Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий с оптимизированным уровнем генной экспрессии

Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий с оптимизированным уровнем генной экспрессии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предпосылки к созданию изобретения

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения бактерии с оптимизированным уровнем генной экспрессии, полезной для продукции аминокислот или нуклеиновых кислот, и к способу получения L-аминокислот или нуклеиновых кислот с использованием указанной бактерии.

Описание предшествующего уровня техники

Традиционным способом повышения продукции L-аминокислот или нуклеиновых кислот штаммами - продуцентами является увеличение активности продуктов генов, вовлеченных пути биосинтеза указанных L-аминокислот или нуклеиновых кислот. Это можно сделать путем получения мутантов, устойчивых к целевому соединению или его аналогу, увеличения уровня экспрессии генов биосинтеза, уменьшения чувствительности ферментов биосинтеза к ингибированию продуктами или промежуточными соединениями по типу обратной связи, выведением штаммов бактерий, дефицитных по генам, использующим предшественники целевых соединений в других метаболических путях или создания штаммов бактерий, дефицитных по генам, участвующим в деградации целевого соединения.

Указанные выше манипуляции обычно приводят к получению штаммов, которые не способны к росту или способны расти со значительно меньшей скоростью, или штаммов, требующих наличия дополнительных питательных веществ, необходимых для роста, таких как аминокислоты. Например, повышение уровня экспрессии некоторых генов может быть чрезмерным и способно привести к серьезному ингибированию роста бактерий и, как результат, снижению способности бактерии к продукции целевого соединения.

Известно, что микроорганизмы, принадлежащие к роду Escherichia, дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, или микроорганизмы, в которых указанная активность снижена, приобретают способность к продукции L-глутаминовой кислоты (патенты США 5573945 и 5908768). Но подобные мутанты - продуценты глутаминовой кислоты плохо растут или вообще не способны расти на минимальной среде с глюкозой в аэробных условиях. Для восстановления роста необходимо добавление янтарной кислоты или лизина в комбинации с метионином. Таким образом, выбор оптимального уровня экспрессии α-кетоглутаратдегидрогеназы в бактерии необходим для восстановления способности к продукции глутаминовой кислоты и росту в питательной среде, не содержащей дополнительных добавок, таких как янтарная кислота, лизин или метионин.

С другой стороны, известно, что гены, кодирующие сукцинатдегидрогеназу (гены sdhCDAB), в комбинации с генами, кодирующими α-кетоглутаратдегидрогеназу (гены sucAB) и сукцинил-СоА-синтазу (гены sucCD), в хромосоме Е.coli образуют кластер, содержащий два промотора: Р_sdh - sdhCDAB-P_suc-sucAB-sucCD (Park, Chao & Gunsalus, J. Bact. 179.4138-4142,1997; Cunningham & Guest, Microbiology, 144, 2113-2123,1998). Основным промотором этого оперона является регуляторная область, расположенная перед геном sdhC, Р_sdh. Наличие более слабого промотора Р_suc, узнаваемого РНК-полимеразой из Е.coli в комплексе с σ³⁸, обеспечивает дополнительный невысокий уровень конститутивной экспрессии генов sucABCD. Рост концентрации субстрата не влияет на активность второго промотора. Эффект анаэробиозиса и мутаций генов arcA и fnr также незначителен. Белок ArcA является негативным регулятором генов аэробных путей биосинтеза, а белок Fnr (fumarate and nitrate reduction - восстановление фумарата и нитрата) участвует в регуляции транскрипции генов, ответственных за аэробное и анаэробное дыхание, а также за осмотический баланс клетки. Среди потенциальных регуляторов, которые были протестированы, только IHF (integration host factor - продукт гена himA) может играть значительную роль в репрессии активности Р_suc. Белки ArcA и Fnr взаимодействуют с промотором P_sdh, а белок IHF - с более слабым P_suc промотором.

