Дельта 6-ацетиленаза/дельта-6-десатураза и дельта-6-десатураза из ceratodon purpureus

Дельта 6-ацетиленаза/дельта-6-десатураза и дельта-6-десатураза из ceratodon purpureus

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение касается способа производства ненасыщенных жирных кислот, а также способа изготовления триглицеридов с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот. В существенной мере изобретение касается последовательностей ДНК, кодирующих Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы или Δ6-десатуразы для производства трансгенного организма, предпочтительно трансгенного растения или трансгенного микроорганизма с повышенным содержанием жирных кислот, масел или липидов с тройными и/или двойными Δ6-связями.

Кроме того, изобретение касается изолированной последовательности нуклеиновых кислот; экспрессионной кассеты, содержащей последовательность нуклеиновых кислот, вектора и организмов, содержащих, как минимум, одну последовательность нуклеиновых кислот, соответственно, одну экспрессионную кассету. Кроме того, изобретение касается ненасыщенных жирных кислот, а также триглицеридов с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот и их применения.

Жирные кислоты и триглицериды находят многочисленное применение в пищевой индустрии, в питании животных, косметике и в фармацевтике. В зависимости от того, идет ли речь о свободных насыщенных кислотах или ненасыщенных жирных кислотах, или о триглицеридах с повышенным содержанием насыщенных или ненасыщенных кислот, они пригодны для различных применений, так, например, многократно ненасыщенные жирные кислоты входят в состав детского питания для повышения питательной ценности. Различные жирные кислоты и триглицериды добываются, главным образом, из микроорганизмов, таких как Mortierella или из масличных растений, как соя, рапс, подсолнечник и др., причем они, как правило, находятся в форме их триацилглицеридов. Однако их можно также получить из животных, например, рыб. Свободные жирные кислоты производятся преимущественно путем омыления.

В зависимости от цели применения предпочтительны масла с насыщенными или ненасыщенными жирными кислотами, так, например, в питании человека липидам с ненасыщенными жирными кислотами предпочтительны липиды со специально многократно ненасыщенными жирными кислотами, так как они уменьшают уровень холестерина в крови и снижают вероятность сердечных заболеваний. Они находят применение в различных диетических продуктах питания или медикаментах.

Ввиду их позитивных качеств, ранее предпринимались попытки использовать гены, которые участвовали в синтезе жирных кислот, соответственно, триглицеридов для производства масел в различных организмах с измененным содержанием ненасыщенных жирных кислот. Так в патенте WO 91/13972 и его эквиваленте в США описывается Δ9-десатураза. В патенте WO 93/11245 заявляется Δ15-десатураза, в WO 94/11516 заявляется Δ12-десатураза. Δ6-десатуразы описываются в WO 93/06712, US 5,614,393, WO 96/21022 и WO 99/27111. Другие десатуразы описаны, например, в патентах ЕР-А-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, ЕР-А-0 794 250, а также Стаки и др, Ж. Биол. Кем., 265, 1990: 20144-20149 (Stukey et al, J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149), Вада и др., Нэйча 347, 1990: 200-203 (Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203) или Хуан и др., Липидз 34, 1999: 649-659 (Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659). В WO 96/13591 описывается и заявляется Δ6-пальмитойл-АСР-десатураза. Биохимическая характеристика различных десатураз до сих пор была недостаточной, т.к. ферменты в качестве мембранносвязанных протеинов, очень тяжело изолировать и характеризовать. (Мак Кеон и др., - Методз ин энзимол. 71, 1981: 12141-12147 (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147), Ванг и др.. Плант Физиол. Биокем., 26, 1988: 777-792 (Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792)).

В патенте WO 97/37033 описывается Δ12-ацетиленаза. С помощью этого фермента можно изготовить ненасыщенные жирные цис-кислоты с тройной связью. Такие жирные кислоты кроме применения в продуктах питания ввиду их реактивности могут применяться также при производстве полимеров. Шперлинг и др. сообщали на съезде Саус Лэйк Тахо, Канада, Июнь 9-13, 1999 (Sperling et al., South Lake Tahoe, Canada, June 9-13, 1999) о клонировании фермента, который также производит тройные связи в жирных кислотах. При этом субстраты этого фермента отличаются от субстратов Δ12-ацетиленазы, а тройные связи вводятся ферментом в жирных кислотах на других позициях.

