Агонисты рецептора-3(r3) пептида-активатора гипофизарной аденилатциклазы(расар) и способы их фармакологического применения

Агонисты рецептора-3(r3) пептида-активатора гипофизарной аденилатциклазы(расар) и способы их фармакологического применения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается новых идентифицированных полипептидов и применения таких полипептидов в терапевтических целях. Более конкретно полипептиды по настоящему изобретению применимы для стимуляции секреции инсулина бета-клетками поджелудочной железы в глюкозо-зависимом режиме, что тем самым обеспечивает возможный путь лечения тех субъектов, у которых имеется метаболическое расстройство, такое как диабет или нарушенная переносимость глюкозы, являющаяся преддиабетическим состоянием.

Предшествующий уровень техники

Диабет характеризуется нарушением метаболизма глюкозы, что, помимо прочего, проявляется в повышении содержания глюкозы в крови у больных-диабетиков. Лежащие в основе указанного дефекты позволяют классифицировать диабет на две основные группы: диабет 1-го типа или инсулин-зависимый сахарный диабет (IDDM), который возникает тогда, когда у больного наблюдается недостаток бета-клеток в поджелудочной железе, вырабатывающей инсулин, и диабет 2-го типа или инсулин-независимый сахарный диабет (NIDDM), который имеется у больных с нарушенной функцией бета-клеток и измененной активностью инсулина.

Больных с диабетом 1-го типа сейчас лечат инсулином, в то время как большинство больных с диабетом 2-го типа лечат с помощью средств, которые стимулируют функцию бета-клеток, или с помощью средств, которые усиливают восприимчивость тканей больных к инсулину. Со временем почти половина больных с диабетом 2-го типа утрачивают способность реагировать на указанные средства, после чего их переводят на инсулинотерапию. Лекарственными средствами, ныне используемыми в лечении диабета 2-го типа, являются:

Ингибиторы α-глюкозидазы (PRECOSE®, VOGLIBOSE^TM и MIGLITOL®). Ингибиторы α-глюкозидазы снижают перемещение глюкозы после принятия пищи за счет задержки всасывания глюкозы из кишечника. Такие лекарства безопасны и обеспечивают лечение больных с диабетом, выраженным в слабой и умеренной степени. Однако в научной литературе сообщается о побочных эффектах на желудочно-кишечный тракт.

Сенсибилизаторы инсулина. Сенсибилизаторы инсулина - это лекарственные средства, которые усиливают реакцию организма на инсулин. Тиозолидиндионы, такие как REZULIN^TM (троглитазон), активируют γ-рецептор PPAR и модулируют активность группы генов, которые пока точно не определены. Хотя указанные лекарства и являются эффективными, они связаны с гепатотоксичностыо. Из-за токсичного действия на печень REZULIN был изъят с фармацевтического рынка.

Средства, повышающие секрецию инсулина (сульфонилмочевины и другие средства, которые активны через АТФ-зависимый калиевый канал). СФМ обеспечивают стандартное лечение диабета 2-го типа, при котором имеется гликемия натощак от слабой до умеренной степени. Ограничения в применении СФМ связаны с возможной индукцией гипогликемии, увеличением веса и высокой частотой первичных и вторичных случаев безуспешного лечения. У 10-20% исходно получающих лечение больных не удается выявить существенный эффект лечения (первичные случаи безуспешного лечения). Вторичные случаи безуспешного лечения выявляют еще у 20-30% больных после 6 месяцев применения СФМ. Инсулинотерапия становится необходимой для 50% получавших СФМ по прошествии 5-7 лет лечения (A.J.Scheen et al., 1989, Diabetes Res. Clin. Pract., 6, 533-543).

GLUCOPHAGE™ (метформина гидрохлорид) является бигуанидом, который снижает содержание глюкозы в крови за счет подавления высвобождения глюкозы из печени и усиления периферического поглощения и утилизации глюкозы. Данное средство эффективно в снижении глюкозы в крови у больных от слабой до умеренной тяжести и не обладает побочными эффектами, связанными с увеличением веса или возможной индукции гипогликемии. Однако GLUCOPHAGE обладает рядом побочных действий, включая желудочно-кишечные расстройства и лактацидоз. GLUCOPHAGE противопоказан диабетикам старше 70 лет и больным с нарушениями функций почек или печени. Наконец, GLUCOPHAGE характеризуется той же частотой первичных и вторичных случаев безуспешного лечения, что и СМФ.

Инсулин назначают после того, как диета, упражнения и пероральные лекарственные средства не способны адекватно контролировать уровень глюкозы в крови. Такое лечение обладает недостатками, связанными с необходимостью введения инъекций, возможностью развития гипогликемии и набором избыточного веса.

