Гуманизированное антитело, которое обладает способностью связывать erbb2 и блокировать активацию лигандом рецептора erbb (варианты) и композиция для применения при лечении рака, содержащая это антитело

Гуманизированное антитело, которое обладает способностью связывать erbb2 и блокировать активацию лигандом рецептора erbb (варианты) и композиция для применения при лечении рака, содержащая это антитело

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам к ЕrВ2 и способам лечения рака с помощью антител к ЕrВ2, таких как гуманизированные антитела к ЕrВ2.

Предпосылки создания изобретения

Семейство ErbB2-рецепторов тирозинкиназ включает важные медиаторы роста, дифференцировки и выживания клеток. Семейство рецепторов включает 4 различных представителя, в том числе рецептор эпидермального фактора роста (EGFR или ErbB1), HER2 (ErbB2 или p185^neu), HER3 (ErbB3) и HER4 (ErbB4 или tyro2).

Известно, что EGFR, кодируемый геном erbB1, вызывает злокачественные болезни у людей. В частности, повышенный уровень экспрессии EGFR был обнаружен при раке молочной железы, мочевого пузыря, легкого, головы, шеи и желудка, а также при глиобластомах. Повышенный уровень экспрессии рецептора EGF часто связывают с повышенным производством лиганда EGFR, т.е. трансформирующего фактора роста альфа (TGF-α), указанными клетками, что приводит к активации рецептора посредством аутокринного пути стимуляции (Baselga и Mendelsohn, Pharmac Ther. 64: 127-154 (1994)). Моноклональные антитела к EGFR и его лигандам TGF-α, и EGF, были изучены в качестве терапевтических агентов для лечения указанных злокачественных заболеваний (см., например, Baselga и Mendelsohn, выше, Masui и др., Cancer Research 44: 1002-1007 (1984) и Wu и др., J.Clin. Invest. 95: 1897-1905 (1995)).

Второй представитель ErbB-семейства, 185^neu, был впервые выявлен как продукт трансформирующего гена из нейробластом, обработанных химическими агентами крыс. Активированная форма проонкогена neu возникает в результате точковой мутации (замена валина на глутаминовую кислоту) в трансмембранной области кодируемого протеина. Амплификация человеческого гомолога neu была обнаружена при раке молочной железы и яичника, и она коррелирует с неблагоприятным прогнозом в отношении развития болезни (Slamon и др., Science, 235: 177-182 (1987); Slamon и др., Science, 244: 707-712 (1989); патент США 4968603). К настоящему времени в человеческих опухолях не обнаружено никаких аналогов точковых мутаций, характерных для проонкогена neu. Сверхэкспрессия ErbB2 (которая часто, но не всегда является результатом амплификации гена) также была обнаружена при других формах рака, включая карциномы желудка, эндометрия, слюнной железы, легкого, почки, ободочной кишки, щитовидной железы, поджелудочной железы и мочевого пузыря (см. среди прочего у King и др., Science, 229: 974 (1985); Yokota и др., Lancet, 1: 765-767 (1986); Fukushigi и др., Mol. Cell Biol, 6: 955-958 (1986); Geurin и др., Oncogene Res., 3: 21-31 (1988); Cohen и др., Oncogene, 4: 81-88 (1989), Yonemura и др., Cancer Res. 51: 1034 (1991); Borst и др., Gynecol. Oncol., 38: 364 (1990); Weiner и др., Cancer Res. 50: 421-425 (1990); Kern и др., Cancer Res. 50: 5184 (1990); Park и др., Cancer Res. 49: 6605 (1989); Zhau и др., Mol. Carcinog., 3: 354-357 (1990); Aasland и др., Br.J.Cancer, 57: 358-363 (1989); Williams и др., Pathiobiology, 59: 46-52 (1991) и McCann и др., Cancer, 65: 88-92 (1990)).

Сверхэкспрессия ErbB2 может наблюдаться при раке предстательной железы (Gu и др., Cancer Lett., 99: 185-189 (1996); Ross и др., Hum. Pathol., 28: 827-833 (1997); Ross и др., Cancer, 79: 2162-2170 (1997) и Sadasivan и др., J.Urol. 150: 126-131 (1993)).

