Конъюгаты -интерферона

Конъюгаты -интерферона

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к конъюгатам с γ-интерферонподобной активностью, способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим такие молекулы, и к их применению при лечении заболеваний.

Уровень техники

γ-Интерферон (IFNG) является цитокином, продуцируемым Т-лимфоцитами и природными киллерными клетками, и существует в виде гомодимера двух нековалентно связанных полипептидных субъединиц. Зрелая форма каждого димера содержат 143 аминокислотных остатка (показанных в ПОСЛЕД. №2), причем форма его предшественника включает сигнальную последовательность из 166 аминокислотных остатков (показанных в ПОСЛЕД. №1).

Каждая субъединица имеет два потенциальных сайта N-гликозилирования (Aggarwal et al.. Human Cytokines, Blackwell Scientific Publications, 1992) в позициях 25 и 97. В зависимости от степени гликозилирования молекулярная масса IFNG в димерной форме составляет 34-50 кДа (Farrar et al., Ann. Rev. Immunol., 1993, 11:571-611).

О праймерной последовательности IFNG дикого типа человека (hulFNG) сообщается Gray et al. (Nature, 298:859-863, 1982), Taya et al. (EMBO J., 1:953-958, 1982), Devos et al. (Nucleic Acids Res., 10:2487-2501, 1982) и Rinderknecht et al. (J. Biol. Chem., 259:6790-6797, 1984), и в ЕР 77670, ЕР 89676 и ЕР 110044. О ЗD-структуре hulFNG сообщают Ealick et al. (Science, 252:698-702, 1991).

Имеются сообщения о встречающихся в природе или мутированных формах полипептидов с субъединицами IFNG, в том числе, о форме, содержащей N-концевую аминокислотную последовательность Cys-Tyr-Cys (позиции (-3)-(-1) относительно ПОСЛЕД. №2), о форме, содержащей N-концевой метионин (позиция -1 относительно ПОСЛЕД. №2) и различных процессированных по С-концу формах, содержащих 127-134 аминокислотных остатка. Известно, что из С-конца можно удалить 1-15 аминокислотных остатков без уничтожения IFNG-активности молекулы. Кроме того, Pan et al. (Eur. J. Biochem., 166:145-149, 1987) описывают гетерогенность С-конца hulFNG.

О мутеинах Hu IFNG сообщают Slodowski et al. (Eur. J. Biochem., 202:1133-1140, 1991), Luck et al. (J. Biol. Chem., 265: 13314-13319, 1990), Seelig et al. (Biochemistry, 27:1981-1987, 1988), Trousdale et al. (Invest. Ophtalmol. Vis. Sci., 26:1244-1251, 1985) и сообщается в ЕР 146354. О природном варианте hulFNG сообщают Nishi et al. (J. Biochem., 97:153-159, 1985).

В US 6046034 описываются варианты термоустойчивого рекомбинантного hulFNG (rhuIFNG), в которые включено до 4 пар цистеиновых остатков для возможности образования дисульфидной связи и, таким образом, стабилизации варианта IFNG в гомодимерной форме.

В WO 92/08737 описываются варианты IFNG, содержащие дополнительный метионин в N-конце полной (остатки 1-143) или неполной (остатки 1-132) аминокислотной последовательности IFNG дикого типа человека. В ЕР 219781 описываются неполные последовательности hulFNG, содержащие аминокислотные остатки 3-124 (ПОСЛЕД. №2). В US 4832959 описываются неполные последовательности hulFNG, содержащие остатки 1-127, 5-146 и 5-127 аминокислотной последовательности, которая, по сравнению с ПОСЛЕД. №2, содержат три дополнительных N-концевых аминокислотных остатка (CYC). В US 5004689 описывается последовательность ДНК, кодирующая hulFNG без 3 N-концевых аминокислотных остатков CYC, и ее экспрессия в Е. coli. В ЕР 446582 описывается продуцируемый Е. coli rhuIFNG, свободный от N-концевого метионина. В US 6120762 описывается пептидный фрагмент rhuIFNG, содержащий его остатки 95-134 (относительно ПОСЛЕД. №2).

О высоком уровне экспрессии rhuIFNG сообщают Wang et al. (Sci. Sin., В 24:1076-1084, 1994).

О варианте гликозилирования в rhuIFNG сообщают Curling et al. (Biochim. J., 272:333-337, 1990) и Hooker et al. (J. of Interferon and Cytokine Research, 1998, 18:287-295).

О модификации rhuIFNG полимерами сообщают Kita et al. (Drug Des. Deliv., 6:157-167, 1990) и сообщается в ЕР 236987 и US 5109120.