С учетом имеющихся проблем в современных способах лечения терапия диабета 2-го типа нуждается в новых подходах. В частности, необходимы новые способы лечения для поддержания нормальной (глюкозо-зависимой) секреции инсулина. Такие новые лекарственные средства должны обладать следующими характеристиками: зависимостью стимуляции секреции инсулина от глюкозы, т.е. индукцией секреции инсулина только в присутствии повышенного содержания глюкозы в крови; низкой частотой первичных и вторичных случаев безуспешного лечения и сохранностью функционирования островковых клеток. Стратегия разработки новых способов лечения, описанных здесь, основывается на сигнальном механизме с участием циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) и его влияния на секрецию инсулина.

Циклический АМФ является основным регулятором процесса секреции инсулина. Повышение количества указанной сигнальной молекулы стимулирует закрытие калиевых каналов с последующей активацией механизма протеинкиназы-А. Закрытие калиевых каналов обусловливает деполяризацию клеток и последующее открытие кальциевых каналов, что, в свою очередь, приводит к экзоцитозу инсулиновых гранул. В отсутствие глюкозы и при ее низких концентрациях отмечается слабая секреция инсулина или она вообще отсутствует (A.Weinhaus et al., 1998, Diabetes, 47, 1426-1435). Средства, повышающие секрецию, такие как пептид-активатор гипофизарной аденилатциклазы (РАСАР) и GLP-1, используют систему цАМФ для регуляции секреции инсулина в глюкозо-зависимом режиме (М.Komatsu et al., 1997, Diabetes, 46, 1928-1938). Средства, повышающие секрецию инсулина, механизм действия которых основан на повышении цАМФ, например, GLP-1 и РАСАР, также способны усиливать синтез инсулина в дополнение к секреции инсулина (G.Skoglund et al., 2000, Diabetes, 49, 1156-1164; P.Borboni et al., 1999, Endocrinology, 140, 5530-5537).

РАСАР является мощным стимулятором глюкозо-зависимой секреции инсулина бета-клетками поджелудочной железы. Были описаны три различных типа рецепторов РАСАР (R1, R2 и R3) (A.Harmar et al., 1998, Pharmacol. Reviews, 50, 265-270). РАСАР не проявляет избирательности по типу рецептора, обладая сопоставимыми активностью и сродством ко всем трем типам рецепторов. R1 в основном находится в ЦНС, в то время как R2 и R3 распределены более широко. R2 локализован в ЦНС, а также в печени, легких и кишечнике. R3 находится в ЦНС, поджелудочной железе, скелетной мускулатуре, сердце, почках, жировой ткани, семенниках и желудке. Недавние исследования подтвердили, что R3 ответствен за секрецию инсулина бета-клетками (N.Inagaki et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 2679-2683). Инсулинотропное действие РАСАР опосредовано ГТФ-связывающим белком Gs. Накопление внутриклеточного цАМФ, в свою очередь, активирует неспецифичные катионные каналы в бета-клетках, повышая Са⁺⁺, и стимулирует экзоцитоз инсулин-содержащих секреторных гранул.

РАСАР является новейшим представителем суперсемейства метаболических, нейроэндокринных и нейротрансмиттерных пептидных гормонов, действие которых опосредуется механизмом передачи сигнала с участием цАМФ (Arimura, 1992, Regul. Peptides, 37, 287-303). Биологически активные пептиды высвобождаются из биосинтетического предшественника в двух молекулярных формах - в виде 38-аминокислотного пептида (РАСАР-38) и/или 27-аминокислотного пептида (РАСАР-27) с амидированными С-концами (Arimura, цит. выше).

Наивысшие концентрации двух форм пептида найдены в головном мозге и семенниках (обзор Arimura, цит. выше). Более короткая форма пептида - РАСАР-27 - проявляет 68% структурного сходства с вазоактивным кишечным полипептидом (VIP). Однако распределение РАСАР и VIP в центральной нервной системе указывает на то, что указанные структурно родственные пептиды имеют различные нейротрансмиттерные функции (Koves et al., 1991, Neuroendocrinology, 54, 159-169).

Недавние исследования показали разнообразие биологических действий РАСАР-38 - от участия в репродуктивных процессах (McArdle, 1994, Endocrinology, 135, 815-817) до способности стимулировать секрецию инсулина (Yada et al., 1994, J.Biol. Chem., 269, 1290-1293).

