Способ определения антгельминтной резистентности у паразитических нематод и скрининга препаратов против них in vitro

Способ определения антгельминтной резистентности у паразитических нематод и скрининга препаратов против них in vitro

Реферат

Изобретение относится к ветеринарной гельминтологии. Известно, что при многоразовом и длительном применении лекарственных препаратов при лечении больных животных и человека у возбудителей болезни и их потомства возникает устойчивость (резистентность) к ним и лечение становится неэффективным или слабоэффективным. В ветеринарной гельминтологической практике, особенно часто это наблюдается у стронгилят желудочно-кишечного тракта, органов дыхания и стронгилоид. В итоге владельцы животных претерпевают за счет неэффективного лечения большой экономический ущерб. Так, например, подсчитано, что в Австралии вследствие снижения эффективности двух препаратов - тиабендазола и левамизола, при развитии резистентности к ним у стронгилят пищеварительного тракта овец, составляет ежегодно 4-6 млн. долларов (J.Erdvarls et al., 1985).

Известно, что при пастбищном и стойловом содержании животных заражение вышеназванными гельминтами происходит постоянно с травой и водой.

Борьба с ними проводится путем частых дегельминтизаций животных - дачи антгельминтных препаратов два раза в месяц, в каждые два месяца, а иногда и постоянно, например, фенотиазиномеднокупорососолевой смеси в форме брикетов.

Резистентность возбудителей стронгилятозов (гемонхоза, трихостронгилеза, остертагиоза, коопериоза и др.) травоядных определяют методами in vivo и in vitro.

Метод in vivo проводят на 8-10 и более животных (овец), которых после дачи антгельминтика приходится убивать для определения эффективности через 7-14 дней. Метод дорогостоящий, громоздкий и занимает много времени.

Метод in vitro первичный: основан на получении инвазионных личинок гельминтов из яиц путем выращивания последних в фекалиях, взятых из прямой кишки животных или в искусственных средах.

Для выделения чистой культуры инвазионных личинок стронгилят пищеварительного тракта от фекалий применяют известный метод Бермана-Орлова с центрифугированием.

Выделенных инвазионных личинок помещают в растворы с различной концентрацией антгельминтика в чашках Петри и через 24 часа исследуют под микроскопом. Подчитывают не менее 100 личинок и дифференцируют их как нормальные (подвижные) и парализованные (находящиеся без движения в течение 5 секунд). Метод был предложен Martin P.J. and Le Jambre L.F. (1979) и получил название "Тест паралича личинок". Резистентность изучаемого штамма гельминтов к препарату выражают в концентрации этого препарата, которая вызывает паралич у 50% личинок этого штамма.

Однако известно, что методом Бормана-Орлова невозможно получить чистую культуру инвазионных личинок, способных заражать животных.

Полученная методом Бермана-Орлова водная взвесь личинок разной зрелости обычно мутная, с примесью частиц фекалий. Последующая очистка центрифугированием и выборка инвазионных личинок приводит многих из них к гибели, а также к ослаблению физиологических функций, что делает фактически непригодными их для объективного установления степени резистентности к испытуемым препаратам. Кроме того, проводить сертификацию полученных этим методом личинок, т.е. выбирать инвазионных личинок практически невыполнимо и бессмысленно, при этом каждую личинку надо микроскопировать при сравнительно большом увеличении (×100) с предварительным помещением их в обездвиживающие и просветляющие растворы (йода и молочной кислоты), что также действует на их физиологическое состояние.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что мы используем разработанное нами ранее устройство "Звездочка" (авт. св. №1391625 Никитин В.Ф., Павласек И., 1988) для сбора личинок и мелких нематод с целью диагностики заболевания. Устройство "Звездочка" представляет собой монолит из плексигласа и имеет 6-12 лучей в диаметре 40 мм, в середине имеется емкость в виде чаши 2,5 мл для воды. Получение зрелых личинок нематод свободных от примесей фекалий с помощью "Звездочки" основано на биологических особенностях половозрелых личинок - способность покидать первоначальную среду обитания и мигрировать в другую более благоприятную, которой служит в данном случае налитая в чашу "Звездочки" вода. С помощью "Звездочки" обеспечивается 100%-ное выделение зрелых личинок. Их не нужно отмывать и изолировать от незрелых в отличие от метода Бермана-Орлова.

Используя устройство "Звездочка", мы получаем чистую культуру половозрелых личинок, в результате чего повышается уровень техники. В течение 24 часов можно провести испытание большого количества препаратов против нематод (скрининг препаратов), установить чувствительность и устойчивость (резистентность) их к лекарственным препаратам, а также терапевтическую дозу препарата (титрация доз), что подтверждено в экспериментах.