Было описано получение библиотеки синтетических промоторов различной силы для Lactococus lactis (Jensen P.R., and Hammer K., Appl. Environ. MicrobioL, 1998, 64, No.l. 82-87 Biotechnol. Bioeng., 1998, 58, 2-3, 191-5). Библиотека состоит из 38 олигонуклеотидов, содержащих область с последовательностью нуклеотидов произвольного состава между консенсусными последовательностями в положениях между -35 по -15. Для оценки силы полученных промоторов олигонуклеотиды их библиотеки были клонированы в экспрессирующий вектор рАК80, содержащий ген β-галактозидазы. Было показано, что большинство искусственных промоторов были очень слабыми (активность ниже 500 единиц), и только три из них имели силу около 2000 условных единиц. Но практическое применение библиотеки синтетических промоторов описано не было.

В Европейской патентной заявке ЕР 1033407 А1 описан способ получения коринеформных бактерий, обладающих улучшенной способностью к продукции аминокислот или нуклеиновых кислот, путем введения мутаций в область промотора. До 8 различных вариантов мутантных промоторов было использовано для каждого из генов, выбранного из группы, состоящей из гена глутаматдегидрогеназы (gdh), гена цитратсинтазы (gltA), гена изоцитратсинтазы (icd), гена пируватдегидрогеназы (pdhA) и гена аргининосукцинатсинтазы (argG). Недостатком предложенной методики, предложенной в Европейской заявке ЕР 1033407 А1, является то, что каждый из указанных мутантов получали раздельно, один за другим. Кроме того, повышение продукции L-аминокислот во всех описанных примерах достигалось за счет повышения активности определенных ферментов с использованием ограниченного количества промоторов гена, кодирующего этот фермент. Подобный подход является общепринятым и традиционным в работах, нацеленных на получение бактерий - продуцентов L-аминокислот или нуклеиновых кислот, и не имеет отношения к оптимизации или «точной настройке» активности промоторов генов, важных для продукции L-аминокислот или нуклеиновых кислот.

В настоящее время нет сообщений, описывающих применение методики оптимизации генной экспрессии для продукции любого метаболита методом ферментации с использованием бактерии, модифицированной с целью оптимизации экспрессии целевого гена.

Описание изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление способа получения бактерии с оптимизированным уровнем экспрессии гена, кодирующего белок, который влияет на распределение потоков углерода и азота в метаболизме указанной бактерии, и включает в себя следующие стадии: 1) введение в хромосому указанной бактерии набора полученных in vitro фрагментов ДНК, содержащих регуляторные последовательности для экспрессии указанного гена, вместо природных регуляторных последовательностей указанного гена, и 2) отбор бактерии с желаемым фенотипом.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии - продуцента L-аминокислоты с оптимизированным уровнем экспрессии гена, который влияет на продукцию L-аминокислоты, и где указанная бактерия получена при помощи способа, описанного в пункте 1 формулы настоящего изобретения.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя следующие стадии: 1) выращивания бактерии, как описано выше, в питательной среде с целью накопления L-аминокислоты в питательной среде, и 2) выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.

Настоящее изобретение предоставляет простой способ получения в одну стадию бактерии - продуцента L-аминокислоты с оптимизированным уровнем экспрессии гена, который влияет на распределение потоков углерода и азота в бактерии и, следовательно, влияет на продукцию L-аминокислоты или нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение также предоставляет бактерию с оптимизированным уровнем экспрессии гена, который влияет на продукцию L-аминокислоты или нуклеиновой кислоты, увеличивая указанную продукцию, и предоставляет способ получения L-аминокислот, таких как глутаминовая кислота или L-аминокислота, получающаяся из L-глутаминовой кислоты, такая как L-аргинин, L-пролин, L-глутамин, а также L-лейцин; способ получения L-аминокислот, таких как L-лизин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-аспартат, L-аланин, L-тирозин, L-фенилаланин, для биосинтеза которых необходима L-глутаминовая кислота в качестве донора аминогруппы; и способ получения нуклеиновых кислот.

Указанная цель была достигнута путем замены нативного промотора целевого гена последовательностью, подобной промотору, с последовательностью произвольного состава («рандомизированной» последовательностью) непосредственно в хромосоме бактерии. Подобная идея базируется на хорошо известном факте, что у мутантов с модифицированной областью «-35» промоторов, узнаваемых комплексом РНК-полимеразы из Е.coli с σ⁷⁰, эффективность инициации транскрипции изменялась в значительной степени. Таким образом, на основе промоторов, созданных с использованием последовательностей произвольного состава, могут быть получены промоторы различной силы, и оптимальная конструкция может быть выбрана путем прямой оценки продуктивности (или других физиологических характеристик) полученного бесплазмидного штамма.