В дрожжах прослеживается, как смещение спектра жирных кислот к ненасыщенным жирным кислотам, так и повышение производительности (см. Хуан и др., Липидз 34, 1999: 649-659 (Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659), Напьер и др., Биокем. Ж., Том 330, 1998: 611-614 (Napier et al, Biochem. J. Vol. 330, 1998: 611-614)). Однако экспрессия различных десатураз в трансгенных растениях не привела к желаемому успеху. Хотя показана возможность смещения спектра жирных кислот к ненасыщенным жирным кислотам, одновременно оказывается, что производительность синтеза трансгенных растений сильно уменьшается, что означает уменьшение получения масла из исходных растений.

Поэтому, как и прежде, существует большая потребность в новых генах, которые кодируют ферменты, участвующие в биосинтезе ненасыщенных жирных кислот, и дают возможность производить их в техническом масштабе.

Поэтому возникла задача по разработке новых ферментов для синтеза ненасыщенных сопряженных жирных кислот. Эта задача решалось с помощью изолированной последовательности нуклеиновых кислот, которая кодирует полипептид с активностью Δ6-ацетиленазы и/или Δ6-десатуразы, выбранной из группы:

a) последовательности нуклеиновых кислот из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:11,

b) последовательностей нуклеиновых кислот, которые получаются как результат дегенерированного генетического кода из приведенных в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:11 последовательностей нуклеиновых кислот,

c) производных последовательностей нуклеиновых кислот, приведенных в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:11, которые кодируют полипептиды с последовательностью нуклеиновых кислот, представленной в SEQ ID NO:2, и обнаруживают, по меньшей мере, 75% гомологии на аминокислотном уровне, без существенного уменьшения действия полипептидов.

Под производной (производными) следует понимать, например, функциональные гомологи кодированных последовательностями SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:11 ферментов или их ферментационную активность, это значит ферменты, которые катализируют те же ферментативные реакции, что и ферменты, кодированные последовательностями SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:11.

Эти гены содействуют также выгодному получению ненасыщенных жирных кислот с тройными и/или двойными связями в Δ6-позиции. Под ненасыщенными жирными кислотами в дальнейшем следует понимать моно или полиненасыщенные жирные кислоты, обнаруживающие тройные и/или двойные связи. Тройные и/или двойные связи могут быть сопряженньми или не сопряженными. Приведенные в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:11 последовательности кодируют новые ферменты, которые обнаруживают активность ацетиленазы и/или Δ6-десатуразы.

Заявляемый фермент Δ6-ацетиленаза/Δ6-десатураза выгодно вводит в остатки жирных кислот глицеролипидов цис-двойную связь в позиции С₆-С₇ и/или конвертирует уже имеющуюся цис-двойную связь в позиции С₆-С₇ в тройную связь (см. SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3). Фермент имеет, кроме того, активность Δ6-десатуразы, которая выгодно вводит в остатки жирных кислот глицеролипидов исключительно цис-двойную связь в позиции С₆-С₇. Эту активность имеет также фермент с последовательностью, упомянутой в SEQ ID NO:11. При этом речь идет о монофункциональной Δ6-десатуразе.

Заявляемая(ые) последовательность(ти) нуклеиновых кислот (для заявки единственное число должно охватывать множественное число и наоборот) или их фрагменты могут выгодно использоваться для выделения дальнейших геномных последовательностей путем гомологического скрининга.

Упомянутые производные можно выделять, к примеру, из других организмов с помощью эукариотических организмов, таких как растения, специальные мхи, Dinoflagellaten или грибы.

В дальнейшем под производными и, соответственно, функциональными производными последовательностей, приведенных в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:11, следует понимать, к примеру, варианты аллелей, которые обнаруживают, как минимум, 70% гомологию на отведенном аминокислотном уровне, преимущественно, по меньшей мере, 75% гомологию, предпочтительно, по меньшей мере, 80% гомологию, особенно предпочтительно, по меньшей мере, 85% гомологию, исключительно предпочтительно 90% гомологию. Гомология рассчитывается по всей области аминокислот. Применяется программа ПайлАп, БЭСТФИТ. ГЭП, ТРАНСЛЭЙТ (PileUp, BESTFIT. GAP, TRANSLATE) и, соответственно, БЭКТРАНСЛЭЙТ (BACKTRANSLATE) (составная часть программного пакета UWGCG. Висконсин Пэкедж, Версия 10.0-Юникс, Январь 1999, Дженэтикс Компьютер Груп Инк. (UWGCG. Wisconsin Package, Version 10.0-UNIX, January 1999, Genetics Computer Group, Inc.), Дэверакс и др., Ньюклеис. Эйсид. Рез., 12. 1984: 387-395 (Deverux et al., Nucleic. Acid Res., 12, 1984: 387-395)) используют (Ж. Мол. Эволюшн., 25. 351-360. 1987, Хиггинс и др., КАБИОС, 5 1989: 151-153 (J. Mol. Evolution., 25. 351-360. 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153)), Производные от упомянутых нуклеиновых кислот последовательности аминокислот следует брать из последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:12. Под гомологией нужно понимать идентичность, что означает: последовательности аминокислот идентичны, по меньшей мере, на 70%. Заявляемые последовательности являются на плоскости аминокислот, по меньшей мере, на 65% гомологичными, предпочтительно на 70%, особенно предпочтительно на 75%, исключительно предпочтительно, как минимум, на 80%.