Вазоактивный кишечный пептид (VIP) является пептидом из 28 аминокислот, который впервые был выделен из верхней части тонкого кишечника хряка (Said & Mutt, 1970, Science, 169, 1217-1218; патент США №3879371). Данный пептид относится к семейству структурно родственных небольших полипептидов, которое включает хелодермин, секретин, соматостатины и глюкагон. Биологические эффекты VIP опосредуются активацией локализованных на клеточных мембранах белков-рецепторов, которые вовлечены в сигнальную систему с участием внутриклеточного цАМФ. Указанные рецепторы исходно были известны как VIP-R1 и VIP-R2, однако впоследствии было установлено, что они являются теми же рецепторами, что и PACAP-R2 и PACAP-R3. VIP проявляет сопоставимые уровни активности и действия в отношении PACAP-R2 и PACAP-R3.

Для повышения стабильности VIP в легочной жидкости человека серия вариантов VIP (Bolin et al., 1995, Biopolymers, 37, 57-65) была сформирована для того, чтобы повысить склонность данного пептида к образованию спирали и снизить его протеолитическое разрушение. Замены проводили по положениям аминокислот 8, 12, 17 и 25-28, для которых была показана важность для связывания на рецепторе. Более того, последовательность "GGT" была присоединена в качестве метки к С-концу мутантных вариантов VIP с надеждой на более эффективное копирование спирали. Наконец, для дальнейшей стабилизации спирали был синтезирован ряд циклических вариантов (патент США №5677419). Хотя описанные усилия не были направлены на достижение рецепторной избирательности, в результате были получены два аналога (обозначаемые здесь как R3P0 и R3P4), которые обладали более чем 100-кратной избирательностью в отношении PACAP-R3 (Gourlet et al., 1997, Peptides, 18, 403-408; Xia et al., 1997, J.Pharmacol. Exp. Ther., 281, 629-633).

GLP-1 секретируется L-клеткой кишечника после принятия пищи и функционирует как гормон инкретин (т.е. он стимулирует зависимый от глюкозы выход инсулина из бета-клетки поджелудочной железы). Он является пептидом, состоящим из 37 аминокислот, который дифференцированно экспрессируется с гена глюкагона, что определяется типом ткани. Для GLP-1 были получены клинические данные, которые подтверждают полезный эффект повышения уровней цАМФ в бета-клетках. Инфузия GLP-1 пациентам с трудноизлечиваемым диабетом 2-го типа нормализовала у них уровни глюкозы в крови натощак (М.Gutniak et al., 1992, New England J.Med., 326, 1316-1322), а более продолжительная инфузия улучшала функцию бета-клеток до уровня, характерного для здоровых субъектов (J.Rachman et al., 1996, Diabetes, 45, 1524-1530). В недавнем сообщении было показано, что GLP-1 улучшает способность бета-клеток реагировать на глюкозу у субъектов с нарушенной переносимостью глюкозы (М.Byrne et al., 1998, Diabetes, 47, 1259-1265). Однако все указанные эффекты оказываются кратковременными из-за короткого времени полужизни пептида. Недавно фирма Novo Nordisk приостановила клинические испытания GLP-1. Как было сообщено, такая неудача обусловливалась очень коротким временем полужизни пептида в плазме, составляющим несколько минут.

EXENDIN-4^TM. Фирма Amylin Pharmaceuticals проводит клинические испытания I фазы с препаратом EXENDIN-4 (AC2993) - 39-аминокислотным пептидом, который изначально был идентифицирован у ящерицы-ядозуба. Недавно испытания перешли во II фазу. Amylin сообщил о преклинических результатах, указывающих на 4-часовую эффективность и эффективность в животных моделях при подкожном, пероральном и интраназальном введении AC2993. Однако при дозах 0,2 и 0,3 мкг/мг часто возникали головные боли, постуральная гипотензия, понос и рвота.

Имеется необходимость в усовершенствованном пептиде, который бы обладал глюкозо-зависимой активностью РАСАР, GLP-1 или EXENDIN-4 по усилению секреции инсулина и также проявлял более слабые побочные действия.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение представляет новые полипептиды, которые функционируют in vivo в качестве агонистов рецептора PACAP-R3 (далее - R3) и эффективны в лечении заболеваний и состояний, которые могут быть улучшены с помощью средств, обладающих активностью агонистов R3. Предпочтительно полипептиды по настоящему изобретению являются селективными агонистами R3, обладающими большей эффективностью в отношении R3 по сравнению с R2 и R1. В качестве примера, но не с целью ограничения, указанные полипептиды стимулируют синтез инсулина и секрецию его бета-клетками поджелудочной железы в глюкозо-зависимом режиме с последующим снижением уровня глюкозы в плазме. Было показано, что указанные полипептиды-усилители секреции инсулина стимулируют секрецию инсулина островковыми клетками крысы и человека in vitro и in vivo. В отличие от РАСАР-27 указанные полипептиды-усилители секреции также снижают уровень глюкозы in vivo в большей степени, чем контрольные наполнители после провокацией глюкозой.