Обнаружены антитела к протеиновым продуктам p185^neu крыс и человеческого ErbB2. Drebin с коллегами получили антитела к продукту гена neu крыс, т.е. p185^neu (см., например, Drebin и др., Cell, 41: 695-706 (1985); Myers и др., Meth. Enzym., 198: 277-290 (1991) и WO 94/22487. Drebin с коллегами в Oncogene, 2: 273-277 (1988) описали, что для смесей антител, реактивных в отношении двух различных областей p185^neu, обнаружено синергетическое противоопухолевое действие в отношении трансформированных neu клеток линии NIH-3T3, которые имплантировали бестимусным мышам (см. также патент 5824311, опубликованный 20 октября 1998 г.).

Hudziak и др., Mol. Cell. Biol., 9(3): 1165-1172 (1985) описали метод получения панели антител к ErbB2, основанный на использовании человеческой линии клеток рака молочной железы SK-BR-3. Относительную пролиферацию клеток SK-BR-3 после обработки антителами оценивали с помощью окрашивания монослоев фиолетовым кристаллическим через 72 ч. В этом анализе максимальное ингибирование было получено при использовании антитела, обозначенного как 4D5, которое ингибирует пролиферацию клеток на 56%. В этом анализе другие антитела панели понижали пролиферацию клеток в меньшей степени. Для антитела 4D5 также установлено, что оно сенсибилизирует сверхэкспрессирущие ErbB2 линии клеток опухоли молочной железы в отношении цитотоксических воздействий TNF-α (см. также патент США 5677171, опубликованный 14 октября 1997 г.). Антитела к ErbB2, описанные Hudziak с коллегами, дополнительно охарактеризованы Fendy и др., Cancer Research, 50: 1550-1558 (1990); Kotts и др., In Vitro, 26(3): 59A (1990); Sarup и др., Growth Regulation, 1: 72-83 (1991); Shepard и др., J.Clin. Immunol., 11(3): 117-127 (1991); Kumar и др., Mol. Cell. Biol., 11(2): 979-986 (1991); Lewis и др., Cancer Immunol. Immunother., 37: 255-263 (1993); Pietras и др., Oncogene, 9: 1829-1838 (1994); Vitetta и др., Cancer Research, 54: 5301-5309 (1994); Sliwkowski и др., J.Biol.Chem., 269(20): 14661-14665 (1994); Scott и др., J.Biol. Chem., 266(20): 14300-14305 (1991); D'souza и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 7202-7206 (1994); Lewis и др., Cancer Research, 56: 1457-1465 (1996) и Schaefer и др., Oncogene, 15: 1385-1394 (1997)).

Рекомбинантная гуманизированная версия мышиного антитела к ErbB2 4D5 (huMab4D5-8, rhuMab Her2 или HERCEPTIN®; патент США 5821377) обладает клинической активностью для пациентов с метастатическими опухолями молочной железы, которые характеризуются сверхэкспрессией ErbB2, при ее интенсивном применении перед противоопухолевой терапией (Baselga и др., J.Clin. Oncol., 14: 737-744 (1996)). Управление по контролю над качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств 25 сентября 1998 г. разрешило применение антитела, имеющего товарный знак HERCEPTIN®, для лечения пациентов, страдающих метастатическим раком молочной железы, в случае, когда в опухоли происходит сверхэкспрессия протеина ErbB2.

Другие антитела к ErbB2, обладающие различными свойствами, описаны у Tagliabue и др., Int. J.Cancer, 4: 933-937 (1991); McKenzie и др., Oncogene, 4: 543-548 (1990); Stancovski и др., PNAS (USA), 88: 8691-8695 (1991); Bacus и др., Cancer Research, 52: 2580-2589 (1992); Xu и др., Int. J.Cancer, 53: 401-408 (1993); WO 94/00136; Kasprzyk и др., Cancer Research, 52: 2771-2776 (1992); Hancock и др., Cancer Research, 51: 4575-4580 (1991); Shawver и др., Cancer Research, 54: 1367-1373 (1994); Arteaga и др., Cancer Research. 54: 3758-3765 (1994); Harwerth и др., J.Biol. Chem., 267: 15160-15167 (1992); патент США 5783167 и Klapper и др., Oncogene, 14: 2009-2109(1997).