В WO 92/22310 описываются азиалогликопротеиновые конъюгатные производные интерферонов, в частности hulFNG.

Описываются белки, слитые с IFNG. Например, в ЕР 237019 описывается одноцепочечный полипептид, имеющий область, обнаруживающую активность интерферона β, и одну область, обнаруживающую IFNG-активность.

В ЕР 158198 описывается одноцепочечный полипептид, имеющий область, обнаруживающую IFNG-активность, и область, обнаруживающую активность IL-2. В некоторых ссылках описываются одноцепочечные димерные белки IFNG, например в Landar et al., J. Mol. Biol., 2000, 299:169-179.

В WO 99/02710 описываются одноцепочечные полипептиды, одним из примеров которых, среди многих, является IFNG.

В WO 99/03887 описываются варианты полипептидов с присоединенным PEG, принадлежащих к суперсемейству гормонов роста, где несущественные аминокислотные остатки, расположенные в определенной области полипептида, заменены цистеиновым остатком. IFNG упоминается в качестве примера члена суперсемейства гормонов роста, но его модификация сколько-нибудь подробно не обсуждается.

IFNG предложен для лечения интерстициальных болезней легких (также известных как интерстициальный фиброз легких (IPF) (Zeische et al. (N. Engl. J. Med., 341:1264-1269, 1999, и Chest, 110:Suppl:25S, 1996), и ЕР 795332), для целей которого IFNG можно использовать в сочетании с преднизолоном. Кроме IPF, с помощью IFNG можно лечить гранулематозные болезни (Bolinger et al., Clinical Pharmacy, 1992, 11:834-850), некоторые микобактиральные инфекции (N. Engl. J. Med., 330:1348-1355, 1994), рак почек (J. Urol., 152:841-845, 1994), остеопороз (N. Engl. J. Med., 332:1594-1599, 1995), склеродерму (J. Rheumatol., 23: 654-658, 1996), гепатит В (Hepatogastroentherology, 45:2282-2294, 1998), гепатит С (Int. Hepatol. Communic., 6:264-273, 1997), септический шок (Nature Medicine, 3:678-681, 1997) и рематоидный артрит.

В качестве фармацевтического соединения rhuINFG применяют с некоторым успехом во всех указанных выше случаях, против некоторых вирусных инфекций и опухолей. Как правило, rhuINFG можно применять парентерально, предпочтительно путем подкожной инъекции. Максимальная концентрация в сыворотке обнаруживается через семь часов, время полужизни в плазме составляет 30 минут после в/в введения. По этой причине эффективное лечение с помощью rhuINFG включает частые инъекции. Основное побочное действие заключается в лихорадке, ознобе, потоотделении, миалгии и сонливости. Указанное действие ассоциируется с инъецированием rhuINFG и наблюдается в течение первых часов после инъекции. Редкими побочными действиями являются местная боль и эритема, повышение содержания ферментов печени, обратимые грануло- и тромбопения и кардиотоксичность.

Необходимо создать новые молекулы с INFG-активностыо, имеющие улучшенные свойства, по сравнению с hulNFG или rhuINFG, в смысле фармакокинетики, гомогенности, иммуногенности и других побочных действий.

Сущность изобретения

В данной заявке описываются улучшенные INFG-подобные молекулы, обеспечивающие одно или несколько из вышеуказанных нужных свойств. В своем первом аспекте изобретение относится к конъюгату, проявляющему INFG-активность и содержащему, по меньшей мере, одну первую неполипептидную группу, ковалентно присоединенную к INFG-полипептиду, причем полипептид содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от исходного INFG-полипептида, по меньшей мере, на один введенный и/или, по меньшей мере, на один удаленный аминокислотный остаток, содержащий группу для присоединения неполипептидной группы. Конъюгаты имеют удлиненное время полужизни in vivo по сравнению с huINFG и rhuINFG и, необязательно, вызывают пониженную иммунную реакцию по сравнению с rhuINFG. При необходимости указанный класс молекул также имеет еще более улучшенные свойства в смысле способности к образованию гомогенных молекул, улучшенную устойчивость к протеолизу и/или повышенную биологическую доступность.

Следовательно, конъюгат изобретения предоставляет ряд преимуществ по сравнению с доступными в настоящее время соединениями INFG, в том числе более длительный промежуток времени между инъекциями или другими формами введения, более слабое побочное действие и/или повышенную эффективность из-за снижения числа антител. Кроме того, используя конъюгат изобретения, можно получить более высокие дозы активного белка и, таким образом, более эффективную лечебную реакцию.

