Катионные блок-сополимеры

Катионные блок-сополимеры

Реферат

Из международной заявки WO-98/59064 известны блок-сополимеры полиэтиленимина (PEI) и полиэтиленгликоля (PEG) и их применение в качестве носителя для транспортировки нуклеиновой кислоты в высшие эукариотические клетки. Описанный сополимер состоит из разветвленного полиэтиленимина и линейного полиэтиленгликоля. Для обработки полиэтиленгликолем (ПЭГилирования) полиэтиленимина используют полиэтиленгликольметоксисукцинимидилпропионат.

S.V.Vinogradov, Т.К.Bronich и A.V.Kabanov (Bioconjugate Chem., 9, 805-812 (1998)) описывают получение блок-сополимеров полиэтиленимина и полиэтиленгликоля и блок-сополимеров полиспермина и полиэтиленгликоля за счет использования разветвленного полиэтиленимина и разветвленного полиспермина путем реакции сочетания с активированным с помощью 1,1'-карбонилдиимидазола монометоксиполиэтиленгликолем. Сополимеры применяют для комплексообразования с олигонуклеотидами.

В статье L.M.Bronstein, M.Antonietti и др. (Inorganica Chimica Acta, 280, 348-354 (1998)) описываются блок-сополимеры полиэтиленимина и полиэтиленгликоля и их получение путем реакции сочетания разветвленного полиэтиленимина с монометоксиполиэтиленгликолем, который обладает концевой группой хлорангидрида кислоты, и их применение для получения коллоидов металлов.

Статья V.Toncheva и др. (Biochimica et Biophysika Acta, 138, 354-358 (1998)) касается блок-сополимеров, состоящих из поли(L-лизина) и некоторых гидрофильных полимеров, также как полиэтиленгликоль, декстран и поли(N-(2-гидроксипропил)-метакриламид, способа их получения и их применения в качестве носителя для переноса гена нуклеиновой кислотой.

Общим для этих известных блок-сополимеров являются следующие три момента:

1) катионный полимер имеет ответвления гидрофильного неионного полимера;

2) во всех случаях для этого реакционноспособный конец гидрофильного неионного полимера для реакции сочетания с катионным полимером активируют с помощью реагента, который в получаемом сополимере представляет собой мостик между блоками;

3) гидрофильный неионный полимер во всех случаях является линейным полимером.

Далее, из заявки США А-5204196 известны полимеры, которые содержат полиэтилениминную основную цепь, с которой с помощью изоцианата связан простой полиэтиленгликолевый эфир формулы -О(CH₂-CH₂)_n-СН₃. Эти полимеры в комбинации с неорганическими солями используют в качестве твердых электрических проводников.

Предлагаются новые катионные блок-сополимеры общих формул (I) и (II):

где А означает гидрофильный, неионный, линейный или разветвленный полимер с молекулярной массой от 100 до 10000000 г/моль, предпочтительно от 1000 до 100000 г/моль и в особенности от 5000 до 50000 г/моль;

В означает линейный или разветвленный полиэтиленимин (PEI) с молекулярной массой от 100 до 1000000 г/моль, предпочтительно от 400 до 100000 г/моль и в особенности от 400 до 50000 г/моль;

Х означает прямую связь блоков А и В или мостик со следующими структурами, С-конец которого связан с атомом азота полиэтиленимина:

-OC(O)NH(CH₂)_oNHC(O)-, где о=1-20, предпочтительно 2-10, в особенности 4-6;

-ОС(O)NH(арил)NHC(О)-, где арил означает ароматическую структурную единицу предпочтительно с 6-14 атомами углерода, состоящую из одного или нескольких ароматических ядер, которые связаны друг с другом в конденсированной или полифенильной форме, предпочтительно с одним ядром, в особенности толуил;

-О(CH₂)_рС(О)-, где р=1-10, предпочтительно 1-3, в особенности 1;

-OCH₂СН(ОН)CH₂-;

-ОС(О)- или

-O(CH₂)_q-, где q=1-20, предпочтительно 1-6, в особенности 1-3;

n означает целое число:

1) 1-200, предпочтительно

2) 1-50,

3) 1-12,

4) 1-8, или, особенно предпочтительно,

5) 2-8;

С означает линейный или разветвленный полиэтиленимин с молекулярной массой от 100 до 1000000 г/моль, предпочтительно от 400 до 100000 г/моль и в особенности от 400 до 50000 г/моль;

D означает остаток связанного через О полиэтиленгликоля формулы:

-(CH₂CH₂O)_n'-R¹,

где n' означает 3-25000, предпочтительно 10-5000 и в особенности 10-1000 и R¹ означает атом водорода, алифатический остаток, как (C₁-C₆)-алкил (метил, этил, трет-бутил и т.п.), или другую, защитную для ОН группу, как ацил (например, возможно замещенный бензоксикарбонил), возможно замещенный бензил, пиколил, или клеточный лиганд, чтобы способствовать специфическому проникновению комплекса нуклеиновая кислота-сополимер благодаря связыванию с протеинами клеточной поверхности, в особенности с рецепторами;