Варианты аллелей охватывают, в частности, функциональные варианты, которые получены путем удаления, вставки или замещения нуклеотидов из последовательностей, представленных в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:11, причем ферментативная активность производных синтезированных протеинов сохраняется.

Такие последовательности ДНК можно выделять, исходя из описанных в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:11 последовательностей ДНК или части этих последовательностей, к примеру с помощью обыкновенного способа гибридизации или ПЦР-техники (техники полимеразной цепной реакции) из других эукариотов, как, например, упомянуто выше. Эти ДНК-последовательности гибридизируют при стандартных условиях упомянутые последовательности. Для гибридизации применяются преимущественно короткие олигонуклеотиды, к примеру, законсервированных областей, которые могут определяться путем сравнения с другими генами ацетиленазы и/или десатуразы известным специалисту способом. Преимущественно используются последовательности из гистидинового бокса. Для гибридизации могут использоваться также более длинные фрагменты заявляемых нуклеиновых кислот или полные последовательности. Эти стандартные условия варьируют в зависимости от использованной нуклеиновой кислоты: олигонуклеотид, более длинный фрагмент или полная последовательность или, в зависимости от того, какой вид нуклеиновой кислоты - ДНК или РНК используется для гибридизации. Таким образом, к примеру, температуры плавления для ДНК: ДНК-гибридов лежат примерно на 10°С ниже, чем для ДНК: РНК-гибридов равной длины.

Под стандартными условиями нужно понимать в зависимости от нуклеиновой кислоты температуры между 42 и 58°С в водном растворе буфера с концентрацией 0,1-5 х SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCl, 15 мМ цитрата натрия, рН 7,2) или дополнительно в присутствии 50% формамида, как, к примеру, 42°С в 5 х SSC, 50% формамиде. Преимущественно условия гибридизации для ДНК: ДНК-гибридов лежат при 0,1 х SSC и температурах между 20 и 40°С, предпочтительно между 30 и 40°С. Для ДНК: РНК-гибридов условия гибридизации преимущественно лежат при 0,1 х SSC и температурах между 30 и 50°С, предпочтительно между 40 и 50°С. Эти указанные температуры для гибридизации примерно равны рассчитанным значениям температуры плавления для нуклеиновой кислоты с длиной примерно от 100 нуклеотидов и содержанием G+C, равным 50% в отсутствие формамида. Экспериментальные условия ДНК-гибридизации приводятся в специальных учебниках генетики, как, например, в Сэмбрук и др., "Молекьюла Клонин", Колд Спринг Харбор Лэборатори, 1989 (Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) и могут рассчитываться специалистом по известным формулам, например, в зависимости от длины нуклеиновых кислот, вида гибридов или содержания G+C. Специалист может получить дальнейшие сведения о гибридизации из следующих учебников: Аусабель и др. (изд), 1985, Карэнт Протокас ин Молекула Байолоджи, Джон Вайли энд Санз, Нью Йорк (Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York); Харнс энд Хиггинс (изд), 1985, Ньюклеис. Эйсид Гибридизэйшн: Э Прэктикал Эпроуч, АйЭрЭл Пресс от Оксфорд Юниверсити Пресс, Оксфорд (Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford); Браун (изд), 1991, Эссеншал Молекула Байолоджи: Э Прэктикал Эпроуч, АйЭрЭл Пресс от Оксфорд Юниверсити Пресс, Оксфорд Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford).

В дальнейшем под производными следует понимать гомологи последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:11, к примеру, эукариотические гомологи, сокращенные последовательности, одноцепочечную-ДНК кодирующей и некодирующей последовательности ДНК или РНК кодирующей и некодирующей последовательности ДНК.