В другом своем аспекте изобретение относится к конъюгату, проявляющему INFG-активность, содержащему, по меньшей мере, один IFNG-полипептид, обработанный PEG no N-концу. IFNG-полипептид может представлять собой huINFG или любой из IFNG-полипептидов, описанных в данном описании.

Еще в одном своем аспекте изобретение относится к средствам и способам получения конъюгата изобретения, включая нуклеотидные последовательности и экспрессирующие векторы, а также способы получения полипептида или конъюгата.

Еще в других своих аспектах изобретение относится к лечебной композиции, содержащей конъюгат изобретения, к конъюгату или композиции изобретения для применения при лечении, к применению конъюгата или композиции при лечении или для изготовления лечебного средства для лечения заболеваний.

Наконец, изобретение относится к применению определенных конъюгатов INFG для изготовления лечебного средства, фармацевтической композиции или составного набора для лечения интерстициальных болезней легких, рака, инфекционных болезней и/или воспалительных заболеваний, и в случае интерстициальных болезней легких, при необходимости, также в сочетании с глюкокортикоидами.

Подробное описание изобретения

Определения

В контексте настоящей заявки и изобретения применяются описанные далее термины.

Термин "конъюгат" (или, равнозначно, "конъюгированный полипептид") предназначается для того, чтобы определить гетерогенную (в смысле состава или химерности) молекулу, образованную путем ковалентного соединения одного или нескольких полипептидов с одной или несколькими неполипептидными группами. Термин "ковалентное соединение (присоединение)" означает, что полипептид и неполипептидная группа или непосредственно ковалентно соединяются друг с другом или, иначе, косвенно ковалентно соединяются друг с другом через промежуточную группу или группы, такие как мостиковая, спейсерная или линкерная группа или группы. Предпочтительно, конъюгат растворяется при соответствующих концентрациях и условиях, т.е. растворяется в физиологических жидкостях, таких как кровь. Примеры конъюгированных полипептидов изобретения включают гликозилированные и/или обработанные PEG полипептиды. Термин "неконъюгированный полипептид" может быть применен в отношении полипептидной части конъюгата.

Термин "неполипептидная группа" предназначается для определения молекулы, способной к конъюгации с группой для присоединения в IFNG-полипептиде. Предпочтительными примерами такой молекулы являются полимерные молекулы, липофильные соединения, группы сахаров или органические дериватизирующие агенты. При использовании в отношении конъюгата изобретения следует иметь в виду, что неполипептидная группа связывается с полипептидной частью конъюгата через группу для присоединения в полипептиде.

Термин "полимерная молекула" обозначает молекулу, образованную путем ковалентного связывания двух или нескольких мономеров, где ни один из мономеров не является аминокислотным остатком, за исключением случая, когда полимер представляет собой альбумин человека или другой распространенный белок плазмы. Термин "полимер" можно использовать на равных правах с термином "полимерная молекула". Термин "группа сахара" предназначается для определения углеводной молекулы, присоединяемой гликозилированием in vivo или in vitro, например, N- или O-гликозилированием. За исключением случая, где число неполипептидных групп, таких как полимерная(ые) молекула(ы), в конъюгате указывается определенно, при каждом обращении к "неполипетидной группе", содержащейся в конъюгате или иначе используемой в настоящем изобретении, должно быть указано одна группа или несколько неполипептидных групп в конъгате.

Термин "группа для присоединения" предназначен для определения группы аминокислотного остатка, способной к присоединению релевантной неполипептидной группы, такой как полимерная молекула или группа сахара. Полезные группы для присоединения и соответствующие им неполипептидные группы поясняются приведенной далее таблицей.

Группа для присоед.	Аминокислота	Примеры неполи-пептидн. группы	Способ конъюгации/актив. PEG	Ссылка
-NH2	N-конц. Lys	Полимер, напр., PEG	mPEG-SPA, тре-зилированный mPEG	Shearwater Inc., Delgado et al., Critical rewiews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9(3,4):249-304 (1992)
-СООН	С-конц. Asp, Glu	Полимер, напр., PEG,группа сахара	mPEG-Hz Сочет. in vitro	Shearwater Inc.
-SH	Cys	Полимер, напр., PEG	PEG-винилсульфон PEG-малеимид	Shearwater Inc., Delgado et al., Critical rewiews in Therapeutic
Sys-		группа сахара	Сочет. in vitro	Drug Carrier terns, 9(3,4):249-304 (1992)
-ОН	Ser, Thr, ОН-, Lys	группа сахара	Гликозилир. О-связ. in vivo
-CONH2	Asn как часть сайта N-гликозилирования	группа сахара	Гликозилировавание in vivo
Аромат. остаток	Phe, Туг, Trp	группа сахара	Сочетание in vitro
-CONH2	Gin	группа сахара	Сочетание in vitro	Yan and Wold, Biochemistry, 1984, Jul 31: 23(16):3759-65
Альдегид Кетон	Окисленный углевод	полимер, напр., PEG, PEG-гидразид	Обработка PEG	Andresz et al., 1978, Macromol. Chem., 179:301; WO 92/16555, WO 00/23114
Гуанидино	Arg	группа сахара	Сочетание in vitro	Lundblad and Noyes, Chimical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc., Boca Raton, FI
Имида-зольный цикл	His	группа сахара	Сочетание in vitro	Как в случае гуанидино

