсинтетазу Е.coli, можно получить в базе данных GenBank/EMBL (SWISSPROT), инвентарный номер J02616 (Kumar et al., 1986, J. Biol. Chem., 261: 16256-16259). Структуральные гены фермента биосинтеза гликогена Е.coli также клонировали Okita et al. (1981, J. Biol. Chem., 256 (13): 6944-6952). Структуральные гены гликогенсинтетазы glgA клонировали из Salmonella typhimurium LT2 Leung et al. (1987, J. Bacteriol., 169 (9): 4349-4354). Также известны последовательности гликогенсинтетазы скелетной мышцы кролика (Zhang et al., 1989, FASEB J., 3: 2352-2356) и мышцы человека (Browner et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 1443-1447).

Описано применение клонов кДНК синтетаз растворимого крахмала растений. Аминокислотные последовательности изоформ I и II синтетазы растворимого крахмала гороха опубликовали Dry et al. (1991, Plant Journal, 2: 193-202). Аминокислотные последовательности синтетазы растворимого крахмала риса описали Baba et al. (Plant Physiology). В этой последней последовательности (SSTS риса) приведена неправильная N-концевая последовательность и, следовательно, она является ошибочной. По-видимому, это вызвано какой-то ошибкой экстракции, включающей деструкцию протеазы или другой характерной нестабильностью экстрагированного фермента. Правильная N-концевая последовательность (начинающаяся с AELSR) приведена в той области, которую они называют транзитной пептидной последовательностью SSTS риса.

Последовательность для ветвящего фермента I кукурузы исследовали Baba et al., 1991, BBRC, 18: 8794. Ветвящий фермент II эндосперма кукурузы исследовали Fisher and Shrable (1993, Plant Physiol., 102: 1045-1046). Описано применение клонов кДНК ветвящих ферментов растений, бактерий и животных. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности ветвящих ферментов (BE) бактерий описана в литературе. В частности, Kiel et al. клонировали ген glgB ветвящего фермента Cyanobacterium synechococcussp PCC7942 (1989, Gene (Amst), 78 (I): 918) и Bacillus stearothermophilus (Kiel et al., 1991, Mol. Gen. Genet. 230 (12): 136-144). Гены glc3 и ghal S. cerevisiae являются аллельными и кодируют ветвящий фермент гликогена (Rowen et al., 1992, Mol. Cell Biol, 12 (I): 22-29). Matsumomoto et al. исследовали ветвящий фермент гликогена Neuruspora crassa (1990, J. Biochem., 107: 118-122). База данных GenBank/EMBL также содержит последовательности для гена glgB, кодирующего ветвящий фермент Е.coli.

Синтетаза крахмала (ЕС 2.4.1.11) удлиняет молекулы крахмала и предполагается, что она действует и на амилозу, и на амилопектин. Можно показать, что активность синтетазы крахмала (STS) связана и с гранулой, и с пластидой стромы. Способность крахмала ассоциироваться с иммобилизованным ферментом синтетазой крахмала хорошо известна. В настоящее время из работы Mu-Foster et al. (Plant Phys., 111: 821-829) известно, что различные ферменты, участвующие в биосинтезе крахмала, обладают различной склонностью к связыванию. Активность иммобилизованной на грануле синтетазы крахмала (GBSTS) сильно коррелирует с выработкой восковидного гена (Shure et al., 1983, Cell, 35: 225-233). Показано, что синтез амилозы в различных видах растений, таких как кукуруза, рис и картофель, зависит от экспрессии этого гена (Tsai, 1974, Biochem. Gen., 11: 83-96; Hovenkamp-Hermelink et al., 1987, Theor. Appl. Gen., 75: 217-221). Visser et al. описали молекулярное клонирование и частично охарактеризовали этот ген для иммобилизованной на грануле синтетазы крахмала картофеля (1989, Plant Sci. 64 (2): 185-192). Visser et al. также описали ингибирование экспрессии этого гена для иммобилизованной на грануле синтетазы крахмала картофеля с помощью обращенной конструкции (1991, Mol. Gen. Genet., 225 (2): 289-296).