Полипептиды по настоящему изобретению предоставляют новый способ лечения больных, например, с метаболическими расстройствами, такими как те, которые вызваны сниженной секрецией эндогенного инсулина, в частности диабет 2-го типа, или больных с нарушенной переносимостью глюкозы, являющейся преддиабетическим состоянием, и со слабым изменением секреции инсулина.

В частности, в одном аспекте настоящего изобретения представлен полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO 11-14, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 21-26, SEQ ID NO 32-36; SEQ ID NO 40-53; SEQ ID NO 57-61; SEQ ID NO 63-99; SEQ ID NO 102-119; SEQ ID NO 121-137; SEQ ID NO 139-177; SEQ ID NO 179, 180, SEQ ID NO 183-202, 322-341, а также их фрагменты, производные и варианты, которые проявляют по крайней мере одну биологическую функцию, которая по существу совпадает с таковой у полипептидов, перечисленных в SEQ ID NO (в целом обозначаются как "полипептиды по настоящему изобретению"), включая их функциональные эквиваленты. Предпочтительным вариантом настоящего изобретения является полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO 12, 18, 21-26, 32-35, 41, 43-53, 63, 66, 70-92, 94-99, 102-104, 107, 109, 112-119, 121-137, 139, 140, 142-156, 156-174, 187, 322-341, а также их фрагменты, производные и варианты, которые проявляют по крайней мере одну биологическую функцию, которая по существу одинакова с таковой у полипептидов, перечисленных в SEQ ID NO. Более предпочтительным вариантом настоящего изобретения является полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO 18, 24, 25, 32, 33, 43-50, 52, 53, 70-87, 92, 98, 99, 104, 107, 112-114, 129-131, 137, 140, 144, 147-151, 156-159 и 161-173, 323, 324, 326, 327, 335, 338, 341 и их фрагменты, производные и варианты, которые проявляют по крайней мере одну биологическую функцию, которая по существу одинакова с таковой у полипептидов, перечисленных в SEQ ID NO. Наиболее предпочтительным вариантом настоящего изобретения является полипептид, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO 18, 32, 43, 45, 47, 50, 52, 71, 72, 83, 86 и 87, а также их фрагменты, производные и варианты, которые проявляют по крайней мере одну биологическую функцию, которая по существу одинакова с таковой у полипептидов, перечисленных в SEQ ID NO.

Другим вариантом воплощения настоящего изобретения являются полинуклеотид, который кодирует полипептиды по настоящему изобретению, а также соответствующие векторы и клетки-хозяева, необходимые для рекомбинантной экспрессии полипептидов по настоящему изобретению. Указанные полинуклеотидные последовательности включают те, которые идентифицированы как SEQ ID NO 204, 207-211, 214-230 и 232-321. Предпочтительные полинуклеотиды включают те, которые идентифицированы как SEQ ID NO 204, 207-209, 215, 217-230, 232-234, 237, 239, 242-268, 270-281 и 284-321. Более предпочтительные полинуклеотиды включают те, которые идентифицированы как SEQ ID NO 207, 218-224, 226-230, 234, 237, 242-244, 258-260, 266, 268, 272, 275-279, 284-287, 289-301 и 303, 304, 306, 307, 318 и 321. Наиболее предпочтительные полинуклеотиды включают те, которые идентифицированы как SEQ ID NO 217, 221 и 226.

Антитела и фрагменты антител, которые избирательно связываются с полипептидами, также представлены настоящим изобретением. Такие антитела могут использоваться для выявления полипептидов по настоящему изобретению и могут быть идентифицированы и сформированы с помощью процедур, хорошо известных в данной области техники, включая те способы, которые аналогичны описанному далее в примере 17.

Также изобретение представляет способ лечения диабета и/или других заболеваний или состояний, осуществляемого с использованием полипептидов по настоящему изобретению, предпочтительно на основе функции полипептидов по настоящему изобретению в качестве агонистов R3, у млекопитающего, включающий введение упомянутому млекопитающему терапевтически эффективного количества любого из полипептидов по настоящему изобретению или любого полипептида, активного в отношении R3, например, SEQ IN NO 5 и 9.

Также заявляются способы получения полипептидов по настоящему изобретению, как рекомбинантных, так и синтетических.

Краткое описание чертежей

На фигуре 1 приведены аминокислотные последовательности полипептидов SEQ ID NO 11-14, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 21-26, SEQ ID NO 32-36, SEQ ID NO 40-53, SEQ ID NO 57-61, SEQ ID NO 63-99, SEQ ID NO 102-119, SEQ ID NO 121-137, SEQ ID NO 139-177, SEQ ID NO 179, 180, SEQ ID NO 183-202 и SEQ ID NO 322-341, которые являются заявляемыми полипептидами.