Этот общий подход был использован для «точной настройки» уровня экспрессии генов sucAB в модельном рекомбинантном штамме Е.coli с целью повышения уровня продукции L-глутаминовой кислоты. Оптимизация, в противовес максимизации экспрессии гена или оперона, является актуальной проблемой в создании различных бактериальных штаммов - продуцентов биологически активных веществ, особенно в случаях, когда низкий уровень экспрессии целевого гена или группы генов недостаточен для достижения конкретной цели, и, с другой стороны, суперэкспрессия соответствующего гена или группы генов может дать не просто нейтральный, но даже негативный эффект. Более того, желаемый уровень экспрессии ключевого гена обычно не известен. «Точная настройка» как нельзя лучше подходит для достижения оптимизации и, кроме того, дает возможность протестировать большое количество вариантов. Традиционный подход проведения такой «точной настройки» включает в себя молекулярное клонирование целевого гена на рекомбинантную плазмиду, где ген помещается под контроль различных промоторов, после чего производится оценка свойств полученных рекомбинантных штаммов. Если же требуется получить улучшенные бесплазмидные штаммы, то после отбора лучших вариантов необходимо приложить еще массу дополнительных усилий.

1. Способ согласно настоящему изобретению

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения бактерии - продуцента L-аминокислоты с оптимизированным уровнем экспрессии гена, влияющего на распределение потоков углерода или азота в указанной бактерии, и в результате влияющего на продукцию L-аминокислоты, включающий следующие стадии:

1) введение в хромосому бактерии набора ДНК фрагментов, синтезированных in vitro и содержащих регудяторные элементы генной экспрессии, вместо природного элемента регуляторной области гена с получением популяции бактерий; и 2) селекции бактерии с желаемым фенотипом.

Термин «экспрессия», использованный здесь, означает продукцию белкового продукта, кодируемого неким геном.

Термин «оптимизированный уровень экспрессии» означает такой уровень экспрессии целевого гена или нескольких генов, при котором бактерия проявляет желаемый фенотип.

Термин «желаемый фенотип» включает в себя одну или несколько характеристик бактерий, являющихся объектом для улучшения. В частности, это может быть способность бактерии к продукции L-аминокислоты в количестве, большем, чем у родительского штамма, способность к росту на минимальной среде, которая не содержит добавок, обычно используемых для комплементации ауксотрофии или других факторов, ограничивающих рост, или комбинация таких характеристик.

Термин «ген, кодирующий белок, влияющий на распределение потоков углерода или азота» означает ген, кодирующий белок, вовлеченный в пути метаболизма углерода или азота. Такими генами являются гены, вовлеченные в гликолиз, ассимиляцию азота, гены пентозного цикла, цикла трикарбоновых кислот и т.д. Более конкретно, это гены, кодирующие глутаматдегидрогеназу, глутаминсинтетазу, глутаматсинтазу, изоцитратдегидрогеназу, аконитатгидратазу, цитратсинтазу, фосфоенолпируваткарбоксилазу, пируватдегидрогеназу, пируваткиназу, фосфоенолпируватсинтазу, енолазу, фосфоглицеромутазу, фосфоглицераткиназу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу,триозафосфатизомеразу, фруктозадифосфатальдолазу, фосфофруктокиназу, глюкозафосфатизомеразу, глутамин-оксоглутаратаминотрансферазу, изопропилмалатсинтазу и т.д. Бактериальные гены, вовлеченные в пути биосинтеза L-аминокислот, нуклеиновых кислот и их предшественников также относятся к таким генам.

Термин «набор ДНК фрагментов, синтезированных in vitro» означает смесь только что синтезированных фрагментов ДНК или смесь ранее известных фрагментов ДНК, полученных из природных или мутантных микроорганизмов, библиотек ДНК, GenBank и т.п. Набор фрагментов ДНК может быть получен путем непосредственного смешения только что синтезированных фрагментов ДНК с известной последовательностью, фрагментов ДНК, полученных из различных источников, упомянутых выше, или фрагментов ДНК, полученных в ходе химического синтеза, в которых определенное положение или область «рандомизирована», т.е. содержит последовательность нуклеотидов произвольного состава.