После пионерской работы Frydman and Cardini (Frydman and Cardini, 1964, Biochem. Biophys. Res. Communications, 17: 407-411) стали известны другие STS ферменты, представляющие собой синтетазы растворимого крахмала. В свете обнаружения того, что эти ферменты и ассоциированы с гранулой, и присутствуют в растворенной фазе (Denyer et al., 1993, Plant J. 4: 191-198; Denyer et al., 1995, Planta, 97: 57-62; MuFoster et al., Plant Physiol. III: 821-829), недавно была поставлена под сомнение применимость термина "растворимый". Обычно полагают, что биосинтез амилопектина происходит с участием синтетаз растворимого крахмала и ферментов, ветвящих крахмал. Различные изоформы синтетазы растворимого крахмала были идентифицированы и клонированы для гороха (Denyer and Smith, 1992, Planta, 186: 609-617; Dry et al., 1992, Plant Journal, 2: 193-202), картофеля (Edwards et al., 1995, Plant Physiol. 112: 89-97; Marshall et al., Plant Cell, 8: 1121-1135) и риса (Baba et al., 1993, Plant Physiol. 103: 565-573), тогда как ячмень, видимо, содержит множество изоформ, часть из которых ассоциирована с ферментом, ветвящим крахмал (Tyynela and Schulman, 1994, Physiol. Plantarum, 89: 835-841). Общей характеристикой STS клонов является наличие согласованной последовательности KXGGLGDV, которая предположительно является сайтом фермента, связывающим АДФ-Glc (Furukawa et al., 1990, J. Biol. Chem., 265: 2086-2090; Furukawa et al., 1993, J. Biol. Chem., 268: 23837-23842).

Для кукурузы идентифицированы две растворимые формы STS, известные под названием изоформ I и II (Macdonald and Preiss, 1983, Plant Physiol. 73: 175-178; Boyer and Preiss, 1978, Carb. Res. 61: 321-334; Pollock and Preiss, 1980, Arch. Biochem. Biophys. 204: 578-588; Macdonald and Preiss, 1985, Plant Physiol. 78: 849-852; Dang and Boyer, 1988, Phytochemistry, 27: 1255-1259; Mu et al., 1994, Plant J. 6: 151-159), однако ни одна из них не была клонирована. STSI активность эндосперма кукурузы недавно была скоррелирована с полипептидом с молекулярной массой 76 кДа, обнаруженном и в растворимой, и в ассоциированной с гранулами фракциях (Mu et al., 1994, Plant J. 6: 151-159). Полипептидная идентичность STSII остается неизвестной. STSI и II обладают различными ферментативньми характеристиками. STSI обладает активностью, не зависящей от праймера, тогда как STSII для катализа переноса гликозильного фрагмента требует присутствия гликогенового праймера. Показано, что синтетазы растворимого крахмала обладают большим коэффициентом контроля потока для осаждения крахмала (Jenner et al., 1993, Aust. J. Plant Physiol. 22: 703-709; Keeling et al., 1993, Planta, 191: 342-348) и необычными кинетическими характеристиками при повышенных температурах (Keeling et al., 1995, Aust. J. Plant Physiol. 21: 807-827). У кукурузы соответствующие изоформы обладают значительными различиями и по оптимумам температуры, и по стабильности.

Последовательности синтетазы крахмала растений (и синтетазы Е.coli) включают последовательность KTGGL, для которой известно, что она представляет собой домен, связывающий ADPG. Гены любой такой синтетазы крахмала можно использовать в конструкциях, соответствующих настоящему изобретению.

Ветвящий фермент [α1,4Dглюкан: α1,4Dглюкан 6D(α1,4Dглюкано)трансфераза (Е.С.2.4.1.18)], иногда называемый Q-ферментом, превращает амилозу в амилопектин.

Сегмент α1,4Dглюкановой цепи переносится к первичной гидроксильной группе аналогичной глюкановой цепи.

Описаны последовательности генов ветвящих ферментов бактерий и растений (эндосперма риса: Nakamura et al., Physiologia Plantarum, 84: 329-335 и Nakamura and Yamanouchi, 1992, Plant Physiol., 99: 1265-1266; горох: Smith, 1988, Planta, 175: 270-279 Bhattacharyya et al., 1989, J. Cell Biochem., Suppl. 13D: 331; Sing and Preiss, 1985, Plant Physiology, 79: 34-40; VosScherperkeuter et al., 1989, Plant Physiology, 90: 75-84; картофель: Kossmann et al., 1991, Mol. Gen. Genet., 230 (12): 39-44; маниока: Salehuzzaman and Visser, 1992, Plant Mol. Biol., 20: 809-819).