Кроме того, под гомологами последовательностей SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:11 следует понимать производные, например, варианты промоторов. Эти варианты могут быть изменены одним или несколькими обменами нуклеотидов, вставкой(ами) и/или удалением(ями), но без уменьшения функциональности и, соответственно, эффективности промоторов. В дальнейшем промоторы могут повышать эффективность вследствие изменения последовательности или полностью заменяться более действенными промоторами, в том числе, организмов другого вида.

Под производными следует также понимать преимущественные варианты, последовательность нуклеотидов которых в области от -1 до -2000 перед стартовым кодоном изменялись так, что экспрессия гена и/или протеина изменяется, предпочтительно повышается.

Дальше под производными нужно понимать также варианты, которые были изменены на конце 3'.

Под производными нужно понимать также антисмысловые-ДНК, которые могут использоваться для торможения биосинтеза заявляемых протеинов. Эти антисмысловые-ДНК принадлежат к заявляемым нефункциональным производным, как производные, которые не обнаруживают никакой ферментативной активности. Дальнейшие известные специалисту методы изготовления нефункциональных производных - так называемая, косупрессия, применение рибозимов и интронов. Рибозимы являются каталитическими РНК-молекулами с рибонуклеазной активностью, которые могут разрезать одноцепочечные нуклеиновые кислоты, как мРНК, к которой они обнаруживают дополнительность. Вследствие этого с помощью этих рибозимов (Хазельхофф энд Герлах, Нэйча, 334, 1988: 585-591 (Haselhoff and Gerlach, Nature, 334, 1988: 585-591)) могут каталитически расщепляться транскрипты мРНК и таким образом тормозить трансляцию этих мРНК. Подобные рибозимы могут специально перекраиваться для их задач (US 4,987,071; US 5.116.742 и Бэртель и др., Сайенс 261, 1993: 1411-1418 (Bartel et al., Science 261, 1993: 1411-1418)). С помощью антисмысловых ДНК вследствие этого могут производиться жирные кислоты, липиды или масла с повышенной долей насыщенных жирных кислот.

Заявляемые последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют Δ6-ацетиленазу/Δ6-десатуразу и/или Δ6-десатуразу, могут быть произведены синтетически или добыты природным путем или содержать смесь из синтетических и естественных составных частей, а также состоять из различных гетерологических участков гена Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы и/или Δ6-десатуразы различных организмов. В общем, производятся синтетические последовательности нуклеотидов с кодонами, которые предпочитаются от соответствующего организма хозяина, к примеру, растения. Это приводит, как правило, к оптимальной экспрессии гетерологических генов. Эти предпочитаемые от растений кодоны могут определяться из кодонов с высшей частотой протеина, которые экспримируются в большинство интересных видов растений. Пример для Corynebacterium glutamicum дан в: Уада и др., (1992) Нуклеис. Рес., 20:2111-2118 (Wada et al. (1992) Nudele Acids Res. 20:2111-2118).

Такие эксперименты выполняются с помощью стандартных методов и известны специалисту в данной области. Функционально эквивалентные последовательности, которые кодируют ген Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы и/или Δ6-десатуразы, являются такими производными заявляемых последовательностей, которые, несмотря на отклоняющуюся последовательность нуклеотидов, еще обладают желаемыми функциями, т.е. владеют ферментативной активностью протеинов. Функциональные эквиваленты охватывают, таким образом, варианты природного происхождения описанных здесь последовательностей, а также искусственные, например, полученные путем химического синтеза, приспособленные к употреблению кодона растением искусственные последовательности нуклеотидов.

Кроме того, искусственные последовательности ДНК пригодны до тех пор, пока они, как описано выше, передают желаемое качество культурным растениям, к примеру, повышение содержания тройных или двойных Δ6-связей в жирных кислотах, маслах или липидах в растениях путем сверхэкспрессии генов Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы и/или Δ6-десатуразы. Такие искусственные последовательности ДНК могут определяться, например, путем обратного перевода посредством молекулярного моделирования сконструированных протеинов, которые проявляют активность Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы и/или Δ6-десатуразы, или путем селекции in vitro. Существующие технические возможности эволюции ДНК in vitro по изменению и, соответственно, улучшению последовательностей ДНК описаны Паттен Пи. Эй. и др.. Каррент Опиньон ин Байотехнолоджи 8, 724-733 (1997) (Patten, P.A. et al.. Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733 (1997)) или в Мур Дж. Си и др., Джорнал оф Молекула Байолоджи 272, 35 336-347 (1997) (Moore, J.C. et al.. Journal of Molecular Biology 272, 35 336-347 (1997)). Особенно предпочтительны кодирующие последовательности ДНК, которые получаются обратным переводом последовательности полипептидов согласно специфическому для растения хозяина использованию кодона. Специфическое использование кодона с помощью растительно-генетических методов может легко установить опытный специалист, пользуясь компьютерными оценками других известных генов трансформируемого растения.