В случае N-гликозилирования in vivo термин "группа для присоединения" применяют необычно для того, чтобы указать на аминокислотные остатки, составляющие сайт гликозилирования (с последовательностью N-X'-S/T/C-X", где X' представляет собой любой аминокислотный остаток, за исключением пролина, X" представляет собой любой аминокислотный остаток, который может быть идентичен X' или отличается от него и который предпочтительно отличается от пролина, N представляет собой аспарагин и S/T/C представляет собой или серин, или треонин, или цистеин, предпочтительно серин или треонин и наиболее предпочтительно треонин). Хотя аспарагиновый остаток сайта N-гликозилирования является остатком, к которому во время гликозилирования присоединяется группа сахара, такого присоединения нельзя достигнуть, если не присутствуют другие аминокислотные остатки сайта N-гликозилирования. Соответственно, когда неполипептидная группа представляет собой группу сахара и необходимо достигнуть конъюгации путем N-гликозилирования, термин "аминокислотный остаток, содержащий группу для присоединения неполипептидной группы", используемый в связи с изменениями аминокислотной последовательности исходного полипептида, следует понимать так, что один, два или все аминокислотные остатки, составляющие сайт N-гликозилирования, должны быть изменены таким образом, что или в аминокислотную последовательность вводится функциональный сайт N-гликозилирования, или аминокислотная последовательность удаляется из указанной последовательности.

В настоящей заявке обозначения аминокислот и обозначения атомов (например, СА, СВ, CD, CG, SG, NZ, N, О, С и т.п.) используются так, как указывается в Банке данных по структуре белков (PDB) (www.pdb.org), на основании номенклатуры ИЮПАК (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (residue names, atoms names etc.), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984), вместе с исправлениями к ним в Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985). СА иногда обозначают как Сα СВ как Сβ. Термин "аминокислотный остаток" предназначается для обозначения аминокислотного остатка, входящего в группу, состоящую из остатков аланина (Ala или А), цистеина (Cys или С), аспарагиновой кислоты (Asp или D), глутаминовой кислоты (Glu или Е), фенилаланина (Phe или F), глицина (Gly или G), гистидина (His или Н), изолейцина (Не или I), лизина (Lys или К), лейцина (Leu или L), метионина (Met или М), аспарагина (Asn или N), пролина (Pro или Р), глутамина (Gln или Q), аргинина (Arg или R), серина (Ser или S), треонина (Thr или Т), валина (Val или V), триптофана (Trp или W) и тирозина (Tyr или Y). Нумерация аминокислотных остатков в указанном документе начинается с N-конца hulFNG без сигнального пептида (т.е., ПОСЛЕД. №2). Терминологию, используемую для идентификации позиций/замен аминокислот, можно пояснить на примерах N25 (показывает позицию #25, занимаемую аспарагином в аминокислотной последовательности, показанной в ПОСЛЕД. №2) и N25C (показывает, что остаток Asp в позиции 25 заменен Cys). Множественные замены указываются с помощью "+", например QIN+P3T/S обозначает аминокислотную последовательность, содержащую замену остатка Gln в позиции 1 на Asn и замену остатка Pro в позиции 3 на Thr или Ser, предпочтительно на Thr.

Термин "нуклеотидная последовательность" предназначается для указания последовательного участка из двух или нескольких нуклеотидных молекул. Нуклеотидная последовательность может быть геномного происхождения, происходить от кДНК и РНК, полусинтетического и синтетического происхождения или происходить от их любого сочетания.

Термин "полимеразная цепная реакция" или "PCR", как правило, относится к способу амплификации нужной нуклеотидной последовательности in vitro, как описывается, например, в US 4683195. Вообще, метод PCR включает повторяющиеся циклы синтеза для удлинения праймера с использованием олигонуклеотидных праймеров, способных к избирательной гибридизации с матрицей нуклеиновой кислоты.