Термин «рандомизирована» означает, что в ходе стандартного химического синтеза фрагмента ДНК в определенное положение этого фрагмента ДНК или в его некоторую область встраивают нуклеотид произвольного состава (обычно обозначаемого как N, где N - это аденин, гуанин, цитозин или тимин). Указанные фрагменты ДНК содержат последовательности, называемые регуляторными элементами.

Термин «регуляторный элемент» относится к последовательностям нуклеотидов, расположенным перед, внутри и/или после кодирующей области, контролирующих транскрипцию и/или экспрессию кодирующей области при взаимодействии с клеточным аппаратом биосинтеза белков. Указанный термин обычно используется для обозначения промоторов, сайтов связывания рибосомы (RBS), операторов и других элементов генома, влияющих на уровень генной экспрессии.

Смесь указанных фрагментов ДНК, содержащих регуляторные элементы, используется для введения в хромосому бактерии вместо природного регуляторного элемента с образованием популяции клеток бактерии с различными уровнями экспрессии целевого гена. Селекцию бактерии с желаемым фенотипом осуществляют путем непосредственной оценки количества L-аминокислоты, продуцируемой этой бактерией на стандартной минимальной питательной среде, или другими методами, подходящими для оценки характеристик, существенных для того, чтобы бактерия обладала желаемым фенотипом.

Термин «бактерия - продуцент L-аминокислоты», использованный здесь, также означает бактерию, обладающую способностью к продукции и накоплению L-аминокислоты в питательной среде в количестве, большем, чем родительский штамм или штамм дикого типа, и предпочтительно означает, что бактерия обладает способностью к продукции и накоплению в питательной среде не менее 0.5 г/л, более предпочтительно, не менее 1 г/л целевой L-аминокислоты.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).

Для специалиста в данной области не является очевидным, какой уровень активности фермента и какой тип последовательности регуляторного элемента являются оптимальными для конкретных условий. И поэтому выбор последовательности регуляторного элемента, основанный на научном предположении или озарении, может не привести к достижению оптимального результата. Более того, приготовление даже ограниченного количества мутантов с различным уровнем активности фермента является сложным процессом, требующим значительных затрат времени, поскольку данные мутанты традиционно получают последовательно, один за одним. Напротив, способ согласно настоящему изобретению обладает тем преимуществом, что является простым, одностадийным процессом интеграции искусственных или природных фрагментов ДНК в хромосому с получением популяции клеток бактерии с широким спектром уровней экспрессии целевого гена. Например, «рандомизация» 4 нуклеотидов в определенной области химически синтезированного регуляторного элемента дает 4⁴=256 теоретически возможных варианта этой области.

Далее, обычной практикой является первоначальная оценка активности целевого фермента путем введения гена, кодирующего этот фермент, в плазмиду, которую потом помещают в бактерию. Но уровень экспрессии гена, интегрированного в хромосому бактерии, и уровень экспрессии того же гена, введенного в плазмиду, помещенную в бактерию, не являются одинаковыми. Таким образом, другим преимуществом способа согласно настоящему изобретению является то, что указанный способ позволяет производить оценку и отбор бактерии с уровнем экспрессии целевого гена, оптимальным для данных конкретных условий, с последующим непосредственным использованием полученной бактерии для продукции L-аминокислот без каких-либо дополнительных манипуляций.

Методы получения плазмидных ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве затравок и подобные им являются традиционными методами, хорошо известными специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

2. Бактерия согласно настоящему изобретению

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия - продуцент L-аминокислоты, обладающая оптимизированным уровнем экспрессии гена, влияющего на продукцию L-аминокислот. Подобная бактерия может быть получена способом согласно настоящему изобретению.

Более конкретно, бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия - продуцент L-аминокислоты, образующейся из L-глутаминовой кислоты, обладающая оптимизированным уровнем экспрессии гена, влияющего на продукцию L-глутаминовой кислоты. Из L-глутаминовой кислоты образуются L-аргинин, L-пролин и L-глутамин. Также бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия - продуцент L-глутаминовой кислоты, обладающая оптимизированньм уровнем экспрессии гена, влияющего на продукцию L-глутаминовой кислоты. Кроме того, L-глутаминовая кислота играет важную роль в биосинтезе L-лейцина, L-лизина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-аспартата, L-аланина, L-тирозина и L-фенилаланина в качестве донора аминогруппы. Также бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия-продуцент L-лейцина с оптимизированным уровнем экспрессии гена, влияющего на продукцию L-лейцина.