Y означает прямую связь блоков С и D или мостик со следующими структурами, С-конец которого связан с атомом азота полиэтиленимина:

-С(O)NH(арил)NHC(O)O-, где арил означает ароматическую структурную единицу предпочтительно с 6-14 атомами углерода, состоящую из одного или нескольких ароматических ядер, которые связаны друг с другом в конденсированной или полифенильной форме, предпочтительно с одним ядром, в особенности толуил;

-(CH₂)_tС(О)О-, где t=2-10, предпочтительно 2-3, в особенности 2;

-CH₂СН(ОН)CH₂O- или

-(CH₂)_uO-, где u=1-20, предпочтительно 1-6, в особенности 1-3;

и

m означает целое число:

1) 1-200, предпочтительно

2) 1-100, в особенности

3) 1-50;

при условии, что остатки и переменные в формуле (II) имеют такие значения, что под эту формулу не подпадают соединения формулы (I).

Предлагаемые согласно изобретению катионные блок-сополимеры отличаются от известных блок-сополимеров по меньшей мере одним из следующих трех признаков:

1) гидрофильный неионный полимер имеет ответвления катионного полимера;

2) мостики отличаются от мостиков известных блок-сополимеров;

3) они включают разветвленный гидрофильный неионный полимер.

Под А понимают состоящие предпочтительно из углерода и кислорода линейные или разветвленные полимеры, которые, в случае необходимости, также могут содержать циклические, звездообразные или дендритные структуры, как, например, остатки линейного полиэтиленгликоля, многократно разветвленных полиэтиленгликолей, звездообразных полиэтиленгликолей, полисахаридов, включая циклодекстрины, поливинилового спирта, арборолов (дендримеров с концевыми гидроксильными группами), предпочтительно, однако, линейного и многократно разветвленного и звездообразного полиэтиленгликоля. Указанные последними полимеры выпускаются, в частности, фирмами Aldrich, Fluka, Sigma и Shearwater.

Под В и С понимают линейные или разветвленные полиэтилениминные остатки, которые отвечают формуле (III):

в которой R² означает одинаковые или разные остатки и представляет собой атом водорода или остаток формулы (IV):

где R³ означает одинаковые или разные остатки, которые имеют указанное для R² значение;

А^- означает эквивалент пригодного, предпочтительно неорганического, аниона, как ОН^-, Cl^-, Br^- и т.п.;

х и х' являются одинаковыми или разными и означают 1 или 2;

y и y' являются одинаковыми или разными и означают целые числа, которые выбирают таким образом, что остатки В или соответственно С имеют долевую молекулярную массу от 100 до 1000000 г/моль, предпочтительно от 400 до 100000 г/моль и в особенности от 400 до 50000 г/моль, причем у' также может означать 0;

z и z' являются одинаковыми или разными и z=х-1 и z'=х'-1;

и

w и w' являются одинаковыми или разными целыми числами, которые выбирают таким образом, что компенсируются положительные заряды в остатках формул (III) и (IV).

Полиэтиленимины могут быть получены сами по себе известным образом или они выпускаются в продажу фирмой BASF под торговыми названиями Lupasol® или под названием полиэтиленимин или этилениминный полимер с различными молекулярными массами от 400 до 2000000 г/моль (фирмы Aldrich, Sigma, Fluka или непосредственно фирма BASF). В случае В предпочтительны полиэтиленимины с молекулярной массой от 400 до 2000 г/моль и в случае С предпочтительны полиэтиленимины с молекулярной массой от 400 до 800000 г/моль, особенно предпочтительно от 400 до 25000 г/моль.

Описанные под обозначением D группы представляют собой остатки полиэтиленгликолей, которые на конце защищены остатком R¹, как, например, метил или другая пригодная защитная группа. R¹, однако, также может означать группу, которая выполняет специфическую или неспецифическую биологическую функцию, в особенности лиганд для взаимодействий с рецепторами для специфического к клетке-мишени проникновения комплекса блок-сополимер - биологически активное вещество в высшие эукариотические клетки и их клеточные ядра, причем биологически активное вещество представляет собой предпочтительно олигонуклеотид или ген (ген-мишень). Следовательно, R¹ также может означать лиганд для специфического взаимодействия и проникновения в ткань или клетки органа-мишени, например, протеинов, в особенности антител или фрагментов антител, как Fab, F(ab)₂, scFv, цито- или лимфокинов, как интерлейкины (IL-2 до х), интерферона GM-CSF, факторов роста, как EGF, PDGF, FGF, ЕРО, интегринов, как ICAM, VCAM, или гликопротеинов, как лектины или гликозилированные протеины (см. выше), или липопротеинов, как LDL, HDL, или транспортных протеинов, как трансферрин, или пептидов, как LH-RH, кальцитонин, окситоцин, инсулин, соматостатин, IGF, RGD, или углеводов, как галактоза, манноза, глюкоза, лактоза, или гормонов, как стероиды, THR, или витаминов, как B₁₂, фолиевая кислота.