В качестве дальнейших подходящих эквивалентов последовательностей нуклеиновых кислот следует называть последовательности, которые кодируют протеины слияния, причем составной частью протеина слияния является полипептид Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы и/или Δ6-десатуразы или функционально эквивалентная часть этого. Вторая часть протеина слияния может быть, например, другим полипептидом с ферментативной активностью, или антигенной полипептидной последовательностью, с помощью которой возможно подтверждение экспрессии Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы и/или Δ6-десатуразы (например, myc-tag или his-tag). Предпочтительно речь идет при этом, тем не менее, о регулирующих последовательностях протеина, как, например, сигнальной последовательности для ER, которая руководит протеином Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы и/или Δ6-десатуразы в желаемом месте действия.

В заявляемом процессе гены Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы и, соответственно, Δ6-десатуразы с преимуществом могут комбинироваться с другими генами биосинтеза жирных кислот. Примерами подобных генов являются ацетилтрансферазы, другие десатуразы или элонгазы. Для синтеза in vivo и специально in vitro преимущественной является комбинация с, например, НАДФ-цитохром В 5 редуктазами, которые могут принимать или отдавать эквиваленты сокращения.

Под заявляемой последовательностью аминокислот нужно понимать протеины, которые содержат последовательности аминокислот, представленные в последовательностях SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:12, или последовательность, полученную из них путем замещения, инверсии, вставки или удаления одного или нескольких остатков аминокислот, причем ферментативная активность представленных в SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:12 протеинов сохраняется, соответственно, сокращается несущественно. Под несущественностью сокращения понимаются все ферменты, которые еще обнаруживают, по меньшей мере, 10%, предпочтительно 20%, особенно предпочтительно 30% ферментативной активности исходного фермента. При этом определенные аминокислоты могут заменяться похожими по физико-химическим свойствам (пространственная структура, основность, гидрофобность и т.д.). К примеру, аргининовые остатки обмениваются на лизиновые остатки, валиновые остатки - на изолеуциновые остатки или остатки аспрагиновой кислоты - на остатки глютаминовой. Одна или несколько аминокислот могут в порядке их следования меняться, дополняться или удаляться, или несколько из этих операций могут комбинироваться друг с другом.

Под производными нужно понимать также функциональные эквиваленты, которые, в частности, охватывают естественные или искусственные мутации первоначально изолированной кодирующей Δ6-ацетиленазу/Δ6-десатуразу и/или Δ6-десатуразу последовательности, которая в дальнейшем обнаруживает желаемую функцию, что означает незначительное сокращение ферментативной активности. Мутации охватывают замещения, сложения, удаления, обмены или вставки одного или нескольких остатков нуклеотидов. Таким образом, данным изобретением охватываются, к примеру, также такие последовательности нуклеотидов, которые получены вследствие модификации последовательности нуклеотидов Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы и/или Δ6-десатуразы. Целью такой модификации может быть, например, дальнейшее ограничение содержащейся в ней кодирующей последовательности или, например, также вставка дальнейших стыков рестрикционных центров.

Функциональные эквиваленты - это также такие варианты, функция которых, по сравнению с исходным геном и соответственно фрагментом гена, ослаблена (= не значительно сокращена) или усилена (= активность фермента более сильна, чем активность исходного фермента, это значит активность выше, чем 100%, предпочтительно выше, чем 110%, особенно предпочтительно выше, чем 130%).

Последовательность нуклеиновых кислот может при этом быть, например, преимущественно последовательностью ДНК- или кДНК. Подходящие кодирующие последовательности для вставки в заявляемую экспрессионную кассету - это такие, которые кодируют вышеописанными последовательностями Δ6-ацетиленазу/Δ6-десатуразу и/или Δ6-десатуразу и дают хозяину способность производить жирные кислоты, масла или липиды с тройными и/или двойными связями в позиции Δ6. Эти последовательности могут быть гомологического или гетерологического происхождения.