Таким образом, увеличение количества субстрата - доноров азота - для гена, кодирующего аминотрансферазу положительно влияет на продукцию таких аминокислот, как L-лейцин, L-лизин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-аспартат, L-аланин, L-тирозин и L-фенилаланин.

Практическим воплощением настоящего изобретения является штамм Е.coli 702ilvA (ВКПМ В-8012) (Европейская патентная заявка 1772433 А1), содержащий рекомбинантную плазмиду pAYCTERl-cpg, и модифицированный с целью оптимизации экспрессии генов sucAB. Плазмида pAYCTERl-cpg является производной репликона RSF1010, содержащей природные гены, кодирующие цитратсинтазу (ген gltA), PEP карбоксилазу (ген ррс), глутаматдегидрогеназу (ген gdhA) и оперон proBA, клонированные из штамма Е.coli K-12 стандартньми методами. Оптимизация экспрессии генов sucAB осуществлялась в соответствии со способом согласно настоящему изобретению. Указанный рекомбинантный штамм 702ilvA(pAYCTERl-cpg) является дефицитным по активности треониндезаминазы, требует наличия L-изолейцина для роста и обладает способностью к продукции L-пролина и глутаминовой кислоты в ходе выращивания.

Примерами бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые обладают способностью к продукции L-глутаминовой кислоты и могут быть использованы для оптимизации генной экспрессии, являются следующие штаммы Е.coli: штаммы, обладающие устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты и дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, такой как AF13199 (FERM ВР-5807) (патент США 5908768), или штамм FERM P-12379, дополнительно характеризующийся сниженной способностью к разложению L-глутаминовой кислоты (патент США 5393671); штамм Е.coli AJ13138 (FERM BP-5565) (патент США 6110714) и подобные им. Способность к продукции L-глутаминовой кислоты может быть придана, например, введением ДНК, кодирующей любой из таких ферментов, как глутаматдегидрогеназа (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) №61-268185/1986), глутаминсинтетаза, глутаматсинтаза, изоцитратдегидрогеназа (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) №62-166890/1987 и №63-214189/1988), аконитатгидратаза (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) №62-294086/1987), цитратсинтаза (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) №62-201585/1987 и №63-119688/1988), фосфоенолпируваткарбоксилаза (выложенная латентная заявка Японии (Kokai) №60-87788/1985 и №62-55089/1987), пируватдегидрогеназа, пируваткиназа, фосфоенолпируватсинтаза, енолаза, фосфоглицеромутаза, фосфоглицераткиназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, фруктозобифосфатальдолаза, фосфофруктокиназа (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) №63-102692/1988), глюкозофосфатизомераза, глутаминоксоглутаратаминотрансфераза (WO 99/07853) и так далее. Более того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть модифицирована с целью снижения активности ферментов, катализирующих реакции образования соединений, отличных от L-глутаминовой кислоты, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. К ферментам, катализирующим реакции образования соединений, отличных от L-глутаминовой кислоты, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты, относятся α-кетоглутаратдегидрогеназа, изоцитратлиаза, фосфатацетилтрансфераза, ацетаткиназа, синтаза ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтаза, формилацетилтрансфераза, лактатдегидрогеназа, глутаматдекарбоксилаза, 1-пирролиндегидрогеназа и т.д.

Также возможно использование бактерии - продуцента L-лейцина, принадлежащей к роду Escherichia, такой как штаммы E.coli H9068 (АТСС 21530), Н-9070 (FERM ВР-4704) и Н-9072 (FERM BP-4706), устойчивого к 4-азалейцину или к 5,5,5-трифлуоролейцину (патент США 5744331), штаммы Е.coli, в котором отсутствует ингибирование L-лейцином изопропилмалатсинтазы по принципу обратной связи (Европейский патент ЕР 1067191), штамм Е.coli AJ11478, устойчивый к (3-2-тиенилаланину и β-гидроксилейцину (патент США 5763231), штамм Е.coli 57 (ВКПМ В-7386, патент России №2140450) и подобные им.