Термины "клетка", "клетка-хозяин", "клеточная линия" и "клеточная культура" в данном описании используются как равнозначные, и следует иметь в виду, что все такие термины включают потомство, образующееся в результате роста или культивирования клетки. Термины "трансформация" и "трансфекция" используются как равнозначные и относятся к способу введения ДНК в клетку.

Термин "операбельно связанный" относится к ковалентному соединению двух или нескольких нуклеотидных последовательностей с помощью ферментативного лигирования или иным способом в такую конфигурацию одного относительно другого, что может выполняться нормальная функция последовательности. Например, нуклеотидная последовательность, кодирующая препоследовательность или секреторную лидерную последовательность, операбельно связывается с нуклеотидной последовательностью полипептида, если он экспрессируется как препротеин, участвующий в секреции полипептида: промотор или энхансер операбельно связываются с кодирующей последовательностью, если он воздействует на транскрипцию последовательности; рибосомсвязывающий сайт операбельно связывается с кодирующей последовательностью, если располагается так, что облегчается трансляция. Как правило, "опрерабельно связанный" означает, что связывающиеся нуклеотидные последовательности являются соседними и, в случае секреторной лидерной последовательности, соседними и в фазе считывания. Связывание осуществляется посредством лигирования по обычным сайгам рестрикции. Если таких сайтов нет, тогда используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры, в соединении с обычными методами рекомбинантных ДНК.

Термин "введение", главным образом, предназначается для обозначения замены существующего аминокислотного остатка, но также может обозначать встраивание дополнительного аминокислотного остатка. Термин "удаление", главным образом, предназначается для обозначения замены аминокислотного остатка, который удаляют, на другой аминокислотный остаток, но также может обозначать делецию (без замены) удаляемого аминокислотного остатка.

Термин "аминокислотный остаток, содержащий группу для присоединения неполипептидной группы", предназначается для того, чтобы показать, что аминокислотный остаток является остатком, с которым связывается неполипептидная группа (в случае введенного аминокислотного остатка) или могла бы связываться (в случае удаленного аминокислотного остатка).

Термин "одно различие" или "отличается", применяемый в отношении аминокислотной последовательности IFNG-полипептида, описываемого в данном описании, предназначается для указания на возможность присутствия других различий. Соответственно, кроме различия по определенной аминокислоте, могут быть мутированными другие аминокислотные остатки, кроме указанных.

Термин "функциональное время полужизни in vivo" используется в его обычном значении, т.е., обозначает время, в течение которого 50% молекул конъюгата циркулируют в плазме или кровотоке перед выведением (также называемым "время полужизни в кровяном русле"), или время, в течение которого сохраняется 50% функциональности конъюгата. Полипептид или конъюгат обычно выводится благодаря действию одной или нескольких ретикулоэндотелиальных систем (РЭС), почек, селезенки или печени, или путем специфического или неспецифического протеолиза. Обычно выведение зависит от размера (относительно отрезка для клубочковой фильтрации), нагрузки, присоединенных углеводородных цепей и наличия рецепторов для белка. Обычно сохраняемую функциональность выбирают среди антивирусной, антипролиферативной, иммуномодулирующей или IFNG-рецепторсвязывающей активностей. Функциональное время полужизни in vivo можно определить любым подходящим способом, известным в технике, как описывается далее в разделе "Методы".

Термин "повышенное функциональное время полужизни" применяют, чтобы показать, что функциональное время полужизни in vivo конъюгата статистически существенно возросло относительно времени полужизни молекулы для сравнения, такой как hulFNG, необязательно, в гликозилированной форме, например, hulFNG или rhuIFNG, при определении в сравнимых условиях.

Термин "иммуногенность", используемый в связи с данным веществом, предназначается для указания на способность вещества индуцировать ответ иммунной системы человека. Иммунный ответ может быть опосредованной клеткой или антителом реакцией (для дополнительного определения иммуногенности см., например, Roitt: Essential Immunology (8^th Edition, Blackwell)).

Термин "пониженная иммуногенность" предназначается для того, чтобы показать, что конъюгат настоящего изобретения вызывает измеримо более слабый иммунный ответ, чем молекула для сравнения, такая как hulFNG или rhuIFNG, при определении в сравнимых условиях.