Изобретение относится также к способам получения соединений формулы (I), отличающимся тем, что:

а) соединения общей формулы (V):

где А и n имеют указанное для формулы (I) значение, вводят во взаимодействие с диизоцианатом, предпочтительно гексаметилен-диизоцианатом, и образующееся в результате этого соединение вводят во взаимодействие с полиэтилениминами общих формул (III) и (IV); или

b) соединения общей формулы (VI):

(где А и n имеют указанное для формулы (I) значение)

при полимеризации этиленимина добавляют к реакционной смеси с самого начала реакции полимеризации или лишь позднее в процессе реакции полимеризации; или

c) соединения общей формулы (VII):

где А имеет указанное для формулы (I) значение и R⁴ означает алифатический или ароматический остаток, предпочтительно п-толуил, фторид, трифторметил или метил,

используют в качестве макроинициатора для полимеризации этиленимина.

Соединения формулы (VI) выпускаются с различными молекулярными массами, например, фирмой Shearwater.

Соединения общей формулы (VII) получают путем взаимодействия соединений общей формулы (V) с соединениями общей формулы (VIII):

(где R⁴ имеет вышеуказанное значение).

Изобретение относится, далее, к способам получения соединений формулы (II), отличающимся тем, что:

d) соединения общей формулы (IX):

(где D имеет указанное для формулы (II) значение)

сначала вводят во взаимодействие с диизоцианатом, предпочтительно с гексаметилендиизоцианатом, и затем полученное соединение вводят во взаимодействие с линейным или разветвленным полиэтиленимином. В случае необходимости, введенные для защиты гидроксильных групп защитные группы само по себе известным образом отщепляют (см., например, Büllenbach, Kontakte (Merck), 1/1980, с. 23 и последующие).

Описанный в п. а) способ предпочтительно осуществляют таким образом, что, в расчете на каждую концевую гидроксильную группу полимерного блока А, используют 4-20-кратный избыток диизоцианата, предпочтительно гексаметилен-диизоцианата. Реакцию проводят в хлороформе при температурах от комнатной температуры до температуры кипения растворителя, предпочтительно, однако, при температуре кипения растворителя. Продолжительность реакции выбирают в интервале от 2 до 24 часов, предпочтительно, однако, она составляет 4 часа. Концентрация полимера в реакционной смеси составляет от 10 г/л до 500 г/л, предпочтительно 100 г/л. Продукт выделяют путем удаления растворителя при пониженном давлении и удаления избыточного диизоцианата путем многократной экстракции петролейным эфиром (пределы выкипания 40-60°С). Этот промежуточный продукт вводят во взаимодействие, в расчете на каждую концевую гидроксильную группу исходного соединения, с 3-10-кратным избытком макромолекул полиэтиленимина. Реакцию проводят в хлороформе при температурах от комнатной температуры до температуры кипения растворителя, предпочтительно, однако, при температуре кипения растворителя. Продолжительность реакции выбирают в интервале от 6 до 72 часов, предпочтительно, однако, она составляет 12 часов. Концентрации полимеров, как концентрации полиэтиленимина, так и также концентрации активированного с помощью гексаметилендиизоцианата неионного гидрофильного полимера, в реакционной смеси составляют от 10 г/л до 500 г/л, предпочтительно от 30 г/л до 200 г/л. Продукт выделяют путем осаждения полимера в 10-30-кратном избытке по объему диэтилового эфира. Путем многократного переосаждения с помощью растворителей этанола и диэтилового эфира блок-сополимер можно очищать от избыточного полиэтиленимина.

Описанный в п. b) способ осуществляют тем, что как этиленимин, так и гидрофильный неионный полимер с концевой аминогруппой находится в воде в концентрации, соответственно, от 10 г/л до 500 г/л. Молярное соотношение обоих компонентов составляет от 1:10 до 1:10000. Затем реакцию полимеризации этиленимина инициируют путем добавления пригодного катализатора, например, соляной кислоты, и смесь доводят до температуры 40-100°С. Сополимер получают путем реакции обрыва цепи. Блок-сополимер очищают от возможно образующегося в качестве побочного продукта гомополимера полиэтиленимина путем многократного переосаждения с помощью пригодных растворителей, например этанола и диэтилового эфира, и/или путем фильтрации под давлением. Вариация этого способа получения состоит в том, что гидрофильный неионный полимер с концевой аминогруппой добавляют к горячей полимеризуемой смеси лишь после известной продолжительности реакции, составляющей от 30 минут до 72 часов.