Аналогичная стратегия, описанная выше для L-глутаминовой кислоты, может быть использована для получения других известных L-аминокислот.

2. Способ получения L-аминокислот

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислот, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости. В частности, способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-глутаминовой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-глутаминовой кислоты в питательной среде, и выделения L-глутаминовой кислоты из культуральной жидкости. Также способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-лейцина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде (с целью продукции и накопления L-лейцина в питательной среде) и выделения L-лейцина из культуральной жидкости.

В настоящем изобретении выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста бактерий. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма, могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин и дрожжевой экстракт.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.

Наилучший способ осуществления изобретения

Настоящее изобретение будет более детально описано ниже со ссылкой на Примеры.

Пример 1. Замена природной области, расположенной в хромосоме бактерии Е.coli перед генами sucAB, гибридньм регуляторным элементом, содержащим синтетический промотор P_tac* и SD_lacZ.

Модифицированный промотор Р_tac*, присоединенный к последовательности Shine-Dalgarno (SD последовательность) гена lacZ из Е.coli, был интегрирован перед кодирующей частью генов sucAB в хромосоме штамма Е.coli 702ilvA(pAYCTERl-cpg) вместо природной области с использованием методики, описанной Datsenko K.A. and Wanner B.L. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, 2000), также называемой «рекомбинацией с использованием Red-системы». Модифицированный промотор Р_tac* содержал только первые 11 пар оснований из 21 пары лактозного оператора (О_lac) и поэтому был не способен взаимодействовать лактозным репрессором вследствие отсутствия нуклеотидов, существенных для такого специфического ДНК-белкового контакта. В дополнение, искусственный фрагмент ДНК, содержавший ген устойчивости к хлорамфениколу (Cm^R), необходимый для селективной интеграции полученных фрагментов в соответствующую область хромосомы бактерии, был присоединен к 5'-части модифицированного промотора Р_tac*.

Схема конструкции указанного искусственного фрагмента ДНК показана на чертеже. Последовательность нуклеотидов заменяемой природной области, расположенной перед генами sucAB, приведена в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO: 1).

Конструирование in vitro упомянутого искусственного фрагмента ДНК, в дополнение содержащего ген устойчивости к хлорамфениколу (Cm^R), было осуществлено в несколько стадий. На первой стадии промотор Р_tac* был амплифицирован с помощью ПЦР таким образом, что полученный фрагмент в 5'-области содержал сайт узнавания BglII (для удобства получения последующей генно-инженерной конструкции, смотри ниже) и SD последовательность и ATG-старт кодон гена lacZ из Е.coli, присоединенный непосредственно к N-концевой части кодирующей области гена sucA, в 3'-области полученного фрагмента, содержащего промотор. В качестве матрицы для ПЦР использовали коммерчески доступную рекомбинантную плазмиду pDR540 (инвентарный номер в GenBank/EMBL U13847, Pharmacia, США). В качестве затравок для ПЦР использовали химически модифицированные олигонуклеотиды PI (SEQ ID NO: 2) и Р2 (SEQID NO: 3).

Во всех случаях ПЦР проводили с использованием термоциклера «Perkin-Elmer 2400 GeneAmp PCR System». Реакционная смесь общим объемом 50 мкл содержала 5 мкл 10x буфера для ПЦР («Ферментас», Литва) с добавлением MgCl₂ до конечной концентрации в реакционной смеси 1.5 мМ, 200 мкМ каждого трифосфата dNTP, 400 нМ каждой из используемых затравок и 2 ед Taq-полимеразы («Ферментас», Литва). Количество ДНК, используемой в качестве матрицы для ПЦР, добавляли из расчета 0.2 нг целевого фрагмента ДНК. Температурный профиль ПЦР был следующий: стадия денатурации в течение 5 мин при 95°С с последующими 20 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд, роста цепи при 72°С; финальная стадия полимеризации при 72°С в течение 2 минут. Время роста цепи выбиралось в соответствии рекомендациями производителя Taq-полимеразы в зависимости от длины амплифицируемого фрагмента ДНК. В частности, для данного конкретного случая время роста цепи составляло 1,5 минуты.