В области полисахаридных ферментов имеются сообщения о векторах для проводимой с помощью генной инженерии модификации метаболизма крахмала растений путем использования целого ряда генов синтеза крахмала для различных видов растений. Хорошо известно, что некоторые из этих полисахаридных ферментов связываются с целлюлозой, крахмалом или гликогеном. В одном конкретном запатентованном примере применения полисахаридного фермента продемонстрировано использование ферментов биосинтеза гликогена для модификации растительного крахмала. В патенте США №5349123, выданном Shewmaker, исследован вектор, содержащий ДНК и вырабатывающий ферменты биосинтеза гликогена в клетках растений. Более конкретно, в этом патенте описаны изменения картофельного крахмала, вызванные интродукцией этих ферментов. Также описаны другие гены синтеза крахмала и их применение.

Гибридные (полученные путем слияния) пептиды

Гибридные белки (также называемые белками, полученными путем слияния) представляют собой полипептидные цепи, которые состоят из двух или большего количества белков, слитых друг с другом в единый полипептид. Часто один из белков представляет собой лиганд, который присоединяется к специфической рецепторной клетке. Векторы, кодирующие гибридные пептиды, в первую очередь используются для выработки чужих белков путем ферментации микроорганизмов. Полученные гибридные белки можно очистить с помощью афинной хроматографии. Связывающая область одного из полипептидов используется для присоединения гибридного полипептида к афинной матрице. Например, можно получить гибридные белки с бета-галактозой, которую можно иммобилизировать на хроматографической колонке. Этот способ использовали для получения вирусных антигенов.

Другим случаем применения является извлечение одного из полипептидов из гибридного полипептида. Для расщепления гибридных полипептидов имеются химические и биологические методы. Если между пептидами имеется разрушающаяся при действии кислоты аспартил-пролиновая связь и кислота не действует на пептиды, то для расщепления пептидов можно использовать низкое значение рН. Гормоны расщепляли с помощью бромциана. Также описано расщепление с помощью сайт-специфичного протеолиза. Другие методы очистки белков, такие как ионная хроматография, были сделаны более эффективными путем использования полиаргининовых концевых сегментов, которые увеличивают общую основность белка, тем самым усиливая связывание с ионообменными колонками.

В целом ряде патентов описаны улучшения способов получения гибридных пептидов или специфических гибридных пептидов, предназначенных для конкретных целей. В патенте США №5635599, выданном Pastan et al., описано улучшение гибридных белков. В этом патенте описан подвергнутый кольцевой перестановке лиганд, являющийся частью гибридного пептида. Этот лиганд обладает специфичностью и хорошей связывающей способностью. Другое улучшение для гибридных белков описано в патенте США №5648244, выданном Kulopulos. В этом патенте описан способ получения гибридного пептида с помощью пептида-переносчика. Эта область нуклеиновой кислоты, распознанная рестриктазой, порождает непалиндромный свободный конец длиной в 3 основания. Это создает возможность расщепления вектора.

Пример созданного для особой цели гибридного белка приведен в патенте США №5643756. В этом патенте описан вектор для экспрессии гликозилированных белков в клетки. Этот гибридный белок адаптирован для использования при иммунных реакциях gp120 ВИЧ. Этот вектор улучшает выделение доменов gp120, которые являются сильно гликозилированными.

В патентах США №№5202247 и 5137819 обсуждены гибридные белки, обладающие полисахаридными связывающими доменами, и способы и композиции для получения гибридных белков, которые способны к связыванию с полисахаридной матрицей. В патенте США №5202247 особо рассмотрен гибридный белок, присоединяющий связывающий участок целлюлазы к нужному пептиду. В этом патенте показано, что гибридный белок после экспрессии в бактериального хозяина можно очистить с помощью афинной хроматографии на целлюлозе.