Опыт №1 проводили на примере получения инвазионных личинок стронгилят пищеварительного тракта.

Фекалии получали от овец из хозяйств Рязанской области. Животные были заражены стронгилятами пищеварительного тракта (гемонхами, трихостронгилами, остертагиями). Фекалии весом 250-300 граммов помещали в чашках Петри в термостат с температурой в камере 26-27 градусов и культивировали 7-8 дней до получения инвазионных личинок. Последних из фекалий получали параллельно двумя методами - Бермана-Орлова и Никитина Павласека. В каждом случае брали навески фекалий по 50 грамм каждая. Взвесь личинок в воде просматривали. Оценивали их состояние, определяли степень зрелости, родовой и видовой состав по Полякову (1953). Результаты показаны в табл.1. Как видно из таблицы 1, лишь 56,33% личинок, полученных по методу Бермана-Орлова, возможно использовать для проведения опытов по определению резистентности их к антгельминтикам или испытанию лекарственных веществ (скринингу и титрации) при проведении исследований по изысканию антгельминтиков. Кроме того, при наличии во взвеси личинок "парализованных", погибших и незрелых, весьма трудно произвести выборку инвазионных и живых личинок, которые необходимы для проведения испытаний. Личинки находятся во взвеси в состоянии хаотического движения, и выбрать каждую нужную личинку чрезвычайно затруднительно. Проведение опыта по определению резистентности гельминтов к антгельминтикам на такой культуре личинок, безусловно, приводит к сугубо неправильной оценке результатов.

Получение же культуры личинок с помощью устройства "Звездочка" дает возможность практически 100%-ное получение чистых зрелых личинок кишечных и легочных стронгилят, пригодных для проведения дальнейших опытов и получения достоверных результатов, что и показано в проводимых ниже исследованиях.

Опыт №2. Проведение in vitro "Теста паралича личинок". Для этого использовали два штамма Haemonchus contortus: первый чувствительный, выделенный от овец из Рязанской области, которых никогда не лечили нилвермом, и второй штамм Haemonchus contortus - резистентный, выделенный от овец, которых регулярно дегельминтизировали нилвермом против стронгилятозов. Инвазионные личинки этого штамма были получены из Англии, г.Вейбридж, Центральная ветеринарная лаборатория.

Инвазионных личинок чувствительного штамма (Рязань) получили из фекалий овец при помощи устройства "Звездочка". Все личинки были инвазионные.

Для постановки теста готовили маточный раствор нилверма в концентрации 2000 мкг/мл, а из него серию разведений с конечной концентрацией препарата: 1000,0; 100,0; 10,0; 1.0; 0,01; 0,001 мкг/мл.

В чашки Петри объемом 5 мл вносили по 2 мл раствора антгельминтика в указанных концентрациях, а в одну равный объем воды (контроль).

Во все чашки вносили по 2 мл взвеси инвазионных личинок гельминтов резистентного и чувствительного штаммов в концентрации не менее 100 личинок в 2 мл.

Личинок выдерживали в растворах антгельминтика 24 часа при комнатной температуре.

Подсчитывали все 100 личинок и дифференцировали их как нормальные (подвижные) и парализованные (без заметного движения в течение 5 секунд).

Устанавливали летальную концентрацию (ЛК-50) - концентрацию раствора нилверма, которая вызывает паралич у 50% личинок гельминтов. Результаты показаны в таблице 2.

Из таблицы 2 видно, что наибольшей устойчивостью к нилверму обладает резистентный штамм из Великобритании. Так ингибирование всех личинок гемонхов чувствительного штамма из Рязани произошло при концентрации нилверма 10 мкг/мл, а резистентного из Великобритании - при 100,0 мкг/мл., т.е. в 10 раз больше. ЛК-50 для резистентного штамма составила 4,0 мкг/мл, а для чувствительного - 0,35 мкг/мл.

Таблица 2
Результаты теста паралича личинок Haemonchus contortus отечественного и зарубежного штаммов при разных концентрациях нилверма (НВМ)
№ п/п	НВМ, мкг/мл	Отечественный чувствительный штамм	Английский резистентный штамм
Парализован-е, %	Подвижные, %	Парализован-е, %	Подвижные, %
1	0,0	0	100	0	100
2	0,001	0	100	0	100
3	0,01	6,01	93,99	0	100
4	0,1	28,6	71,4	4	96
5	1,0	93,6	6,4	22	78
6	10,0	100	0	90	10
7	100,0	100	0	100	0,0
8	1000,0	100	0	100	0,0

Параллельно с in vitro "Тестом паралича личинок" проводили in vivo критический и контрольный тесты.