Описанный в п. с) способ осуществляют тем, что концевую гидроксильную группу (концевые гидроксильные группы) полимерного блока А вводят во взаимодействие с хлорангидридом сульфокислоты общей формулы (VIII), в особенности, однако, с хлорангидридом толуолсульфокислоты (тозилхлоридом). Эту реакцию проводят в водном и/или полярном органическом растворителе, предпочтительно в смеси воды с тетрагидрофураном, при температурах от -10°С до температуры кипения растворителя, предпочтительно при температурах от 0°С до 25°С, и (в случае, если необходимо) в присутствии катализаторов, как, например, триэтиламин или гидроксид натрия. Продукт выделяют путем удаления растворителя при пониженном давлении. Этот полимер служит в дальнейшем в качестве макроинициатора при полимеризации этиленимина. Для этого продукт общей формулы (VII) вводят во взаимодействие с этиленимином в водном или полярном органическом растворителе при температурах от 0°С до температуры кипения растворителя. Молярное соотношение обоих компонентов составляет от 1:10 до 1:10000. В случае этой реакции не образуется никакой побочный продукт. Конечный продукт можно выделять путем осаждения полимера в пригодном растворителе, как, например, диэтиловый эфир.

Описанный в п.d) способ предпочтительно осуществляют таким образом, что соединение общей формулы (IX) вводят во взаимодействие с незначительным избытком, например, 2-10-кратным избытком, диизоцианата, предпочтительно гексаметилен-диизоцианата. Реакцию проводят в хлороформе при температурах от 20°С до температуры кипения растворителя, предпочтительно, однако, при температуре кипения растворителя. Продолжительность реакции выбирают в интервале от 2 до 24 часов, предпочтительно, однако, 10-14 часов. Концетрация полимера в реакционной смеси составляет от 10 г/л до 500 г/л, предпочтительно от 30 г/л до 150 г/л. Продукт выделяют путем удаления растворителя при пониженном давлении и удаления избыточного диизоцианата путем многократной экстракции петролейным эфиром (пределы выкипания 40-60°С). Этот промежуточный продукт вводят во взаимодействие с макромолекулой полиэтиленимина в молярном соотношении от 1:1 до 100:1. Реакцию проводят в хлороформе и, в случае, если необходимо, с добавлением диметилформамида при температурах от комнатной до температуры кипения растворителя, предпочтительно, однако, при температуре 60-70°С. Продолжительность реакции выбирают в интервале от 6 до 72 часов, предпочтительно, однако, она составляет 12 часов. Концентрации полимера, как концентрации полиэтиленимина, так и концентрации активированного с помощью гексаметилендиизоцианата неионного гидрофильного полимера, в реакционной смеси составляют от 10 г/л до 500 г/л, предпочтительно от 30 г/л до 200 г/л. Продукт выделяют путем осаждения полимера в 10-30-кратном избытке по объему диэтилового эфира.

По сравнению с полиэтиленимином новые соединения обладают следующими свойствами.

Блок-сополимеры в тесте на цитотоксичность проявляют более незначительную токсичность, чем гомополимеры полиэтиленимина, и дольше остаются в кровообращении (см. раздел «Биологические примеры»).

Блок-сополимеры, в зависимости от структуры, являются в большей или меньшей степени поверхностно-активными веществами, которые могут найти применение в качестве поверхностно-активных веществ.

Сверх того, блок-сополимеры можно также применять:

- в клеевых и лакокрасочных системах в качестве добавки;

- в качестве фиксаторов для повышения прочности бумаги;

- в качестве грунтовки для полимерных многослойных систем, как, например, многослойные упаковочные пленки;

- для модификации пластмасс (улучшение окрашиваемости, лакируемости, барьерного действия);

- для фиксации реактивных красителей на хлопке;

- в качестве средств для флокуляции и диспергаторов в случае находящихся во взвешенном состоянии высокодисперсных веществ в промышленных сточных водах;

- для связывания солей тяжелых металлов;

- для диспергирования органических и неорганических пигментов;

- в качестве добавки в керамических и цементных составных частях;

- для самых различных функций в косметике по уходу за кожей и волосами, а также в области стоматологии;

- для фиксации лекарственных биологически активных веществ или биологически активных соединений на поверхностях;

- для фильтрации эндотоксинов и патогенов из плазмы крови;

- для пенетрации через слизистую оболочку.

Кроме того, блок-сополимеры в водных системах образуют комплексы с полинуклеиновыми кислотами, как ДНК и РНК, включая рибозимы. Благодаря этому свойству они пригодны в качестве носителей или векторов для переноса генов (пенетрация через клеточные мембраны и транслокация в клеточные ядра). Вследствие этого они могут найти применение в экспериментах по трансфекции, в генной терапии и диагностике (см. раздел «Биологические примеры»).