На фигуре 2 показано сопоставление последовательностей мутантных вариантов VIP и нативных полипептидов VIP, PACAP38, GLP-1, EXENDIN-4 и примеров R3-иэбирательных полипептидов. Консервативные остатки выделены жирным шрифтом и затенены темно-серым цветом, в то время как консервативные замены затенены светло-серым цветом.

На фигуре 3 приведена рестрикционная карта типичной плазмиды, кодирующей GST-химерный пептид.

На фигурах 4А-4В показаны графики, отражающие влияние GLP-1 или R3P3 на секрецию инсулина островковыми клетками крысы in vitro.

На фигуре 5 приведен график, показывающий влияние пептида R3P3 на выведение глюкозы.

На фигуре 6 приведена диаграмма, показывающая влияние РАСАР и родственных полипептидов на содержание воды в кишечнике у мышей Balb/C.

На фигуре 7 показана диаграмма, указывающая на то, что доза 1 нмоль/кг R3P3, R3P12, R3P13 или GLP-1 усиливает выведение глюкозы у крысы после подкожного введения.

На фигуре 8 приведены полинуклеотидные последовательности SEQ ID NO 54-56 и 203-301, которые кодируют полипептиды по настоящему изобретению.

Первые 6 нуклеотидов представляют собой сайт распознавания рестриктазой BamHI, после которых расположены 12 нуклеотидов, кодирующих сайт распознавания "IEGR" фактора Ха. Последние 6 нуклеотидов представляют собой сайт распознавания рестриктазами Xhol или EcoRI, a 6 нуклеотидов перед ними кодируют два стоп-кодона. Нуклеотиды между сайтом фактора Ха и стоп-кодонами кодируют аминокислотную последовательность соответствующего полипептида. Нуклеотиды между двумя рестрикционными сайтами клонируют по соответствующим рестрикционным сайтам в векторе pGEX-6P-1 (Amersham Pharmacia Biotech). Номера SEQ ID NO приведены в скобках.

На фигуре 9 отображено влияние РАСАР-27, VIP и избирательных агонистов рецептора на частоту сердечных сокращений у собак, находящихся в сознании (см. пример 15).

На фигуре 10 показано выявление R3P66 методом ТИФА с помощью поликлональных антител, выработанных в кроликах, иммунизованных С-концевой последовательностью R3P66 (Ac-CRKQVAAKKYLQSIKNKRY-COOH).

Подробное описание предпочтительных вариантов

Настоящее изобретение представляет новые полипептиды и их фрагменты, производные и варианты, проявляющие по крайней мере одну биологическую функцию, которая по существу одинакова с таковой у полипептидов фигуры 1 (вместе "полипептиды по настоящему изобретению"). Полипептиды по настоящему изобретению функционируют in vivo в качестве агонистов R3 или, иными словами, используются для профилактики и/или лечения таких заболеваний или состояний, как диабеты, астма, артериальная гипертония, проблемы в репродуктивной сфере у мужчин, включая подвижность спермы у мужчин, сердечно-сосудистые заболевания, язвы и другие состояния, идентифицированные здесь, или функционируют иным путем в соответствии с описанным здесь ниже. Предпочтительно полипептиды по настоящему изобретению должны стимулировать секрецию инсулина бета-клетками поджелудочной железы в глюкозо-зависимом режиме.

Полипептиды по настоящему изобретению являются агонистами R3. Предпочтительно они являются избирательными - агонистами R3 по крайней мере с 10-кратной избирательностью в отношении R3 по сравнению с R2 и/или R1. Более предпочтительно они являются избирательными агонистами R3 по крайней мере с 100-кратной избирательностью в отношении R3 по сравнению с R2 и/или R1. Наиболее предпочтительно они стимулируют секрецию инсулина в плазму в глюкозо-зависимом режиме без индукции застойных явлений или повышения уровня глюкозы в плазме, что является противопоказаниями при лечении, например, диабета 2-го типа. Кроме того, предпочтительно, чтобы полипептиды по настоящему изобретению являлись избирательными агонистами рецептора R3, что тем самым обусловливает, например, повышение выхода инсулина в плазму, но не являлись избирательными в отношении других рецепторов, которые ответственны за такие неприятные или опасные побочные действия, как удерживание воды в желудочно-кишечном тракте, и/или за нежелательные сердечно-сосудистые проявления, такие как повышенная частота сердечных сокращений. В настоящее время установлено, что R3-опосредованная секреция инсулина не вызывает гипогликемию, а активация R2 обусловливает выход глюкозы в плазму, что противопоказано при лечении диабета 2-го типа, и удерживание воды в желудочно-кишечном тракте, и активация R1 приводит к сердечно-сосудистым проявлениям, таким как повышенная частота сердечных сокращений.