Термин "проявляющий IFNG-активность" предназначается для того, чтобы показать, что полипептид обладает одной или несколькими функциями нативного IFNG, в частности, hulFNG или rhuIFNG, в том числе способностью связываться с IFNG-рецептором и вызывать трансдукцию сигнала, трансдуцированного после huIFNG-связывания его рецептора при определении in vitro или in vivo (т.е., биологическая активность in vitro или in vivo). IFNG-рецептор описывается Aguet et al. (Cell, 55:273-280, 1988) и Calderon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4837-4841, 1988). "IFNG-полипептид" представляет собой лолипептид, проявляющий IFNG-активность, и такой термин используется в данном описании для полипептида в мономерной или димерной форме, соответственно. Например, когда указываются специфические замены, они обычно указываются относительно мономера IFNG-полипептида. Когда делается ссылка на IFNG-часть конъюгата изобретения, это, как правило, димерная форма (и, таким образом, например, содержит два мономера IFNG-полипептида, модифицированных так, как описано). Димерная форма IFNG-полипептидов может быть образована путем обычного объединения двух мономеров или может представлять собой форму одноцепочечного димерного IFNG-полипептида.

Описываемый в данном описании IFNG-полипептид может обладать биологической активностью in vivo или in vitro такой же величины, как huIFNG или rhuIFNG, или более низкой или более высокой, например биологической активностью in vivo или in vitro в 1-100% биологической активности hulFNG или rhuIFNG, при измерении в сравнимых условиях, например в 1-25% или 1-50% или 25-100% или 50-100% биологической активности huIFNG или rhuIFNG.

Термин ""исходный IFNG" предназначается для обозначения молекулы, модифицируемой согласно изобретению. Как правило, исходный IFNG кодируется нуклеотидной последовательностью, которую модифицируют согласно настоящему изобретению таким образом, чтобы кодировать полипептидную часть конъюгата изобретения. Исходным IFNG, как правило, является huIFNG или rhuIFNG или их варианты или фрагменты. "Вариант" представляет собой полипептид, отличающийся от своего исходного полипетида, как правило, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотными остатками. Фрагмент представляет собой часть полноразмерной последовательности huIFNG, проявляющую IFNG-активность, например ее версию, процессированную по С-концу или по N-концу.

Термин "функциональный сайт" предназначается для определения одного или нескольких аминокислотных остатков, которые незаменимы или иначе участвуют в функции или действии IFNG. Такие аминокислотные остатки "локализованы в" функциональном сайте. Функциональный сайт можно определить способами, известными в технике, и, предпочтительно, его идентифицируют анализом структуры полипептида, находящегося в комплексе с релевантным рецептором, таким как IFNG-рецептор.

Конъюгат изобретения

Как указывалось выше, в своем первом аспекте изобретение относится к конъюгату, проявляющему IFNG-активность и содержащему, по меньшей мере, одну неполипептидную группу, ковалентно связанную с IFNG-полипептидом, причем полипептид содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности IFNG-полипептида, по меньшей мере, на один введенный и/или, по меньшей мере, один удаленный аминокислотный остаток, содержащий группу для присоединения неполипептидной группы.

Путем удаления или введения аминокислотного остатка, содержащего группу для присоединения неполипептидной группы, можно специфически адаптировать полипептид таким образом, чтобы получить молекулу, более поддающуюся конъюгации с выбранной неполипептидной группой, чтобы оптимизировать картину конъюгации (например, обеспечить оптимальное распределение неполипептидных групп на поверхности IFNG-полипептида) и, таким образом, получить новую конъгатную молекулу, проявляющую IFNG-активность и, кроме того, одно или несколько улучшенных свойств по сравнению с доступными в настоящее время молекулами на основе huIFNG и rhuIFNG. Например, путем введения групп для присоединения IFNG-полипептид усиливается или изменяется иным образом, по содержанию специфичных аминокислотных остатков, с которыми связывается релевантная неполипептидная группа, посредством чего достигается более эффективная и/или расширенная конъюгация. Путем удаления одной или нескольких групп для присоединения можно избежать конъюгации с неполипептидной группой в частях полипептида, где такая конъюгация невыгодна, например, с аминокислотным остатком, расположенном в или вблизи функционального сайта полипептида (так как конъюгация в таком сайте может привести к инактивации или снижению IFNG-активности полученного конъюгата из-за ухудшенного узнавания рецептора). Кроме того, может оказаться выгодным удаление группы для присоединения, расположенной рядом с другой группой для присоединения, для того, чтобы избежать гетерогенной конъюгации по таким группам. В предпочтительных вариантах воплощения изобретения изменяют свыше одного аминокислотного остатка IFNG-полипептида, например альтерация заключает в себе удаление, а также введение аминокислотных остатков, содержащих сайты присоединения для выбранной неполипептидной группы. Предполагается, что такой вариант особенно интересен в том отношении, что можно специфически создать IFNG-полипептид таким образом, чтобы получить оптимальную конъюгацию с неполипептидной группой.