Изобретение, следовательно, также относится к применению соединений формулы (I) или (II), которые указаны выше и в которых, кроме того, Y означает -С(O)NH(CH₂)_sNHC(О)О-, где s может означать 1-20, предпочтительно 2-10, в особенности 4-6, для комплексования полинуклеиновых кислот, как ДНК, РНК и рибозимов, в водных системах, а также к композициям, которые включают по меньшей мере одну такую нуклеиновую кислоту и одно соединение формулы (I) или (II).

Изобретение относится также к применению указанных в вышеприведенном абзаце соединений формулы (I) или (II) в качестве поверхностно-активных веществ.

Следующие примеры служат для пояснения изобретения, не ограничивая его объема.

ХИМИЧЕСКИЕ ПРИМЕРЫ

Пример 1

Получение блок-сополимера PEI(PEG)_n

Активирование mPEG-550

В круглодонную колбу емкостью 100 мл, со стержнем магнитной мешалки, обратным холодильником и присоединенной трубкой с осушителем, вносят 10 мл хлороформа и смешивают с 7 мл (43,64 ммоль; 8 эквивалентов) гексаметилендиизоцианата (HMDI). 3 г (5,45 ммоль; 1 эквивалент) Монометилового эфира полиэтиленоксида (mPEG; М_n=550 г/моль) растворяют в 40 мл хлороформа. Этот раствор медленно при перемешивании добавляют по каплям к раствору HMDI. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 12 часов. Затем растворитель удаляют при пониженом давлении и избыточный HMDI экстрагируют 5 раз по 50 мл петролейным эфиром (пределы выкипания 40-60°С). Продукт получают с почти количественным выходом (3,9 г, 97%) в виде бесцветного жидкотекучего масла.

Получение блок-сополимера PEG с привитым PEI

В круглодонную колбу емкостью 100 мл, со стержнем магнитной мешалки, обратным холодильником и присоединенной трубкой с осушителем, вносят 1,74 г (0,1736 ммоль, 1 эквивалент) bPEI (M_w=25 кДа, М_n=10 кДа) и растворяют в 40 мл диметилформамида (ДМФА). 2,5 г (3,47 ммоль) активированного с помощью HMDI mPEG (М_n=720 Да) растворяют в 10 мл хлороформа и этот раствор при перемешивании медленно добавляют по каплям к раствору полиэтиленимина. Смесь нагревают при температуре 60-70°С в течение 12 часов. Затем смесь добавляют по каплям к 500 мл диэтилового эфира. Спустя 2 часа выделяется вязкотекучее желтоватое масло. Мутный супернатант отбрасывают и масло растворяют в 30 мл этанола. Раствор снова добавляют по каплям к 500 мл диэтилового эфира и снова выделившееся масло выделяют путем декантации. Продукт для фильтрации растворяют в этаноле и растворитель удаляют в вакуумной сушильной печи при температуре 50°С. Получают 2,8 г желтоватого, от вязкотекучего до смолообразного, масла (выход: 45%).

Исследование полимеров осуществляли с помощью ¹Н-, ¹³С-ЯМР-спектроскопии и гельпроникающей хроматографии. Нижеприводимые данные получены для полимера согласно примеру №1. Они примерно относятся к полимерам согласно другим примерам, для которых получены подобные данные.

¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃): δ (м.д.) = 1,17 (изоцианат-CH₂); 1,26 (изоцианат-CH₂); 2,30-2,72 (этиленимин-CH₂); 2,96 (изоцианат-CH₂); 3,15 (изоцианат-CH₂); 3,49 (этиленгликоль-CH₂).

¹³С-ЯМР (125МГц, CDCl₃): δ (м.д.) = 14,3 (изоцианат-CH₂); 26,2 (изоцианат-CH₂); 29,6 (изоцианат-CH₂); 36,2 (изоцианат-CH₂); 37,5 (этиленимин-CH₂); 39,1 (этиленимин-CH₂); 41,1 (изоцианат-CH₂); 47,2 (этиленимин-CH₂); 48,9 (этиленимин-CH₂); 52,8 (этиленимин-CH₂); 54,1 (этиленимин-CH₂); 58,7 (изоцианат-CH₂); 69,3 и 70,2 и 71,6 (этиленгликоль-CH₂); 156,2 (-NHC(O)O-); 161,7 (-NHC(O)NH-).

Гельпроникающая хроматография (аминоэтилметакрилатный гель, 1% муравьиной кислоты, 0,5 мл/мин, температура 25°С, калиброван против Pullulan-стандарта): М_n=8800; M_w=16400000; М_р=85000; PD=19,6; мономодальное распределение. Сравнение со смесью из PEI (Aldrich, 25 кДа) и mPEG (Aldrich, 550 Да): M_n=69000; M_w=1480000; М_р=99000 и 1100, PD=2,1; бимодальное распределение.

Исследования в отношении активности на поверхности раздела фаз полимера согласно примеру №1 осуществляли с помощью тензиометра по методу Lecomte du Nouy (кольцевой метод) при температуре 22°С. Измеряли поверхностное натяжение на границе раздела фаз раствора против воздуха. Калибровку прибора осуществляли с помощью сверхчистой воды, которую использовали в качестве растворителя для образца полимера.