Скрининг в отношении гомологии позволил идентифицировать два представителя семейства ЕrB2-рецепторов: ЕrВ3 (патенты США 5183884 и 5480968, а также Kraus и др., PNAS (USA), 86: 9193-9197 (1989)) и ErbB4 (EP-A 599274; Plowman и др., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90: 1746-1750 (1993) и Plowman и др., Nature, 366: 473-475 (1993)). Повышенный уровень экспрессии обоих этих рецепторов обнаружен по меньшей мере в некоторых линиях клеток рака молочной железы.

ErbB-рецепторы как правило присутствуют в клетках в различных комбинациях, и гетеродимеризация, вероятно, способствует повышению разнообразия клеточных ответов на различные лиганды ErbB (Earp и др., Breast Cancer Research and Treatment, 35: 115-132 (1995)). С EGFR связывается шесть различных лигандов: эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α), амфирегулин, гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF), бетацеллулин и эпирегулин (Groenen и др., Growth Factors, 11: 235-257 (1994)). Представители семейства протеинов херегулинов, полученных в результате альтернативного сплайсинга одного гена, являются лигандами для ErbB3 и ErbB4. Семейство херегулинов включает альфа-, бета- и гамма-херегулины (Holmes и др., Science, 256: 1205-1210 (1992); патент 5641869 и Schaefer и др., Oncogene, 15: 1385-1394 (1997); neu-факторы дифференцировки (NGF), глиальные факторы роста (GGF); индукторы активности ацетилхолинового рецептора (ARIA) и факторы, происходящие из сенсорных и моторных нейронов (SMDF) (см. обзор Groenen и др., Growth Factors, 11: 235-257 (1994); Lemke G. Molec. & Cell Neurosci, 7: 247-262 (1996) и Lee и др., Pharm. Rev. 47: 51-85 (1995)). В настоящее время обнаружены три дополнительных лиганда ErbB: неурегулин-2 (NRG-2), который связывается либо с ErbB3, либо с ErbB4 (Chang и др., Nature, 387: 509-512 (1997); и Carraway и др., Nature, 387: 512-516 (1997); неурегулин-3, который связывается с ErbB4 (Zhang и др., PNAS (USA), 94(18): 9562-9567 (1997)), и неурегулин-4, который связывается с ErbB4 (Harari и др., Oncogene, 18: 2681-2689 (1999)). HB-EGF, бетацеллулин и эпирегулин также связываются с ErbB4.

Несмотря на то что EGF и TGF-α не связываются с ErbB2, EGF стимулирует EGFR и ErbB2 к образованию гетеродимеров, которые активируют EGFR и в результате приводят к трансфосфорилированию ErbB2 в гетеродимере. Димеризация и/или трансфосфорилирование, вероятно, активирует тирозинкиназу ErbB2 (см. Earp и др., выше). Аналогично этому, когда ErbB3 совместно экспрессируется с ErbB2, образуется активный сигнальный комплекс, и антитела к ErbB2 обладают способностью разрушать этот комплекс (Sliwkowski и др., J.Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)). Кроме того, аффинность ErbB3 к херегулину (HRG) повышается и достигает более высокого уровня аффинности при совместной экспрессии с ErbB2 (см. данные Levi и др., Journal of Neuroscience, 15: 1329-1340 (1995); Morrissey и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1431-1435 (1995) и Lewis и др., Cancer Res., 56: 1457-1465 (1996)), касающиеся комплекса протеинов ErbB2-ErbB3. ErbB4, аналогично ErbB3, образует активный сигнальный комплекс с ErbB2 (Carraway и Cantley, Cell, 78: 5-8(1994)).

Краткое изложение сущности изобретения

Одном из объектов изобретения является способ лечения рака у человека, при котором раковые клетки экспрессируют рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), предусматривающий введение человеку терапевтически эффективного количества антитела, которое связывается с ErbB2.

Далее указаны различные преимущества применения антитела, которое связывается с ErbB2, для лечения таких видов рака по сравнению с лекарственными средствами, мишенью которых является EGFR. В частности, для EGFR характерен высокий уровень экспрессии в печени и коже, что приводит к очень значительному снижению концентрации активного лекарственного средства в результате его связывания с EGFR. Кроме того, для других лекарственных средств, мишенью которых является EGFR, таких как химерное антитело к EGFR C225 и низкомолекулярное лекарственное средство ZD1839, которое связывается с EGFR, характерна токсичность для кожи. Предполагается, что антитела, которые связываются с ErbB2, обладают улучшенным профилем безопасности по сравнению с такими лекарственными средствами.