Под заявляемой экспрессионной кассетой (= конструкт или фрагмент нуклеиновой кислоты) следует понимать последовательности, упомянутые в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:11, которые получены как результат генетического кода и/или его функциональных или нефункциональных производных, которые функционально были связаны с одним или несколькими сигналами регулирования, преимущественно, для повышения экспрессии гена и которые управляют экспрессией кодирующей последовательности в клетке хозяина. Эти регулирующие последовательности должны содействовать целенаправленной экспрессии генов и протеина. Это может значить, к примеру, в зависимости от организма хозяина, что ген экспримируется и/или переэкспримируется только после индукции, или что он сразу экспримируется и/или переэкспримируется. К примеру, в случае этих регулирующих последовательностей речь идет о последовательностях, которые связывают индукторы и репрессоры и таким образом регулируют экспрессию нуклеиновой кислоты. Дополнительно к этим новым регулирующим последовательностям или вместо этих последовательностей может дополнительно присутствовать естественное регулирование этих последовательностей собственными генами структуры и при необходимости быть изменено генетически, так что естественное регулирование исключается и повышается экспрессия генов. Генный конструкт может быть построен также проще, это значит, что не давались никакие дополнительные сигналы регулирования для последовательности нуклеиновых кислот или их производных, а природный промотор с его регулированием не удалялся. Вместо этого природная регулирующая последовательность мутирует так, что никакое регулирование больше не происходит и/или экспрессия гена повышается. Эти измененные промоторы могут вводиться в форме частичных последовательностей (= промотор с частями заявляемой последовательности нуклеиновых кислот), а также только перед природным геном для повышения активности. Генный конструкт может, кроме того, также содержать преимущественно также одну или несколько так называемые "усилительные последовательности", функционально связанные с промотором, которые повышают экспрессию последовательности нуклеиновых кислот. Также на 3'-конце последовательности ДНК могут даваться вставки дополнительных дающих преимущества последовательностей, таких как дальнейшие регулирующие элементы или терминаторы. Гены Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы и/или Δ6-десатуразы могут содержаться в экспрессионной кассете (= генном конструкте) в одной или нескольких копиях.

Регулирующие последовательности и, соответственно, факторы могут при этом, как описано выше, положительно влиять на экспрессию введенных генов и вследствие этого повышать ее. Таким образом, усиление регулирующих элементов с преимуществами происходят на плоскости транскрипции, причем используются сильные сигналы транскрипции, как промоторы и/или "усилитель". Наряду с этим возможно также усиление трансляции, причем, к примеру, стабильность мРНК улучшается.

В качестве промоторов в экспрессионной кассете принципиально годны все промоторы, которые могут управлять экспрессией чужих генов в организмах, преимущественно в растениях или грибах. Предпочтительно используют, в частности, растительные промоторы или промоторы, которые происходят из вируса растений. Дающие преимущество последовательности регулирования для заявляемого способа содержатся, к примеру, в таких промоторах, как cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpplac-, lacI^q-' T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- или λ-P_L-промотор, которые находят применение преимущественно в грам-отрицательных бактериях. Следующие дающие преимущество последовательности регулирования содержатся, например, в грам-положительных промоторах amy и SP02, в дрожжевых или грибных промоторах ADC1, MFα, AC, Р-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH или в растительных промоторах, как CaMV/35S (Фрэнк и др., Селл 21 (1980) 285-294 (Franck et al. Cell 21(1980) 285-294)), SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos (= промотор нопалин синтазы) или в убиквитиновом промоторе. Экспрессионная кассета может содержать также химически индуцируемый промотор, которым может управляться экспрессия экзогенного гена Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы и/или Δ6-десатуразы в организмах, преимущественно в растениях, в определенный момент времени. Подобными дающими преимущество растительными промоторами являются к примеру deer PRPL промотор (Вард и др., Плант. Мол. Биол. 22 (1993), 361-3663 (Ward et al., Plant.Mol. Biol.22(1993). 361-3663)), индуцируемый бензенсульфонамидный (ЕР 388186), индуцируемый тетрациклиновый (Гатц и др., (1992) Плант Ж. 2397-404 (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397-404)), индуцируемый промотор салициловой кислоты (WO 95/19443), индуцируемый промотор абсцизиновой кислоты (ЕР335528) и, соответственно, этанол- или цикло-гексаноновый индуцируемый (WO93/21334) промотор. Следующими растительньми промоторами являются, к примеру, промотор цитозолической FBPase из картофеля, ST-LSI промотор из картофеля (Стокхауз и др., ЭМБО Ж.. 8 (1989) 2445-245 (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245)), промотор фосфорибосилпирофосфат амидотрансферазы из глицина макс. (см. также банк гена Акцессион номер U87999) или нодиенспецифический промотор, как в ЕР 249676, которые могут с преимуществом считаться родственньми. Преимущественными являются, в частности, такие растительные промоторы, которые обеспечивают экспрессию в тканях или в растительных частях/органах, в которых происходит биосинтез жирных кислот и, соответственно, его первые ступени, например, в эндосперме, или в развивающемся эмбрионе. В частности, следует назвать дающие преимущество промоторы, которые гарантируют специфическую семенную экспрессию, как, к примеру, USP-промотор или его производные, LЕВ4-промотор, фазеолиновый промотор или напиновый промотор. Особенно преимущественный USP-промотор или его производные способствуют в развитии семени очень ранней экспрессии гена (Баеумлайн и др., Мол. Ген. Генет., 1991, 225 (3): 459-67 (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67)). Следующими имеющими преимущество семенноспецифическими промоторами, которые могут использоваться для однодольных и двудольных растений, являются предназначенные для двудольных промоторы, такие как напинген-промотор из рапса (US 5, 608,152), олеосин-промотор из Arabidopsis (WO98/45461), фазеолин-промотор из Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), Все4-промотор из Brassica (WO91/13980) или легуминоза В4-промотор (LeB4, Баеумлайн и др., Плант Ж.. 2,2, 1992: 233-239 (LeB4, Baeumlein et al.. Plant J.. 2, 2, 1992: 233 - 239)), или предназначенные для однодольных промоторы, как lpt2- или ipt1-генов из ячменя (WO95/15389 и WO95/23230) или промоторы ячменного хордеин-гена, рисового глютелин-гена, рисового оризин-гена, рисового проламин-гена, пшеничного глиадин-гена, пшеничного глютелин-гена, кукурузного зеин-гена, овсяного глютелин-гена, казирин-гена из сорго или ржаного секалин-гена, которые описываются в WO99/16890.