Данные измерения: σ_min=51 мН/м; CMC=15 мг/мл.

Таким же образом могут быть получены (все исходные соединения получены от фирмы Aldrich):

№	Исходные соединения/гомополимеры
	Полиэтиленимин	Гидрофильный неионный полимер	Молярное соотношение PEI:PEG	Структура блок-сополимера
2	IPI Mn примерно 423	mPEG Mn примерно 550	1:1	АВ-диблок
3			1:2	АВ-триблок
4	bPI Mw примерно 800	mPEG Mn примерно 550	1:1	АВ-диблок
5			1:2	АВ-триблок
6			1:4	звездообразный
7	bPI Mw примерно 800	mPEG Mn примерно 5000	1:1	АВ-диблок
8			1:2	АВ-триблок
9			1:4	звездообразный
10	bPI Mw примерно 2000	mPEG Mn примерно 550	1:1	АВ-диблок
11			1:2	АВ-триблок
12			1:4	звездообразный
13	bPI Mw примерно 2000	mPEG Мn примерно 5000	1:1	АВ-диблок
14			1:2	АВ-триблок
15	bPI Mw примерно 25000	mPEG Mn примерно 550	1:1	АВ-диблок
16			1:2	АВ-триблок
17			1:4	звездообразный
18			1:20	звездообразный
19	bPI Mw примерно 25000	mPEG Mn примерно 2000	1:1	АВ-диблок
20			1:2	АВ-триблок
21			1:4	звездообразный
22			1:10	звездообразный
23	bPI Mw примерно 25000	mPEG Mn примерно 5000	1:1	АВ-диблок
24			1:2	АВ-триблок
25			1:4	звездообразный
26			1:10	звездообразный

Пример 27

Получение блок-сополимера PEG(PEI)_n

Активирование разветвленного полиэтиленгликоля (PEG)

В круглодонной колбе емкостью 100 мл со стержнем магнитной мешалки, обратным холодильником и присоединенной трубкой с осушителем 3,79 г (22,54 ммоль, 80 эквивалентов) HMDI растворяют в 10 мл хлороформа. К раствору HMDI при перемешивании медленно добавляют по каплям раствор 2 г (0,2 ммоль, 1 эквивалент) разветвленного PEG с восемью ответвлениями (bPEG, M_w=10 кДа) в 20 мл хлороформа. Смесь кипятят в течение 4 часов и дополнительно перемешивают в течение следующих 8 часов при комнатной температуре. Растворитель удаляют при пониженном давлении и избыточный HMDI экстрагируют 3 раза по 50 мл петролейным эфиром (пределы выкипания 40-60°С). Получают красноватое масло с 58%-ным выходом (1,38 г).

Получение блок-сополимера PEI с привитым PEG

В круглодонной колбе емкостью 100 мл, со стержнем магнитой мешалки, обратным холодильником и присоединенной трубкой с осушителем, 2,20 г (3,66 ммоль, 25 эквивалентов) разветвленного полиэтиленимина (bPEI, M_w=800 Да, M_n=600 Да) растворяют в 20 мл хлороформа. К раствору PEI при комнатной температуре при перемешивании медленно добавляют по каплям раствор 1,21 г (0,14 ммоль, 1 эквивалент) активированного с помощью HMDI bPEG (M_n=8,5 кДа) в 30 мл хлороформа. Смесь кипятят в течение 12 часов. Раствор затем при перемешивании медленно добавляют по каплям к 500 мл диэтилового эфира. Спустя 12 часов выделяется вязкотекучее желтоватое масло. Мутный супернатант отбрасывают и масло растворяют в 50 мл этанола. Раствор снова добавляют по каплям к 500 мл диэтилового эфира и снова выделившееся масло выделяют путем декантации. Продукт для фильтрации растворяют в этаноле и растворитель удаляют в вакуумной сушильной печи при температуре 50°С. Получают 1,13 г (выход 59%) желтоватого, от вязкотекучего до смолообразного, масла.

Исследование полимеров осуществляли с помощью ¹H-, ¹³С-ЯМР-спектроскопии и гельпроникающей хроматографии. Нижеприводимые данные получены для полимера согласно примеру №27. Они примерно относятся к полимерам согласно другим примерам, для которых получены подобные данные.

¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃): δ (м.д.) = 1,22 (изоцианат-CH₂); 1,36 (изоцианат-CH₂); 2,40-2,70 (этиленимин-CH₂); 3,03 (изоцианат-CH₂); 3,19 (изоцианат-CH₂); 3,55 (этиленгликоль-CH₂).