Разработка методов генной инженерии сделала возможным перенос генов из различных организмов и растений в другие организмы и растения. Хотя при трансформации крахмал подвергается изменениям, а в дальнейшем и мутагенезу, все же сохраняется потребность в дополнительной модификации крахмала. Для этой цели необходимы векторы, которые обеспечивают инкалсулирование нужных аминокислот или пептидов в крахмал, а конкретно, в гранулу крахмала. Модифицируется образовавшийся крахмал и модифицируется ткань растения, содержащего этот вектор.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложен гибридный полипептид, содержащий инкапсулирующуюся в крахмал область (SER) из связывающего крахмал фермента, который присоединен к полезному полипептиду, который не является эндогенным по отношению к указанной инкапсулирующейся в крахмал области, т.е. не встречается в природе присоединенным к инкапсулирующейся в крахмал области. Этот гибридный полипептид применим для получения модифицированных крахмалов, содержащих указанный полезный полипептид. Такие модифицированные крахмалы можно применять для получения зерновых кормов, обогащенных некоторыми аминокислотами. Такие модифицированные крахмалы также пригодны для получения полипептидов, таких как гормоны и другие лекарственные препараты, например, инсулин, в инкапсулированной в крахмал форме, что замедляет их разрушение кислотами, находящимися в желудке. Эти гибридные полипептиды также применимы для получения указанных полезных полипептидов в форме, легко поддающейся очистке. В частности, такие гибридные полипептиды, полученные бактериальным брожением, или в зернах, или в животных, с помощью известных специалистам способов можно выделить и очистить от модифицированных крахмалов, с которыми они ассоциированы.

В настоящем патенте термин "полипептид" означает множество одинаковых или различных аминокислот, он также охватывает белки.

Термин "гибридный полипептид" означает полипептид, образованный пептидами или полипептидами, взятыми не менее чем из двух источников, например, инкапсулирующаяся в крахмал область связывающего крахмал фермента, соединенная с другим полипептидом, таким как гормон, отличающаяся тем, что не менее двух компонентов гибридного полипептида не встречаются в природе в соединенном друг с другом виде.

Термин "полезный полипептид" означает полипептид, не эндогенный по отношению к инкапсулирующемуся в крахмал участку, экспрессия которого в ассоциации с этой областью направлена на экспрессию модифицированного крахмала, содержащего полезный полипептид.

Если полезный полипептид необходимо использовать для увеличения содержания конкретных аминокислот в модифицированном крахмале, он предпочтительно содержит более трех различных типов аминокислот, выбранных из группы, включающей: Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val.

Если полезный полипептид необходимо использовать для подачи биологически активного полипептида в организм-хозяин или в другой организм, этот полезный полипептид может представлять собой биологически активный полипептид, такой как гормон, например, инсулин, фактор роста, например, соматотропин, антитело, фермент, иммуноглобулин или краситель, или может представлять собой их биологически активный фрагмент, как это известно специалистам. Если этот полипептид обладает биологической активностью, он не должен представлять собой природный полипептид, а должен быть подвергнут мутации, усечению или модифицирован каким-либо другим образом. Такие биологически активные полипептиды могут представлять собой модифицированные полипептиды, содержащие только биологически активные области биологически активных полипептидов. Они также могут представлять собой аминокислотные последовательности, гомологичные природным биологически активным аминокислотным последовательностям (предпочтительно гомологичными не менее чем примерно на 75%), которые сохраняют биологическую активность.

Инкапсулирующаяся в крахмал область гибридного полипептида может представлять собой инкапсулирующуюся в крахмал область любого известного специалистам связывающегося с крахмалом фермента, например, фермента, выбранного из группы, включающей синтетазу растворимого крахмала I, синтетазу растворимого крахмала II, синтетазу растворимого крахмала III, синтетазу, иммобилизованную на грануле крахмала, ветвящий фермент I, ветвящий фермент IIa, ветвящий фермент IIBb и глюкоамилазные полипептиды.

Если гибридный полипептид необходимо использовать для получения полезного полипептида в чистом или частично очищенном виде, предпочтительно, чтобы гибридный полипептид включал расщепляющийся центр, расположенный между областью, инкапсулирующейся в крахмал, и полезным полипептидом. Тогда способ выделения полезного полипептида включает стадию взаимодействия гибридного полипептида с расщепляющим агентом, специфичным для данного расщепляющегося центра.