Параллельно проводили вторую стадию конструирования гибридного фрагмента ДНК. Ген Cm^R амплифицировали с использованием коммерчески доступной плазмиды pACYC184 (инвентарный номер Х06403 в GenBank, «Ферментас», Литва) в качестве матрицы и химически синтезированных олигонуклеотидов Р3 (SEQ ID NO:4) и Р4 (SEQ ID NO:5) в качестве затравок. Олигонуклеотид Р3 содержал сайт узнавания BglII, использовавшийся для присоединения к ранее полученному фрагменту ДНК с промотором Р_tac*. Олигонуклеотид Р4 содержал 36 нуклеотидов, расположенных перед регуляторной областью генов sucAB в хромосоме Е.coli, необходимых для последующей рекомбинации целевого фрагмента в хромосому бактерии с помощью Red-системы.

Два полученных фрагмента ДНК обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BglII, a затем лигировали с помощью Т4 ДНК-лигазы (Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). На последней стадии продукт лигирования амплифицировали с использованием затравок Р1 и Р4. Полученный фрагмент ДНК очищали осаждением в этаноле и использовали для электропорации и рекомбинации с использованием Red-системы в хромосому штамма Е.coli 702ilvA(pAYCTERl-cpg). Штамм Е.coli 702ilvA(pAYCTERl-cpg) является производным штамма Е.coli 702ilvA - продуцента L-глутаминовой кислоты (ВКПМ В-8012) (Европейская патентная заявка 1772433 А1), дополнительно несущим рекомбинантную плазмиду pAYCTERl-cpg. Плазмида pAYCTERl-cpg является производной вектора pAYCTER3, несущей природные гены, кодирующие цитратсинтазу (ген gltA), РЕР-карбоксилазу (тен ррс), глутаматдегидрогеназу (ген gdhA) и оперон proBA, клонированные из штамма Е.coli К-12 стандартными методами, такими как ПЦР с использованием хромосомной ДНК штамма Е.coli К-12 в качестве матрицы и затравок с сайтами узнавания рестриктаз, подходящих для дальнейшего клонирования и сборки продуктов ПЦР. Вектор pAYCTER3 является производным среднекопийного и очень стабильного вектора pAYC32, сконструированного на базе плазмиды RSF1010 (Christoserdov A.Y., Tsygankov Y.D., Plasmid, 1986, v.16, pp.161-167), несущей маркер устойчивости к стрептомицину. Вектор pAYCTER3 получали путем введения полилинкера из плазмиды pUC19 и сильного терминатора rrnB в плазмиду pAYC32 вместо ее промотора следующим образом. Сначала с помощью ПЦР и затравок, приведенных в Списке последовательностей под номерами 6 (SEQ ID NO: 6) и 7 (SEQ ID NO: 7), был получен полилинкер плазмиды pUC19. Полученный продукт ПЦР обрабатывали рестриктазами EcoRI и BglII. Терминатор rrnB также был получен помощью ПЦР и затравок, приведенных в Списке последовательностей под номерами 8 (SEQ ID NO: 8) и 9 (SEQ ID NO: 9). Полученный продукт ПЦР обрабатывали рестриктазами BglII и BclI. Затем эти два фрагмента ДНК лигировали в плазмиду pAYC32, предварительно обработанную рестриктазами EcoRI и BclI. Так была получена плазмида pAYCTER3.