Полипептиды по настоящему изобретению представляют новый способ лечения больных со сниженной секрецией эндогенного инсулина или нарушенной переносимостью глюкозы, в частности, при диабете 2-го типа.

А. Обсуждение

РАСАР, VIP, GLP-1 и Exendin-4 являются полипептидами, способными стимулировать секрецию инсулина в глюкозо-зависимом режиме. Однако сам по себе этот факт не гарантирует снижения уровня глюкозы in vivo. Поскольку известно, что РАСАР связывается с рецепторами PACAP-R1, -R2 и -R3, а VIP, как известно, связывается с рецепторами PACAP-R2 и -R3, считалось, что они могут обладать сходными консервативными структурными свойствами. Ниже множественное сопоставление показывает соотношение первичных структур:

(где однобуквенные обозначения аминокислот можно найти у Zubay, 1988, "Biochemistry", 2d ed., MacMillan Publ., New York, p.33, и расшифрованы далее). Полипептиды по настоящему изобретению (фиг.1) наиболее близки к VIP по параметрам их первичной структуры за исключением SEQ ID NO 57-61, 66-69 и 176, 177, 179, 180, 183-202, которые наиболее близки к РАСАР.

Авторы настоящего изобретения создали новый полипептид, являющийся агонистом рецептора R3, предпочтительно избирательным агонистом R3, и/или проявляющий избирательное глюкозо-зависимое действие по усилению секрецию инсулина, причем избирательная активация рецептора PACAP-R3 действительно приводит к глюкозо-зависимому механизму секреции инсулина бета-клетками поджелудочной железы с соответствующим снижением уровня глюкозы in vivo. В свете изложенного авторы изобретения вначале исследовали структуры РАСАР-27 и VIP с целью определения остатков, которые наиболее вероятно ответственны за рецепторную избирательность. Известно, что РАСАР и VIP не снижают уровень глюкозы in vivo, но, напротив, стимулируют высвобождение глюкозы из печени. Было показано, что активация R2 повышает уровни глюкозы в плазме in vivo. Ранее были получены разнообразные мутантные варианты и РАСАР, и VIP, что имело различные цели. Например, серийные делеции РАСАР-27 и РАСАР-38 с обоих концов подтвердили важность обоих концевых участков для связывания на рецепторе (Gourlet et al., 1995, Eur. J.Pharm., 287, 7-11; Gourlet et al., 1996, Regul. Peptides, 62, 125-130). Связывание на мембранах головного мозга крысы и аденилатциклазная активность химерных мутантных вариантов PACAP-27/VIP показали важность N-концевых остатков РАСАР для распознавания PACAP-R1 (Ando et al., 1996, Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids, 2, 41-46). Повышение основности Leu^l7-PACAP27 и Leu¹⁷-VIP за счет мутаций K15R, K20R и K21R и достройки С-конца последовательностью GKR привело к повышению длительности релаксантной активности в трахее морской свинки, что предположительно определяется защитой от связывания с гепарином (Kashimoto et al., 1996, Ann. NY Acad. Sci., 805, 505-510). Было показано (Gourlet et al., 1996, Biochim. Biophys. Acta, 1314, 267-273), что Q16R-мутантный вариант VIP и РАСАР проявляет более высокую аффинность по сравнению с соответствующими нативными полипептидами в отношении соответственно PACAP-R2 и R1. Высокоаффинный избирательный по R2 агонист был сформирован (Gourlet et al., 1997, Peptides, 18, 1539-1545) путем получения химерного замещенного пептида [К15,R16,L27]VIP(1-7)/GRF(8-27). Ацилирование по N-концу и замена на D-Phe² у такого избирательного агониста привела к образованию мощного избирательного по R2 антагониста (Gourlet et al., 1997, Peptide, 18, 1555-1560). Мутантные варианты Y22L и Y22A VIP, но не Y22F, проявляют меньшую аффинность в отношении PACAP-R3, предполагая важность наличия ароматической группы в положении 22 для связывания на рецепторе R3, но не для связывания на рецепторе R2 (Gourlet, 1998, Eur. J.Biochem., 348, 95-99). Хелодермин и хелоспектин - VIP-подобные пептиды, выделенные из яда слюнных желез ящериц, - проявляют примерно 100-кратную избирательность в отношении рецептора PACAP-R3 (Gourlet, 1998, Ann. NY Acad. Sci., 865, 247-252). Фотоаффинное мечение РАСАР-27 путем замены F6 и Y22 на п-бензоил-L-фенилаланин (pBz) или К15, К20 и К21 на pBz₂ предположило, что К15 и F22 ближе к PACAP-R1, чем F6, К20 и К21 (Сао et al., 1997, Eur. J.Biochem., 244, 400-406; Сао et al., 1998, Ann. NY Acad. Sci., 865, 82-91).