В настоящем изобретении также предложены молекулы рекомбинантных нуклеиновых кислот (РНК или ДНК), кодирующие гибридные полипептиды. Предпочтительно, чтобы такие молекулы рекомбинантных нуклеиновых кислот включали регулярные последовательности, адаптированные для экспрессии гибридного полипептида в выбранного хозяина. Термин "регулярные последовательности" включает промоторы, интроны, предпочтительно кодонные последовательности для конкретного организма-хозяина, и другие последовательности, которые, как известно специалистам, влияют на экспрессию ДНК или РНК в конкретных хозяев. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие инкапсулирующуюся в крахмал область и полезный полипептид, могут представлять собой природную последовательность нуклеиновых кислот или их биологически активные фрагменты, или могут представлять собой биологически активные последовательности, гомологичные таким последовательностям, предпочтительно гомологичные таким последовательностям не менее чем примерно на 75%.

К организмам-хозяевам относятся бактерии, растения и животные. Предпочтительными хозяевами являются растения. Для экспрессии гибридных полипептидов, соответствующих настоящему изобретению, пригодны и однодольные растения и двудольные растения.

В настоящем изобретении также предложены экспрессирующие векторы, включающие нуклеиновые кислоты, кодирующие гибридные белки, соответствующие настоящему изобретению. Эти экспрессирующие векторы используются для трансформации нуклеиновых кислот в организмы-хозяева и также могут включать последовательности, способствующие экспрессии нуклеиновых кислот в организм-хозяин. Эти экспрессирующие векторы могут представлять собой плазмиды, модифицированные вирусы или молекулы ДНК или РНК, или другие векторы, которые, как это известно специалистам, пригодны для трансформирующих систем.

С помощью способов, соответствующих настоящему изобретению, образуются трансформированные клетки, содержащие молекулы рекомбинантных нуклеиновых кислот, способные к экспрессии гибридных полипептидов, соответствующих настоящему изобретению. Они могут представлять собой прокариотные или эукариотные клетки одноклеточных организмов, растений или животных. Они могут представлять собой клетки бактерий, из которых можно выделить гибридный полипептид. Также они могут представлять собой растительные клетки, которые можно внедрить обратно в растения, из которых можно выделить гибридный полипептид, или же такие растительные клетки можно внедрить обратно в плодоносящие растения, семена которых содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие гибридный полипептид. В предпочтительном способе реализации настоящего изобретения такие семена содержат модифицированный крахмал, включающий этот полезный полипептид.

Термин "модифицированный крахмал" означает природный крахмал, который был модифицирован путем включения полезного полипептида.

Также предложен способ селективного ферментативного гидролиза полезного полипептида на особой фазе процесса ферментативного гидролиза, в частности, предотвращающий разрушение полезного полипептида в желудке животных, включающий кормление животных модифицированным крахмалом, соответствующим настоящему изобретению и содержащим полезный полипептид, вследствие чего этот полипептид защищен крахмалом от разрушения в желудке животного. Альтернативно, этим крахмалом может быть крахмал, для которого известно, что он гидролизуется в желудке животного с выделением в нем полезного полипептида.

Предпочтительные молекулы рекомбинантных нуклеиновых кислот, соответствующие настоящему изобретению, включают ДНК, кодирующие инкапсулирующие крахмал области, выбранные из синтезирующих крахмал последовательностей генов, приведенных в соответствующих таблицах.

Предпочтительные плазмиды, соответствующие настоящему изобретению, адаптированы для применения с конкретными хозяевами. В настоящем изобретении предложены плазмиды, включающие промотор, последовательность, кодирующую синтез пластиды, последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую инкапсулирующуюся в крахмал область, и терминаторную последовательность. Такие плазмиды пригодны для включения нуклеотидных последовательностей ДНК, кодирующих полезные полипептиды и инкапсулирующиеся в крахмал области для экспрессии в выбранных хозяев.

Плазмиды, соответствующие настоящему изобретению, факультативно могут включать разделительное или связующее звено, расположенное вблизи центра слияния нуклеиновых кислот, кодирующих SER, и нуклеиновых кислот, кодирующих полезный полипептид. Настоящее изобретение включает плазмиды, содержащие промоторы, адаптированные для прокариотных или эукариотных хозяев. Такие промоторы также могут быть специфично адаптированы для экспрессии в однодольные или двудольные растения.