¹³С-ЯМР (125 МГц, CDCl₃): δ (м.д.) = 25,9 (изоцианат-CH₂); 29,4 (изоцианат-CH₂); 39,2 (этиленимин-CH₂); 41,2 (изоцианат-CH₂); 47,0 (этиленимин-CH₂); 48,9 (этиленимин-CH₂); 52,0 (этиленимин-CH₂); 54,2 (этиленимин-CH₂); 61,1 (изоцианат-CH₂); 69,2 и 71,1 и 72,3 (этиленгликоль-CH₂); 156,0 (-NHC(O)O-); 162,1 (-NHC(O)NH-).

Гельпроникающая хроматография (аминоэтилметакрилатный гель, 1% муравьиной кислоты, 0,5 мл/мин, температура 25°С, калиброван против Pullulan-стандарта): М_n=22000; M_w=43000; М_р=31000; PD=1,9; мономодальное распределение. Сравнение со смесью из PEG с 8 ответвлениями (Shearwater, 10 кДа) и PEI (Aldrich, 800 Да): М_n=3100; M_w=15000; М_р=12000; PD=4,91; мономодальное распределение.

Исследования в отношении активности на поверхности раздела фаз полимера согласно примеру №27 осуществляли с помощью тензиометра по методу Lecomte du Nouy (кольцевой метод) при температуре 22°С. Измеряли поверхностное натяжение на границе раздела фаз раствора против воздуха. Калибровку прибора осуществляли с помощью сверхчистой воды, которую использовали также в качестве растворителя для образца полимера.

Данные измерения: σ_min=56 мН/м; CMC=12 мг/мл.

Таким же образом могут быть получены:

№	Исходные соединения/гомополимеры
	Гидрофильный неионный полимер	Полиэтиленимин	Структура блок-сополимера
28	MPEG Mn примерно 5000 (Aldrich)	IPI Mn примерно 423 (Aldrich)	АВ
29		bPI Mn примерно 800 (Aldrich)	АВ
30		bPI Mn примерно 2000 (Aldrich)	АВ
31	LPEG Mn примерно 5000 (Aldrich)	IPI Mn примерно 423 (Aldrich)	АВА
32		bPI Mn примерно 800 (Aldrich)	АВА
33		bPI Mn примерно 2000 (Aldrich)	АВА
34	с 4 ответвлениями PEG MW примерно 15000 (Shearwater)	IPI Mn примерно 423 (Aldrich)	АВ4
35		bPI Mn примерно 800 (Aldrich)	АВ4
36		bPI Mn примерно 2000 (Aldrich)	АВ4
37	с 8 ответвлениями PEG MW примерно 10000 (Shearwater)	IPI Mn примерно 423 (Aldrich)	АВ8
38		bPI Mn примерно 800 (Aldrich)	АВ8
39		bPI Mn примерно 2000 (Aldrich)	АВ8
40	звездообразный-PEG 429 MW примерно 250000 (Shearwater)	IPI Mn примерно 423 (Aldrich)	AB13
41		bPI Mn примерно 800 (Aldrich)	AB13
42		bPI Mn примерно 2000 (Aldrich)	AB13
43	α-циклодекстрин (Aldrich)	IPI Mn примерно 423 (Aldrich)	AB18
44		bPI Mn примерно 800 (Aldrich)	AB18
45		bPI Mn примерно 2000 (Aldrich)	AB18
46	β-циклодекстрин (Aldrich)	IPI Mn примерно 423 (Aldrich)	AB21
47		bPI Mn примерно 800 (Aldrich)	AB21
48		bPI Mn примерно 2000 (Aldrich)	AB21
49	γ-циклодекстрин (Aldrich)	IPI Mn примерно 423 (Aldrich)	AB24
50		bPI Mn примерно 800 (Aldrich)	AB24
51		bPI Mn примерно 2000 (Aldrich)	AB24
52	гидролизованный на 80% ПВА Mw=9000-10000	IPI Mn примерно 423 (Aldrich)	ABn
53		bPI Mn примерно 800 (Aldrich)	ABn
54		bPI Mn примерно 2000 (Aldrich)	ABn

Пример 55

Получение сополимера полиэтиленгликоля и полиэтиленимина (способ с макрорегулятором)

В крутлодонную колбу емкостью 50 мл, со стержнем магнитной мешалки и обратным холодильником, вносят 1 г (0,2 ммоль) монометилированного полиэтиленгликоля (молекулярная масса = 5000 г/моль), который на другом конце цепи содержит аминогруппу, и растворяют в 20 мл дистиллированной воды. К этому раствору полимера добавляют 2 мл (39 ммоль) этиленимина. Полимеризацию начинают с помощью 200 мкл (2 ммоль) диметилсульфата в качестве инициатора и смесь нагревают при температуре 60°С в течение 8 дней. Затем растворитель удаляют при пониженном давлении, для того чтобы остающуюся массу снова растворить в 20 мл этанола. Раствор добавляют по каплям к 250 мл диэтилового эфира, причем полимер осаждается. Полимер выделяют путем отфильтровывания и путем выдерживания в течение 3 недель при температуре 50°С в вакуумном сушильном шкафу из него удаляют остатки растворителя. Получают 1,9 г (выход: 73%) слабо-желтоватого смолообразного полимера.