Авторы настоящего изобретения обнаружили ряд полипептидов, которые обусловливают стимуляцию секреции инсулина в глюкозо-зависимом режиме и приводят к снижению уровня глюкозы in vivo. Указанные полипептиды обладают некоторым сходством с VIP и РАСАР. В частности, множественное сопоставление показало следующее:

Однако в научной или патентной литературе нет информации, которая бы указывала на то, что выбранные модификации последовательностей VIP и РАСАР приводят к получению полипептида, обладающего способностью стимулировать секрецию инсулина в глюкозо-зависимом режиме и снижать концентрацию глюкозы в плазме.

Некоторые термины, используемые в данной заявке, будут определены теперь, а другие термины - по мере их введения. Однобуквенные обозначения конкретных аминокислот, соответствующие им аминокислоты и трехбуквенные аббревиатуры таковы: А - аланин (Ala); С - цистеин (Cys); D - аспарагиновая кислота (Asp); Е - глутаминовая кислота (Glu); F - фенилаланин (Phe); G - глицин (Gly); H - гистидин (His); I - изолейцин (Ile); К - лизин (Lys); L - лейцин (Leu); М - метионин (Met); N - аспарагин (Asn); P - пролин (Pro); Q - глутамин (Gln); R - аргинин (Arg); S - серин (Ser); Т - треонин (Thr); V - валин (Val); W - триптофан (Trp); Y - тирозин (Tyr).

Термин "полинуклеотид, кодирующий полипептид" охватывает полинуклеотид, который включает только кодирующую полипептид последовательность, а также полинуклеотид, который включает дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность. Также настоящее изобретение касается полинуклеотидов, которые гибридизуют с описанными здесь выше последовательностями, если они характеризуются по крайней мере примерно 70%-ной, предпочтительно по крайней мере примерно 90%-ной и более предпочтительно по крайней мере примерно 95%-ной идентичностью последовательностей. Настоящее изобретение, в частности, касается, полинуклеотидов, кодирующих полипептиды, которые гибридизуют в жестких условиях с описанными здесь выше полинуклеотидами. По использованию в данном тексте термин "жесткие условия" обозначает "жесткие условия гибридизации". Предпочтительно гибридизация должна происходить только тогда, когда имеется по крайней мере примерно 90%-ная и предпочтительно примерно 95-97%-ная идентичность последовательностей. Полинуклеотиды, которые гибридиэуют с описанными здесь выше полинуклеотидами в предпочтительном варианте, кодируют полипептиды, которые сохраняют по существу такую же биологическую функцию или активность, что и зрелый полипептид, кодируемый молекулами кДНК.

Каждый из терминов "функциональный эквивалент" и "по существу одинаковая биологическая функция или активность" обозначает то, что уровень биологической активности составляет 30-100% или больше от той биологической активности, которую демонстрирует полипептид, с которым проводится сравнение в случае, когда биологическую активность каждого из полипептидов определяют в одной и той же процедуре. Например, полипептидом, который функционально эквивалентен полипептиду фигуры 1, будет тот полипептид, который в случае радиоиммунологического теста на сцинтилляционное приближение (RIA-SPA) цАМФ, описанного в частном примере 16, проявляет накопление цАМФ в линии клеток СНО, экспрессирующих рецептор PACAP/VIP-R2 (PACAP-R3) человека.

Полипептидом по настоящему изобретению, являющимся агонистом R3, является полипептид, который проявляет примерно 30-100% или больше максимальной активности агониста в отношении PACAP27-R3 при тестировании с помощью протокола примера 16. Предпочтительные полипептиды по настоящему изобретению, являющиеся избирательными агонистами R3 по сравнению с рецепторами PACAP-R2 и R1, - это такие полипептиды, которые проявляют отношение активности агониста R3 к активности в отношении R2 примерно 10:1 или выше, а более предпочтительно - примерно 100:1 или выше, и/или проявляют отношение активности агониста R3 по сравнению с активностью в отношении рецептора R1 примерно 10:1 или выше, а более предпочтительно - примерно 100:1 или выше тогда, когда полипептид тестируют в соответствии с протоколом примера 16 с использованием клеток, экспрессирующих соответствующие рецепторы.

"Жесткие условия гибридизации" указывают на инкубацию в течение ночи двух фрагментов полинуклеотидов, чтобы они гибридизовали при 42°С в растворе, содержащем 50% формамида, 5×SSC (750 мМ NaCl, 75 мМ цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (рН 7,6), 5×раствор Денхардта, 10% декстрансульфата и 20 мкг/мл денатурированной, подвергнутой встряхиванию ДНК спермы лосося с последующей промывкой на фильтрах в 0,1×SSC при примерно 65°С.