Способ получения модифицированного пептидом крахмала, соответствующего настоящему изобретению, включает стадии: предоставления плазмиды, обладающей промотором, ассоциированным с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей инкапсулирующуюся в крахмал область, причем последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая инкапсулирующуюся в крахмал область, соединена с областью нуклеиновой кислоты, кодирующей полезный полипептид, и трансформации хозяина с помощью плазмиды, причем хозяин подвергает экспрессии модифицированный пептидом крахмал.

Настоящее изобретение дополнительно включает содержащие крахмал зерна, состоящие из: зародыша и питательных тканей; и модифицированные гранулы крахмала, содержащие инкапсулированный в них белок, который не является эндогенным по отношению к немодифицированным гранулам крахмала указанных зерен. Такие зерна, содержащие крахмал, могут представлять собой зерна, в которых зародышем является зародыш кукурузы, зародыш риса или зародыш пшеницы.

Все публикации, цитированные в настоящем патенте, включены только для ссылки в степени, не противоречащей настоящему патенту.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На ФИГ.1а приведена плазмида pEXS114, которая содержит синтетический GFP (зеленый флуоресцирующий белок), субклонированный в pBSK Stratagen.

На ФИГ.1b приведена плазмида pEXS115.

На ФИГ.2а приведен восковидный ген с сайтом рестрикции, субклонированным в продажную плазмиду.

На ФИГ.2b приведена плазмида р ЕТ-21А производства фирмы Novagen, содержащая субклонированный фрагмент GFP из pEXS115.

На ФИГ.3а приведена pEXS114, субклонированная в pEXSWX, и карта GFP-FLWX.

На ФИГ.3b приведена плазмида GFP-Bam HIWX.

На ФИГ.4 приведен фрагмент SGFP из pEXS115, субклонированный в pEXSWX, и карта GFP-NcoWX.

На ФИГ.5 приведено линейное представление плазмиды, которая адаптирована для использования в однодольных растениях.

На ФИГ.6 приведена плазмида pEXS52.

На ФИГ.7a-7f приведены шесть интродукционных плазмид, использованных для получения pEXS51 и рЕХ560:

На ФИГ.7а приведена pEXS adh1.

На ФИГ.7b приведена pEXS adhl-nos3'.

На ФИГ.7с приведена pEXS33.

На ФИГ.7d приведена pEXS10zp.

На ФИГ.7е приведена pEXS10zp-adh1.

На ФИГ.7f приведена pEXS10zp-adh1-nos3.

На ФИГ.8а и 8b приведены плазмиды pEXS50 и pEXS51 соответственно, содержащие ген MS-SIII, который представляет собой ген синтетазы растворимого крахмала.

На ФИГ.9а приведена плазмида pEXS60, которая не включает интрон, приведенный для pEXS50, а на ФИГ.9b приведена плазмида pEXS61, которая не включает интрон, приведенный для pEXS60.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В широком смысле, в настоящем изобретении предложен гибридный полипептид, способ получения гибридного полипептида и нуклеиновые кислоты, кодирующие этот гибридный полипептид. Гибридный полипептид состоит из двух или большего количества фрагментов, соединенных в одну пептидную цепь. Этими фрагментами могут быть аминокислоты, пептиды или полипептиды. Один из фрагментов представляет собой область, инкапсулирующуюся в крахмал. Таким образом, гибридные полипептиды можно направить в гранулы крахмала, выработанные организмами, экспрессирующими гибридные полипептиды.

Способ получения гибридных полипептидов в клетках включает получение конструкции ДНК, содержащей хотя бы фрагмент ДНК, кодирующий последовательность, действие которой заключается в связывании продукта экспрессии присоединенной ДНК с гранулой крахмала, к которому присоединена нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая нужный полипептид (полезный полипептид). Эта конструкция экспрессируется с эукариотной или прокариотной клеткой. Гибридный полипептид можно использовать для получения очищенного белка или для иммобилизации нужного белка на грануле крахмала или для получения зерна, которое содержит чужие аминокислоты или пептиды.

Гибридные полипептиды, соответствующие настоящему изобретению, содержат три области.

Полезный полипептид (X)	Центральный сайт (CS*)	Сайт, инкапсулирующий в крахмал (SER)
Где Х - любая нужная аминокислота или пептид,* - факультативный компонент.