Для этой цели использовали две группы овец по 15 голов в каждой. Первая группа была заражена нилверм-резистентным штаммом Haemonchus contortus из Англии, а вторая - чувствительным штаммом из Рязани. Всех животных разделили на три группы по 10 голов в каждой. Первые две группы, зараженные резистентным и чувствительным штаммами нематод, соответственно получили нилверм в дозе 15 мг/кг, а третья - препараты не получала и служила контролем. Оценку эффективности препаратов проводили по типу "критический тест" количественным методом флотации с использованием счетной камеры ВИГИС для подсчета среднего количества яиц нематод в 1 г фекалий до и через 14 дней после введения препаратов. Кроме того, эффективность препарата определяли по типу "контрольный тест" по результатам гельминтологического вскрытия пищеварительного тракта и легких животных после их убоя по 5 голов с каждой группы через 14 дней после лечения.

В результате критический тест показал, что эффективность нилверма в дозе 15 мг/кг против Английского резистентного штамма Haemonchus contortus составила 45%, а против Отечественного чувствительного - 100% (табл.3).

Контрольный тест, с убоем животных, показал эффективность нилверма 60 и 100% соответственно.

Таблица 3
Результаты критического теста по определению эффективности нилверма против двух штаммов Haemonchus contortus
Штаммы нематод	Среднее количество яиц в 1 гр. фекалий	Снижение количества яиц в 1 гр. фекалий, %
До введения нилверма	Через 14 дней после введения нилверма
Английский - резистентный	1364,2±12,3	818,7±2,3	45
Отечественный - чувствительный	244,5±8,1	0	100

Таким образом, сравнивая результаты испытания in vitro теста, проведенного с использованием инвазионных личинок и in vivo тестов, проведенного с животными, убедительно можно сказать, что они коррелируют. Это позволяет утверждать, что in vitro тест можно использовать для проведения первичного скрининга препаратов, титрации дозы веществ при поисках антгельминтиков, а также с целью выявления антгельминтной резистентности у паразитических нематод.

Целесообразность нашего метода при оценке антгельминтной резистентности у паразитических нематод, скрининге и титрации препаратов (антгельминтиков) против них подтверждается экономической эффективностью по отношению к критическому тесту по снижению количества яиц гельминтов в фекалиях животных на примере изучения нилверма. Экономический эффект определяли по "Методическим рекомендациям определения экономической эффективности противогельминтозных мероприятий и результатов научно-исследовательских работ, изобретений и рационализаторских предложений в гельминтологии", 1986 (таблица 4). Таблица 4 показывает большое экономическое преимущество in vitro теста паралича личинок с помощью устройства "Звездочка" и возможность использования его при изыскании скрининга и титрации антгельминтиков.

Таким образом, мы считаем, что наш способ с помощью устройства "Звездочка" по технико-экономическим показателям, уровню культуры, санитарии и достоверности полученных результатов существенно превосходит способы, сходные по целевому назначению с использованием метода Бермана-Орлова.

Таблица 4
Экономическая эффективность определения чувствительности (резистентности) популяции Haemonchus contortus к нилверму при помощи in vivo и in vitro тестов
Показатели	Единица измерения	Способы
in vivo критический и контрольный тесты	in vitro тест паралича личинок
Количество животных, необходимое для проведения одного опыта	Голов	10	-
Стоимость одного животного (овцы)	Руб.	1500	-
Стоимость 10 животных	Руб.	15000	-
Затраты на содержание одного животного в 1 сутки	Руб.	60	-
Затраты на содержание 10 животных в 1 сутки	Руб.	600	-
Затраты на содержание 10 животных в 14 суток	Руб.	8400	-
Живая масса одного животного (овцы)	Кг	30	-
Доза нилверма на одно животное	Мг/кг	15	-
Количество препарата для проведения опыта	Г	4,5	0,02
Цена одного кг нилверма	Руб.	300	300
Стоимость препарата, необходимого для проведения одной пробы (на одном животном)	Руб.	14,50	0,06
Затраты труда на осуществление одной пробы	Руб.	18,30	6,50
Себестоимость проведения одной пробы	Руб.	23432,8	6,56
Экономический эффект на одну пробу	Руб.	-	23426,24

Опыт 3. Скрининг антгельминтиков при стронгилятозах животных in vitro с использованием устройства "звездочка" на зрелых личинках возбудителей.

Для проведения опыта от овец, инвазированных стронгилятами (остертагиями, трихостронгилами, буностомами и коопериями), отобрали необходимое количество фекалий, которые были растолчены и равномерно перемешаны в однородную массу.