Таким же образом могут быть получены (все аминомодифицированные полиэтиленгликоли получены от фирмы RAPP Polymere, Тюбингем):

№	Исходные соединения/гомополимеры
	Полиэтиленгликоль	Полиэтиленимин	Молярное соотношение EG:EI*)	Структура блок-сополимера
56	CH3O-PEG-NH2 Mn примерно 2000	этиленимин	1:1	АВ-диблок
57			1:2	АВ-диблок
58			1:10	АВ-диблок
59	CH3O-PEG-NH2 Mn примерно 5000	этиленимин	1:1	АВ-диблок
60			1:10	АВ-диблок
61	CH3O-PEG-NH2 Mn примерно 10000	этиленимин	1:1	АВ-диблок
62			1:2	АВ-диблок
63			1:10	АВ-диблок
64	CH3O-PEG-NH2 Mn примерно 20000	этиленимин	1:1	АВ-диблок
65			1:2	АВ-диблок
66			1:10	АВ-диблок
*): EG = этиленгликоль, EI = этиленимин

Исследование полимеров осуществляли с помощью ¹Н-, ¹³С-ЯМР-спектроскопии и гельпроникающей хроматографии. Нижеприводимые данные получены для полимера согласно примеру №56. Они примерно относятся к полимерам согласно другим примерам, для которых получены очень похожие данные.

¹H-ЯМР (500 МГц, D₂O): δ (м.д.) = 2,60-3,00 (этиленимин-CH₂); 3,78 (этиленгликоль-CH₂).

¹³С-ЯМР (125 МГц, D₂O): δ (м.д.) = 38,2 (этиленимин-CH₂); 39,9 (этиленимин-CH₂); 46,2 (этиленимин-CH₂); 47,9 (этиленимин-CH₂); 51,7 (этиленимин-CH₂); 53,4 (этиленимин-CH₂); 54,8 (этиленимин-CH₂); 70,2 (этиленгликоль-CH₂).

Гельпроникающая хроматография (аминоэтилметакрилатный гель, 1% муравьиной кислоты, 0,5 мл/мин, температура 25°С, калиброван против Pullulan-стандарта): М_n=21000; M_w=40000; М_р=16000; PD=1,9; мономодальное распределение. Сравнение с СН₃О-PEG-NH₂ (RAPP Polymere; 5000 Да): М_n=9100; M_w=14000; М_р=16000; PD=1,6; мономодальное распределение.

Пример 67

Получение сополимера полиэтиленимина и полиэтиленгликоля (способ с макроинициатором)

Получение макроинициатора

В круглодонную колбу емкостью 50 мл, со стержнем магнитной мешалки и обратным холодильником, вносят 2 г (0,4 ммоль, 1 эквивалент) монометилового эфира полиэтиленгликоля (Aldrich; молекулярная масса 5000) и растворяют в 25 мл перегнанного хлороформа. К раствору полимера при перемешивании добавляют 0,31 г (1,6 ммоль, 4 эквивалента) тозилхлорида. Затем к смеси добавляют 0,22 мл (0,16 г, 1,6 ммоль, 4 эквивалента) триэтиламина в качестве катализатора. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 18 часов. Для выделения и очистки полимера раствор выливают в 500 мл диэтилового эфира. Выпавший в осадок полимер отфильтровывают, дополнительно промывают большим количеством диэтилового эфира и высушивают в вакууме. Получают 1,90 г (выход: 91%) хлопьеобразного вещества белого цвета.

Получение блок-сополимера полиэтиленимина и полиэтиленгликоля

В круглодонную колбу емкостью 25 мл, со стержнем магнитной мешалки и обратным холодильником, вводят 0,5 г (0,096 ммоль, 1 эквивалент) макроинициатора и растворяют в 10 мл дистиллированной воды. При перемешивании добавляют по каплям 1 мл (0,832 г, 19,32 ммоль, 200 эквивалентов) этиленимина и смесь нагревают при температуре 60°С в течение 24 часов. Летучие компоненты удаляют при пониженном давлении. Остается смолообразное вещество белого цвета, которое снова растворяют в 10 мл воды и осаждают с помощью 200 мл тетрагидрофурана. Полимер выделяют путем декантации и высушивают в вакууме. Получают 0,95 г (выход: 71%) желтоватого смолообразного вещества.

Таким же образом могут быть получены (все монометилполиэтиленгликоли получены от фирмы Aldrich):

№	Исходные соединения/гомополимеры
	Полиэтиленгликоль	Полиэтиленимин	Молярное соотношение EG:EI *)	Структура блок-сополимера
68	СН3О-PEG-тозил Мn примерно 750	этиленимин	1:10	АВ-диблок
69			1:50	АВ-диблок
70