Термины "фрагмент", "производное" и "вариант" при употреблении их в отношении полипептидов с фигуры 1 обозначают фрагменты, производные и варианты полипептидов, которые сохраняют по существу такую же биологическую функцию или активность таких полипептидов соответствии с тем, что дополнительно описано далее.

Аналог включает прополипептид, в составе которого имеется аминокислотная последовательность полипептида по настоящему изобретению. Активный полипептид по настоящему изобретению может быть отщеплен от дополнительных аминокислот, которые составляют полную полипептидную молекулу, с участием естественных процессов in vivo или с помощью процедур, хорошо известных в данной области техники, например, каталитического или химического расщепления. Например, 28-аминокислотный нативный пептид VIP в естественных условиях экспрессируется в виде существенно более длинного полипептида, который затем процессируется in vivo с высвобождением 28-аминокислотного активного зрелого пептида.

Фрагмент является частью полипептида, который по существу сохраняет такую же функциональную активность, которую выявляют в моделях in vivo, описанных далее в данном тексте.

Производное охватывает все модификации полипептида, которые по существу сохраняют функции, описанные здесь, и включает дополнительную структуру и сопутствующую ей функцию, например, ПЭГилированные полипептиды, которые характеризуются более высоким временем полужизни, химерные полипептиды, которые обладают свойствами специфичности в отношении какой-либо мишени, или дополнительной активностью, такой как токсичность в отношении конкретной мишени в соответствии с описанным здесь далее.

Полипептиды по настоящему изобретению могут быть рекомбинантными полипептидами, природными очищенными полипептидами или синтетическими полипептидами.

Фрагмент, производное или вариант полипептидов по настоящему изобретению может являться (i) таковым, в котором один или большее число аминокислотных остатков заменены на консервативные или неконсервативные аминокислотные остатки (предпочтительно на консервативный аминокислотный остаток), и такой замененный аминокислотный остаток может кодироваться или не кодироваться генетическим кодом; или (ii) таковым, в котором один или больше число аминокислотных остатков включают замещающую группу; или (iii) таковым, в котором зрелый полипептид химеризован с другим соединением так, что соединение увеличивает время полужизни полипептида (например, полиэтиленгликоль); или (iv) таковым, в котором дополнительные аминокислоты химеризованы со зрелым полипептидом так, что образуют лидерную или секреторную последовательность или последовательность, которая используется для очистки зрелого полипептида, или прополипептидную последовательность; или (v) таковым, в котором полипептидная последовательность химеризована с более крупным полипептидом, например, человеческий альбумин, антитело или фрагмент Fc, с целью продления действия. Такие фрагменты, производные или варианты и аналоги рассматриваются как попадающие в объем понятного специалистам в данной области техники исходя из изложенного в данном тексте.

Предпочтительно производные по настоящему изобретению должны включать консервативные аминокислотные замены (определены здесь далее), произведенные по одному или нескольким предсказанным, предпочтительно неключевым аминокислотным положениям. "Неключевой" аминокислотный остаток обозначает остаток, который может быть изменен в последовательности белка дикого типа без изменения биологической активности, в то время как "ключевой" аминокислотный остаток для биологической активности необходим. "Консервативной аминокислотной заменой" является замена, при которой аминокислотный остаток заменяется на аминокислотный остаток, имеющий сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области техники. Такие семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), β-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Неконсервативные замены не должны производиться по консервативным аминокислотным остаткам или по аминокислотным остаткам в пределах консервативного белкового домена, таким как остатки 19 и 27, поскольку указанные остатки являются ключевыми для активности белка, такой как активность в отношении R3 и/или избирательность в отношении R3. Фрагменты или биологически активные части охватывают полипептидные фрагменты, пригодные для использования в качестве лекарственного средства, для получения антител, в качестве исследовательского реагента и подобного. Фрагменты включают пептиды, имеющие аминокислотные последовательности, по существу сходные с или производные от аминокислотных последовательностей полипептида по настоящему изобретению и проявляющие по крайней мере одну активность такого полипептида, но которые включают меньшее число аминокислот по сравнению с описанными в данном тексте полнораэмерными полипептидами. Обычно биологически активная часть включает домен или мотив, имеющий по крайней мере одну активность полипептида. Биологически активная часть полипептида может являться пептидом, который, например, состоит из 5 или большего числа аминокислот. Такие биологически активные части могут быть получены синтетически или с помощью рекомбинантных методов и могут быть протестированы по одной или нескольким функциональным активностям полипептида по настоящему изобретению с помощью способов, описанных в данной заявке и/или известных в данной области техники.

Более того, предпочтительные производные по настоящему изобретению охватывают зрелые полипептиды, которые были химеризованы с другим соединением таким образом, что соединение увел