Рекомбинантная плазмида pKD46 (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 97, 6640-6645, 2000) с термочувствительным репликоном использовали в качестве донора генов фага λ, необходимых для Red-системы рекомбинации. Клетки штамма 702ilvA(pAYCTERl-cpg) трансформировали плазмидой pKD46 в соответствии со стандартным протоколом Са-трансформации (Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) с последующей селекцией трансформантов на чашках с L-агаром (Триптон, 10 г/л; дрожжевой экстракт, 5 г/л; NaCl, 10 г/л; агар 1,5%), содержащим ампициллин (100 мкг/мл). Чашки инкубировали в течение ночи при 30°С и полученные клоны использовали для приготовления электрокомпетентной культуры. Для этого клетки выращивали в течение ночи при 30°С в жидкой среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и стрептомицин (25 мкг/мл), затем разбавляли в отношении 1:100 средой SOB (дрожжевой экстракт, 5 г/л; NaCl, 0.5 г/л; Триптон, 20 г/л, KCl, 2,5 мМ; MgCl₂, 10 мМ), содержащей ампициллин (100 мкг/мл), стрептомицин (25 мкг/мл) и арабинозу (10 мМ) (арабиноза использовалась для индукции плазмиды, кодирующей гены системы гомологичной рекомбинации фага X), и выращивали при 30°С до достижения оптической плотности бактериальной культуры OD₆₀₀=0.8-1.0. Клетки из 10 мл полученной бактериальной культуры отмывали 3 раза деионизированной водой, охлажденной во льду, затем 200 мл глицерина (10%) и ресуспендировали в 40 мкл глицерина (10%). 0.5 мкг амплифицированного фрагмента ДНК, описанного выше, растворяли в 5 мкл деионизованной воды и добавляли к бактериальной культуре непосредственно перед проведением процедуры электропорации. Электропорацию проводили с помощью прибора для электротрансформации бактерий "Bio-Rad" (США) (№165-2098, версия 2-89) в соответствии с рекомендациями производителя для клеток Е.coli (время импульса - 4-5 миллисекунды, интенсивность электрического поля - 12,5 кВ/см).

Сразу после электропорации к клеточной суспензии добавляли 1 мл среды SOC (дрожжевой экстракт, 5 г/л; NaCl, 0.5 г/л; Триптон, 20 г/л, KCl, 2,5 мМ; MgCl₂, 10 мМ; глюкоза, 20 мМ). Затем полученные клетки выращивали с перемешиванием в течение 2 часов при 37°С и проводили селекцию интегрантов на чашках с L-агаром, содержащим хлорамфеникол (25 мкг/мл) и стрептомицин (25 мкг/мл), выращивая их в течение ночи при 37°С.

Полученные клоны Cm^R, Sm^R переносили методом реплики на чашки с L-агаром и выращивали в течение ночи при 42°С для того, чтобы элиминировать термочувствительную вспомогательную плазмиду pKD46. Наличие замены природной регуляторной области генов sucAB на искусственный гибридный фрагмент ДНК, сконструированный in vitro, в клонах Ар^S Cm^R Sm^R, полученных из штамма 702ilvA(pAYCTERl-cpg), подтверждали методом ПЦР.

Пример 2. Влияние промотора P_tac* на активность α-кетоглутаратдегидрогеназы и продукцию L-глутаминовой кислоты и L-пролина.

Одной петлей каждого из штаммов 702ilvA(pAYCTERl-cpg) и 702ilvA tac* (pAYCTERl-cpg), выросших на чашках с L-агаром, инокулировали колбы Эрленмейера, содержащие 75 мл питательной среды, содержащей Триптон 10 г/л; дрожжевой экстракт 5 г/л; NaCl 4 г/л и стрептомицин (25 мкг/мл) для стабилизации рекомбинантной плазмиды pAYCTER1-cpg, и выращивали в течение 6 часов при 37°С с перемешиванием (140 об/мин). Затем 50 мл выросшей культуры инокулировали Jar-ферментер («Marubishi», Япония). Состав питательной среды для ферментации (общий объем 500 мл) следующий: глюкоза 100 г/л; (NH₄)₂SO₄ 2 г/л; КН₂PO₄ 1 г/л; MgSO₄*7H₂O 0.4 г/л; FeSO₄*7H₂O 0.01 г/л; MnSO₄*5H₂O 0.01 г/л; L-изолейцин, 0.2 г/л; Mameno 0.2 г/л (общий азот); тиамин^*HCl 0.0004 г/л; рН 6,7. В ходе ферментации с аэрацией и перемешиванием (900 об/мин) при 35°С рН среды поддерживали добавлением раствора NH₄OH.

Количество L-глутаминовой кислоты и L-пролина определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Условия для ВЭЖХ: колонка Luna C₁₈(2), 150×3 мм, 5U, температура 17°С. Элюент: CH₃CN - 0,8% (v/v), Н₃PO₄ 0,1% (v/v), KH₂PO₄ - 10 мМ, n-C₈H₁₇SO₃Na - 3 мМ. Скорость потока 0.4 мл/мин, объем нанесения 10 мкл. Детекция при 200 нм. Времена удерживания: глутаминовая кислота 9,3; пролин 12,1.

Уровень активности α-кетоглутаратдегид