Далее предпочтительны, в частности, такие промоторы, которые обеспечивают экспрессию в тканях или частях растений, в которых, например, происходит биосинтез жирных кислот, масел и липидов и, соответственно, его первые ступени. В частности, следует назвать промоторы, которые гарантируют семенноспецифическую экспрессию. Следует назвать промотор напин-гена из рапса (US 5,608,152), USP-промотор из Vicia faba (USP=неизвестный семенной протеин), (Баеумлайн и др.. Мол. Ген. Генет., 1991, 225 (З): 45 459-67 (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67)), олеосин-ген из Arabidopsis (WO98/45461), фазеолиновые-промоторы (US 5,504,200) или промотор легумин В4-гена (LeB4, Баеумлайн и др., 1992, Плант Джорнел, 2 (2): 233-9 (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9)). Дальше нужно назвать промоторы, как lpt2 или ipt1-ген из ячменя (WO95/15389 и WO95/23230), которые способствуют семенноспецифической экспрессии в однодольных растениях.

В экспрессионной кассете (= генный конструкт, конструкт нуклеиновой кислоты) могут, как описано выше, содержаться дальнейшие гены, которые должны вноситься в организмы. Эти гены могут располагаться при раздельном регулировании или под тем же регионом регулирования как гены Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы и/или Δ6-десатуразы. При этих генах речь идет, к примеру, о дальнейших генах биосинтеза, преимущественно биосинтеза жирных кислот, которые содействуют повышенному синтезу. К примеру, следовало бы назвать гены Δ15-, Δ12-, Δ9-, Δ6, Δ5-десатуразы, различных гидроксилаз Δ12-ацетиленазы, ацил-АСР-тиоэстеразы, β-кетоацил-АСР-синтазы или β-кетоацил-АСР-редуктазы. С преимуществом используются гены десатуразы в конструкте нуклеиновой кислоты.

Принципиально могут использоваться все естественные промоторы с их последовательностями регулирования, как те, что упомянуты выше, для заявляемой экспрессионной кассеты и заявляемого способа, как описано ниже. Исходя из этого, с преимуществом могут использоваться также синтетические промоторы.

При подготовке экспрессионной кассеты могут комбинироваться различные фрагменты ДНК, чтобы получить последовательность нуклеотидов, которая читает более целесообразно в правильном направлении и которая оснащена правильным растром чтения. Для связи фрагментов ДНК (= заявляемые нуклеиновые кислоты) друг с другом во фрагменты могут встраиваться адаптеры или линкеры.