Кроме удаленного и/или введенного аминокислотного остатка, полипептид может содержать другие замены, не относящиеся к введению и/или удалению аминокислотных остатков, содержащих группу для присоединения неполипептидной группы.

Хотя исходный полипептид, модифицируемый по настоящему изобретению, может представлять собой любой полипептид с IFNG-активностью, и, таким образом, иметь любое происхождение, например, происходить не от человека, а от другого млекопитающего, предпочтительно, чтобы исходный полипептид представлял собой hulFNG с аминокислотной последовательностью, представленной в ПОСЛЕД. №2 или его вариантом или фрагментом. Примеры вариантов huIFNG описываются выше при описании предпосылок изобретения и включают, например, huIFNG с добавлением по N-концу CYC и модифицированные цистеином варианты, описываемые в US 6046034. Конкретными примерами фрагментов являются фрагменты, описываемые выше в разделе "Уровень техники", и к ним относятся huIFNG, процессированные по С-концам на 1-15 аминокислотных остатков, например на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотных остатков, и/или процессированные по N-концам на 1-3 аминокислотных остатка.

Следует иметь в виду, что когда исходный IFNG-полипептид является вариантом или фрагментом huIFNG, модифицированный IFNG-полипептид, полученный из такого источника, содержит мутации или усечения исходной молекулы.

Исходный IFNG-полипептид также может представлять собой молекулу-гибрид мономера IFNG-полипептида и другого гомологичного полипептида, необязательно содержащий одну или несколько дополнительных замен, введенных в гибридную молекулу. Такие гибриды описываются выше в разделе "Уровень техники". Такая гибридная молекула может содержать аминокислотную последовательность, отличающуюся, в пределах 15, например, на 10 аминокислотных остатков, от аминокислотной последовательности, представленной ПОСЛЕД. №2. Для того, чтобы быть полезной для настоящего изобретения, гибридная молекула должна проявлять IFNG-активность.

Исходные IFNG, происходящие не от человека, можно модифицировать аналогично тому, как описано в данном описании, например, модифицируя соответствующую позицию IFNG, происходящего не от человека (например, определяемую из сравнительного анализа аминокислотной последовательности или 3D-структуры указанного IFNG и huIFNG), на позицию, описанную здесь.

Следует иметь в виду, что аминокислотный остаток, содержащий группу для присоединения неполипептидной группы, или удаляемый, или вводимый, выбирают на основе характера выбранной неполипептидной группы и, в большинстве случаев, на основе используемого способа конъюгации. Например, когда неполипетидная группа представляет собой полимерную молекулу, такую как полиэтиленгликоль или молекула, образованная от полиалкиленоксида, аминокислотные остатки, способные функционировать как группа для присоединения, можно выбрать из группы, состоящей из цистеина, лизина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и аргинина. Когда неполипептидная группа является группой сахара, группа для присоединения представляет собой, например, сайт гликозилирования in vivo, предпочтительно сайт N-гликозилирования.

Всякий раз, когда в IFNG-полипептид необходимо ввести группу для присоединения неполипептидной группы или удалить указанную группу согласно настоящему изобретению, позицию модифицируемого полипептида обычно выбирают следующим образом.

Позиция, предпочтительно, локализована на поверхности IFNG-полипептида и предпочтительнее занимается аминокислотным остатком, у которого более 25% его боковой цепи доступно для растворителя, предпочтительно более 50% его боковой цепи доступно для растворителя, что определяют на основе 3D-структуры или модели IFNG в его димерной форме, причем структура или модель, необязательно, также содержит одну или две молекулы IFNG-рецептора. Такие позиции (например, представляющие свыше 25% или свыше 50% доступной поверхности на модели с или без рецепторных молекул) перечислены в данном описании в разделе "Материалы и методы".

Также должна представлять интерес модификация любого из 23 С-концевых аминокислотных остатков исходного IFNG (путем введения и/или удаления аминокислотных остатков, содержащих группу для присоединения неполипептидной группы), так как такие остатки, как полагают, локализованы на поверхности IFNG-полипептида.