Ген для Х можно расположить в положении 5' или 3' конструкции ДНК, описанной ниже.

CS - это центральный сайт, который может представлять собой уходящий сайт, сайт расщепления или разделительный сайт, как это известно специалистам. Сайт расщепления распознается расщепляющим ферментом. Расщепляющий фермент представляет собой фермент, который расщепляет пептиды на конкретном сайте. Примеры химикатов и ферментов, который можно использовать для расщепления полипептидов, включают тромбин, трипсин, бромциан, муравьиную кислоту, гидроксиламин, коллагеназу и аласубтилизин. Разделитель представляет собой пептид, который соединяет пептиды, образующие гибридный полипептид. Обычно он не обладает никакой специфической активностью кроме способности соединять пептиды или сохранять некоторое минимальное расстояние, или влиять на укладку, заряд или присоединение воды к белку. Разделителями могут являться любые пептидные последовательности, биологическая активность которых не препятствует активности гибридного полипептида.

Область, инкапсулирующаяся в крахмал (SER), представляет собой область рассматриваемого полипептида, которая обладает способностью связываться с крахмалом. Обычно SER выбирают из группы, включающей пептиды, содержащие связывающиеся с крахмалом области синтетаз крахмала и ветвящие ферменты растений, но эта группа может включать и связывающиеся с крахмалом домены других систем, таких как глюкоамилаза и аналогичные. В предпочтительной реализации настоящего изобретения SER включает пептидные генные продукты, которые входят в природный цикл синтеза крахмала. Эта подгруппа предпочтительных SER называется образующими крахмал инкапсулирующими областями (SFER). Другой подгруппой SER, предпочтительной в соответствии с настоящим изобретением, являются специфические инкапсулирующие в крахмал области (SSER) из специфических ферментов синтетазы крахмала (STS), иммобилизованная на грануле синтетаза крахмала (GBSTS) и ветвящие ферменты (BE) растений, содержащих крахмал. Наиболее предпочтительным генным продуктом из этой подгруппы является GBSTS. Кроме того, применимыми генными продуктами являются синтетаза крахмала I и ветвящий фермент II. Предпочтительно, чтобы SER (и все рассмотренные выше подгруппы) представляли собой усеченные варианты полного гена фермента, синтезирующего крахмал, такие чтобы усеченный фрагмент включал инкапсулирующую в крахмал область.

Конструкция ДНК для экспрессии гибридного полипептида в хозяина в широком смысле имеет следующий вид:

Промотор	Интрон*	Область кодирования транзитного пептида	Х	SER	Терминатор
* Факультативный компонент. Можно также использовать другие факультативные компоненты.

Как известно специалистам, промотор представляет собой область ДНК, контролирующую транскрипцию. Для различных хозяев выбираются различные типы промоторов. Промоторы Lac и Т7 хорошо подходят для прокариотов, промотор 35S CaMV хорошо подходит для двудольных растений, а полиубикитиновый промотор хорошо подходит для различных однодольных растений. Специалистам известно много различных промоторов и все они могут быть использованы в соответствии с областью применения настоящего изобретения.

Как также известно специалистам, интрон представляет собой нуклеотидную последовательность гена, которая не кодирует генный продукт. Одним примером интрона, который часто увеличивает экспрессию в случае однодольных растений, является интрон Adh1. Этот компонент конструкции является факультативным.

Область кодирования транзитного пептида представляет собой нуклеотидную последовательность, которая кодирует транслокацию белка в органеллы, такие как пластиды. Предпочтительно выбирать такой транзитный пептид, который распознает хозяина и совместим с хозяином, в котором используется транзитный пептид. В соответствии с настоящем изобретением наилучшей пластидой является амилопласт.

Предпочтительно, чтобы гибридный полипептид располагался в амилопласте в клетках, таких как растительные клетки, которые синтезируют и хранят крахмал в амилопластах. Если хозяин представляет собой бактериальную или иную клетку, которая не содержит амилопласта, там не должно быть области кодирования транзитного пептида.

Терминатор представляет собой нуклеотидную последовательность ДНК, которая заканчивает транскрипцию.