Для целесообразности промотор- и терминатор-регионы могут снабжаться в направлении транскрипции линкером или полилинкером, который содержит одно или несколько мест рестрикции для вставки этой последовательности. Как правило, линкер имеет от 1 до 10, большей частью от 1 до 8, преимущественно от 2 до 6 мест рестрикции. В общем, линкер имеет в пределах регулирующих областей величину меньше, чем 100 bp, часто меньше, чем 60 bp, по меньшей мере, 5 bp. Промотор может быть как нативным, соответственно гомологичным, так и чужеродным и, соответственно, гетерологичным к организму хозяина, например, к растению хозяину. Экспрессионная кассета содержит в 5'-3'-направлении транскрипции промотор, последовательность ДНК, которая кодирует ген Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы и/или Δ6-десатуразы, и регион для транскрипциональной терминации. Различные области терминации взаимозаменяемы по отношению друг к другу как угодно.

В дальнейшем могут применяться манипуляции, которые готовят подходящие рестрикционные стыки или удаляют излишние ДНК или рестрикционные стыки. Где принимаются в расчет вставки, удаления или замещения как, например, переходы и трансверсии, могут использоваться in vitro: мутагенезы, репарация праймера, рестрикция или лигирование. При подходящей манипуляции, как, например, рестрикции, -чевинг-бэк- (-chewing-back- - операция, согласно которой рестрикционный фермент сам распознает ошибку при расщеплении нити, исправляет ошибку, после чего начинает работать в правильном месте) или наполнения выступов - тупыми концами-, для лигирования в распоряжение могут представляться концы дополнительных фрагментов.

Для имеющей преимущества высокой экспрессии среди прочего может иметь значение приложения специфического сигнала ER- ретенции SEKDEL (Шоутен А. и др., Плант Мол. Биол. 30 (1996), 781-792 (Schonten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792)), средний уровень экспрессии будет вместе с тем утроен - учетверен. Для сооружения кассеты могут применяться также другие сигналы удержания (ретенции), которые природным образом происходят при локализации в ER растительных и животных протеинах.

Предпочтительные сигналы полиаденилирования - растительные, преимущественно такие, которые соответствуют в существенной мере сигналам полиаденирования Т-ДНК из Agrobacterium tumefaciens, в частности, гена 3 Т-ДНК (Octopin Synthase) Ti-плазмида pTiACHS (Гайлен и др., ЭМБО Ж..3 (1984), 835 и на следующих страницах (Gielen et al., EMBO J.3 (1984), 835 ff)), или соответствующие функциональные эквиваленты.

Изготовление экспрессионной кассеты происходит слиянием подходящего промотора с подходящей последовательностью ДНК Δ6-ацетиленазы/Δ6-десатуразы и/или Δ6-десатуразы, а также с сигналом полиаденилирования согласно употребительной технике рекомбинации и клонирования, как, например, описывается в Т. Маньятис, Е.Ф. Фритш и Дж. Самбрук, Молекула Клонинг: Э Лаборатори Мэньюал, Колд Спринг Харбор Лаборатори, Колд Спринг Харбор, Нью Йорк (1989) (Т. Maniatis, Е.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)), также в Т.Ж. Сильхэви, М.Л. Берман и Л.В. Энкуист. Икспириментс уиз Джини Фьюжнс, Колд Спринг Харбор Лаборатори, Колд Спринг Харбор, Нью Йорк (1984) (T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist. Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984)) и в Аусабель Ф.М. и др., Карент протоколз ин Молекула Байолоджи, Грини Паблишинг Ассос. Энд Уайли-Интерсайнс (1987) (Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987)).

При подготовке экспрессионной кассеты могут комбинироваться различные фрагменты ДНК, чтобы получить последовательность нуклеотидов, которая читает целесообразным способом в правильном направлении и которая оснащена правильным растром считывания. Для связывания фрагментов ДНК друг с другом на них могут устанавливаться адаптеры или линкеры.

Целесообразным способом регионы промотора и терминатора могут снабжаться в направлении транскрипции линкером или полилинкером, который содержит одно или несколько мест рестрикции для вставки этой последовательности. Как правило, линкер имеет от 1 до 10, большей частью от 1 до 8, преимущественно от 2 до 6 мест рестрикции. В общем, в пределах регулирующих областей линкер имеет величину, меньше чем 100 bp, часто меньше чем 60 bp, по меньшей мере, тем не менее 5 bp. Промотор может быть как нативным, соответственно, гомологичным, так и чужим, соответственно, гетерологичным к растению хозяину. Экспрессионная кассета содержит в 5'-3'-направлении транкскрипции промотор, последовательность ДНК, которая кодирует ген D6-ацетиленазы/десатуразы и региона для транскрипциональной терминации. Различные области терминации как угодно взаимозаменяемы.

При подготовке экспрессионной кассеты различные фрагменты ДНК могут комбинироваться, чтобы получат