Кроме того, в IFNG-полипептидной части конъюгата изобретения группу для присоединения, расположенную в рецепторсвязывающем сайте IFNG, предпочтительно, удаляют, предпочтительно, путем замены аминокислотного остатка, содержащего такую группу. Аминокислотные остатки рецепторсвязывающего сайта IFNG идентифицированы ниже в разделе "Материалы и методы". В случае одноцепочечного IFNG-полипептида может быть достаточным удаление групп для присоединения в рецепторсвязывающем сайте только одного из мономеров и посредством этого получить конъюгат одноцепочечного IFNG-полипептида с одним активным и одним неактивным рецепторсвязывающим сайтом.

Для того, чтобы определить оптимальное распределение групп для присоединения, вычисляют расстояние между аминокислотными остатками, локализованными на поверхности IFNG-полипептида, на основе 3D-структуры IFNG-димерного полипептида. Конкретнее, определяют расстояние между СВ аминокислотных остатков, содержащих такие группы для присоединения, или расстояние между функциональной группой (NZ в случае лизина, CG в случае аспарагиновой кислоты, CD в случае глутаминовой кислоты, SG в случае цистеина) одного и СВ другого аминокислотного остатка, содержащего группу для присоединения. В случае глицина вместо СВ используют СА. В IFNG-полипептидной части конъюгата изобретения любое из указанных расстояний составляет, предпочтительно, более 8Å, в частности более 10Å, для того, чтобы избежать или уменьшить гетерогенную конъюгацию.

Также аминокислотная последовательность IFNG-полипептида может отличаться от аминокислотной последовательности исходного полипептида в том, что удаляют один или несколько аминокислотных остатков, составляющих часть эпитопа, предпочтительно, путем замены на аминокислотный остаток, содержащий группу для присоединения неполипептидной группы, с тем, чтобы разрушить или инактивировать эпитоп. Эпитопы huIFNG или rhuIFNG можно идентифицировать, используя способы, известные в технике, также известные как картирование эпитопов, см., например, Romagnoli et al., Biol. Chem., 1999, 380(5):553-9, DeLisser H.M., Methods Mol. Biol., 1999, 96:11-20; Van de Water et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 1997, 85(3):229-35, Saint-Remy J.M., Toxicology, 1997, 119 (1):77-81 и Lane D.P. and Stephen C.W., Curr. Opin. Immunol., 1993, 5(2):268-71. По одному из способов необходимо установить библиотеку фаговых отображений, экспрессирующую рандомизированные олигопептиды из, например, 9 аминокислотных остатков. Анти-IgGl антитела из специфической антисыворотки к huIFNG или rhuIFNG выделяют в чистом виде иммунопреципитацией, и реакционноспособные фаги идентифицируют методом иммуноблоттинга. Секвенированием ДНК очищенных реакционноспособных фагов можно определить последовательность олигопептида с последующей локализацией последовательности на 3D-структуре IFNG. Посредством этого идентифицированная область на структуре составляет эпитоп, который затем можно выбрать в качестве области-мишени для введения группы для присоединения неполипептидной группы.

Для того, чтобы избежать слишком большого нарушения структуры и функции молекулы исходного IFNG, общее число изменяемых аминокислотных остатков, согласно настоящему изобретению (при сравнении с аминокислотной последовательностью, представленной ПОСЛЕД. №2), как правило, не должно превышать 15. Предпочтительно, IFNG-полипептид содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся на 1-15 аминокислотных остатков от аминокислотной последовательности, представленной ПОСЛЕД. №2, например, отличающуюся на 1-8 или на 2-8 аминокислотных остатков, например на 1-5 или 2-5 аминокислотных остатков, от аминокислотной последовательности, представленной ПОСЛЕД. №2. Таким образом, как правило, IFNG-полипептид содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от зрелой части аминокислотной последовательности, представленной ПОСЛЕД. №2, на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотных остатков. Предпочтительно, вышеуказанные числа представляют или общее число введенных или общее число удаленных аминокислотных остатков, содержащих группу для присоединения релевантной/ых неполипептидной/ых группы/групп, или общее число введенных и удаленных аминокислотных остатков, содержащих такую группу.

Точное число групп для присоединения, доступных для конъюгации и имеющихся в IFNG-полипептиде в димерной форме, зависит от действия, которое требуется достигнуть путем конъюгации. Получаемое действие, например, зависит от характера и степени конъюгации (например, идентичности неполипептидной группы, числа неполипептидных групп, требуемых для конъюгации или которые могут конъюгировать с полипептидом, где они должны быть конъюгированы и где следует избежать конъюгации, и т.п.).

IFNG-полипептидная часть конъюгата изобретения может находиться в процессированной форме (например, с процессированными 1-15 С-концевыми аминокислотными остатками, как описано выше в связи с исходным IFNG-полипептидом, или процессированными 1-3 N-концевыми аминокислотными