Из этой массы по 350 г фекалий помещали в чашки Петри и культивировали в термостате (26-27°С) 8 дней, т.е. до вылупления из яиц личинок стронгилят и достижения ими инвазионной зрелости, затем в каждую чашку Петри с фекалиями вставляли устройство "звездочка".

Для скрининга отобрали нилверм, фенбендазол и его новые лекарственные формы Ф-1, Ф-2, параллельно из каждого препарата готовили растворы разной концентрации мкг/мл (0,001; 0,01; 0,1; 1,0; 5,0; 10,0; 50,0 и 100,0), которые пипеткой вносили в емкость звездочек до краев (1,5 мл). В одну из них наливали воду (контроль). Чашки Петри снова ставили на 2-3 часа в термостат, чтобы вылупившиеся инвазионные личинки заползали в растворы с препаратами. Далее из каждой чашки "звездочка" вынимали и подсчитывали количество погибших и живых (подвижных) личинок по отдельности.

Результаты опыта сведены в таблицу 5, из которой следует, что нилверм и фенбендазол, широко применяемые в ветеринарной практике, оказали высокую эффективность против личинок стронгилят, что подтвердило их высокую нематодоцидную активность. Новые лекарственные формы фенбендазола Ф-1, особенно Ф-2 оказались в 2 раза эффективнее фенбендазола, что являлось стимулом дальнейшей работы.

Таким образом, скриниг антгельминтиков методом in vitro с применением устройства "звездочка" был проведен в течение 10 дней с высокой долей достоверности, что подтверждается в опытах in vitro, а также экономической эффективностью. Чтобы провести такой объем работы in vitro понадобилось бы 6 месяцев и не менее 300 инвазированных стронгилятами овец, не считая затраты труда.

Техническим результатом изобретения является значительное сокращение сроков и материальных затрат при определении резистентности нематод и скрининга антгельминтных препаратов против них. Данные, приведенные выше в описании изобретения, подтверждают достижение указанного технического результата при реализации заявленного изобретения.

Таблица 5
Результаты эффективности (скрининга) нилверма, фенбендазола и его лекарственных форм против инвазионных личинок стронгилят in vitro
№ п/п	Препарат	Кол-во личинок	Контроль	Растворы антгельминтиков мкг/мл
0,0	0,001	0,01	0,1	1,0	5,0	10,0	50,0	100,0
1	Нилверм	Живые	124	102	106	71	42	6	0	0	0
Погиб.	0	0	0	30	58	96	115	103	98
Эф-ть, %	Контроль	0	0	29,7	58,0	94,1	100	100	100
2	Фенбендазол	Живые	134	114	125	80	75	4	0	0	0
Погиб.	0	0	0	28	62	103	105	117	97
Эф-ть, %	-	0	0	25,9	45,2	96,3	100	100	100
3	Ф-1	Живые	142	122	118	91	22	0	0	x	x
Погиб.	0	0	12	24	87	120	115	x	x
Эф-ть, %	-	0	9,2	20,9	79,8	100	100	x	x
4	Ф-2	Живые	110	102	88	49	15	0	0	x	x
Погиб.	0	10	24	54	80	106	98	x	x
Эф-ть, %	-	8,9	19,7	52,5	84,2	100	100	x	x

Библиографические данные

1. Кармалиев Р.С. Методы выявления резистентности гельминтов к антгельминтикам. Бюллетень ВИГИС, вып.54, М., 1990.

2. Кармалиев Р.С. Резистентность стронгилят пищеварительного тракта жвачных к антгельминтикам и методы ее оценки, дис.... кандидата ветеринарных наук. М., ВИГИС, 1991.

3. Котельников Г.А. Метод Бермана-Орлова. Кн. Гельминтологические исследования животных и окружающей среды. М.: Колос, 1984.

4. Никитин В.Ф., Павласек И. Авт. свидетельство №1391625 "Устройство для сбора личинок и мелких нематод из фекалий", 1988.

5. Поляков П.А. Прижизненная дифференциальная диагностика стронгилятозов пищеварительного тракта жвачных по инвазионным личинкам // Автореферат канд. дис. вет. наук. М., 1953.

6. Martin P.J. and Le Jambre L.F. Larval paralysis as in vitro assay of levamisol and morantel tartrute resistance in Ostertagia spp. // Sci. com., 1979. - Vd.3. - pp.159-164.

Способ определения антгельминтной резистентности у паразитических нематод и скрининга препаратов против них in vitro, характеризующийся тем, что выделяют зрелых личинок нематод из фекалий с использованием устройства "звездочка", выдерживают их в растворах антгельминтиков, приготовленных с помощью серийных разведений, подсчитывают количество подвижных и парализованных личинок, и определяют эффективность антгельминтика при количестве парализованных личинок, составляющем 50%.