Х представляет собой область, кодирующую полезный полипептид, которым может являться любой представляющий интерес полипептид или цепи аминокислот. Он может включать полную последовательность известного полипептида или нужные его фрагменты. Полезный полипептид может представлять собой полипептид, его фрагмент или биологически активный белок, который представляет собой гормон, фактор роста, иммуноглобулин, краситель и т. п. Примеры некоторых полезных полипептидов, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, включают следующие (но не ограничиваются ими): пролактин (PRL), сывороточный альбумин, факторы роста и гормоны роста, т.е. соматотропин. Сывороточные альбумины включают сывороточные альбумины крупного рогатого скота, овцы, лошади, птицы и человека. Факторы роста включают эпидермальный фактор роста (EGF), инсулиноподобный фактор роста I (IGF-I), инсулиноподобный фактор роста II (IGF-II), фибробластовый фактор роста (FGF), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-alpha), трансформирующий фактор роста бета (TGF-beta), нервный фактор роста (NGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), и рекомбинантные инсулиноподобные факторы роста человека I (rHuIGF-I) и II (rHuIGF-II). Соматотропины, которые можно использовать в практике настоящего изобретения, включают следующие (но не ограничиваются ими): соматотропины крупного рогатого скота, свиньи, овцы, лошади, птицы и человека. Соматотропин свиньи включает рекомбинантный соматотропин свиньи дельта-7, который описан и патентная формула которого заявлена в Европейском патенте №104920 (Biogen). Предпочтительными полезными полипептидами являются соматотропин, инсулиновые цепи А и В, кальцитонин, бета-эндорфин, урогастрон, бета-глобин, миоглобин, гормон роста человека, ангиотензин, пролин, протеазы, бета-галактозидаза и целлюлазы.

Гибридный полипептид, область SER и полезный полипептид после трансляции также могут подвергаться модификациям, известным специалистам, таким как гликозилирование, ацилирование, и другим модификациям, не препятствующим проявлению требуемой активности полипептида.

Формирование гибридного полипептида

Область SER имеется в генах, участвующих в синтезе крахмала. Методы выделения таких генов включают поиск в библиотеках геномных ДНК и кДНК. Гены можно вырезать и изменить с помощью сшивания, мутирующих агентов, ферментативного гидролиза, рестрикции и других аналогичных процедур, например, таких, которые описаны в руководстве Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, N. Y. Примеры превосходных исходных материалов для получения области SER включают следующие (но не ограничиваются ими): синтетазы крахмала I, II, III, IV, ветвящие ферменты I, IIA и В и иммобилизованную на грануле синтетазу крахмала (GBSTS). Эти гены имеются в растениях, содержащих крахмал, таких как рис, кукуруза, горох, картофель, пшеница и др. Использование пробы SER, приготовленной из геномной ДНК, или кДНК, или мРНК или антител, вырабатываемых в ответ на SER, позволяет выделить и идентифицировать гены, пригодные для клонирования. Последовательности, кодирующие фермент крахмала, можно модифицировать, если эта модификация не мешает способности области SER инкапсулировать связанные с ней полипептиды.

Если гены, кодирующие белки, которые инкапсулируются в гранулу крахмала, найдены, то, как известно специалистам, для выделения SER можно использовать различные подходы. Одним способом является вырезание генов из различных сайтов с помощью рестриктаз, удаление участков с N-конца и выполнение экспрессии полученного белка. Экспрессированный усеченный белок затем наносится на гель крахмала для оценки констант ассоциации и диссоциации оставшегося белка. К усеченному белку могут быть присоединены маркерные гены, известные специалистам, например, ген зеленого флуоресцентного белка, и использованы для установления наличия маркерного гена в грануле крахмала.

После выделения области генной последовательности SER ее можно использовать для получения генной последовательности фрагмента, которая будет экспрессировать полезный полипептид, инкапсулированный в крахмал. Генная последовательность SER и генная последовательность, кодирующая полезный полипептид, могут быть сшиты друг с другом. Полученная сшитая ДНК затем может быть помещена в ряд векторных конструкций для экспрессии в ряд хозяев. Предпочтительные хозяева формируют гранулы крахмала в пластидах, но тестирование SER без затруднений можно провести и на бактериальных хозяевах, таких как Е.coli.

Последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую полезный полипептид, можно выделить из ДНК, РНК, геномной ДНК, кДНК, мРНК или можно полностью или частично синтезировать. Последовательностью полезного полипептида можно манипулировать, вводя мута