В случае, когда применяемое для терапии согласно изобретению антитело блокирует активацию лигандом рецептора ErbB и/или имеет биологические характеристики моноклонального антитела 2С4, могут достигаться дополнительные преимущества. Например, в то время как лекарственные средства, мишенью которых является EGFR, взаимодействуют только с EGFR, предпочтительные антитела по изобретению (например 2С4, включая его гуманизированные варианты и/или созревшие варианты с выраженной аффинностью) могут взаимодействовать с гетеродимерами EGFR/ErbB2, ErbB3/ErbB4 и ErbB2/ErbB3. Кроме того, антитела по изобретению, которые связываются с ErbB2 и блокируют активацию лигандом рецептора ErbB, могут дополнять лекарственные средства, мишенью которых является EGFR, в то время как лекарственные средства, мишенью которых является EGFR, не могут дополнять друг друга.

Объектом изобретения также является способ лечения рака у человека, ghb при котором для раковых клеток не характерна сверхэкспрессия рецептора ErbB2, предусматривающий введение человеку терапевтически эффективного количества антитела, которое связывается с ErbB2 и блокирует активацию лигандом рецептора ErbB.

Кроме того, объектом изобретения также является способ лечения независящего от гормонов рака у человека, предусматривающий введение человеку терапевтически эффективного количества антитела, которое связывается с ErbB2 и блокирует активацию лигандом рецептора ErbB.

Кроме того, объектом изобретения также является способ лечения рака у человека, предусматривающий введение человеку терапевтически эффективных количеств (а) первого антитела, которое связывает ErbB2 и ингибирует рост раковых клеток, сверхэкспрессирующих ErbB2, и (б) второго антитела, которое связывается с ErbB2 и блокирует активацию лигандом рецептора ErbB.

Объектом изобретения также является способ лечения рака у человека, где рак выбирают из группы, включающей рак ободочной кишки, рак прямой кишки и колоректальный рак, предусматривающий введение человеку терапевтически эффективного количества антитела, которое связывает ErbB2 и блокирует активацию лигандом рецептора ErbB.

Другими объектами изобретения (среди прочего) являются формы для применения согласно вышеуказанным способам. Например, изобретение относится к формам для применения, включающим контейнер и содержащуюся в нем композицию, где композиция включает антитело, которое связывает ErbB2, а также вкладыш, на котором указано, что композиция может применяться для лечения рака, при котором происходит экспрессия эпидермального фактора роста (EGFR).

Изобретение также относится к форме для применения, которая включает контейнер и содержащуюся в нем композицию, где композиция включает антитело, которое связывает ErbB2 и блокирует активацию лигандом рецептора ErbB, а также вкладыш, на котором указано, что композиция может применяться для лечения рака, при котором не происходит сверхэкспрессия рецептора ErbB2.

Изобретение также относится к форме для применения, которая включает контейнер и содержащуюся в нем композицию, где композиция включает антитело, которое связывает ErbB2 и блокирует активацию лигандом рецептора ErbB, а также вкладыш, на котором указано, что композиция может применяться для лечения независящего от гормонов рака.

И еще одним объектом изобретения является форма для применения, которая включает (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, которая включает первое антитело, которое связывает ErbB2 и ингибирует рост раковых клеток, сверхэкспрессирующих ErbB2, и (б) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, которая включает второе антитело, которое связывает ErbB2 и блокирует активацию лигандом рецептора ErbB.

Еще одним объектом изобретения является форма для применения, которая включает контейнер и содержащуюся в нем композицию, где композиция включает антитело, которое связывает ErbB2 и блокирует активацию лигандом рецептора ErbB, а также вкладыш, на котором указано, что композиция может применяться для лечения рака, где рак выбирают из группы, включающей рак ободочной кишки, рак прямой кишки и колоректальный рак.

Объектами изобретения также являются: гуманизированное антитело, которое связывает ErbB2 и блокирует активацию лигандом рецептора ErbB; композиция, включающая гуманизированное антитело и фармацевтически приемлемый носитель; и иммуноконъюгат, представляющий собой гуманизированное антитело, конъюгированное с цитотоксическим агентом.

Кроме того, изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей гуманизированное антитело; вектору, включающему нуклеиновую кислоту; клетке-хозяину, включающей нуклеиновую кислоту или вектор; а также к способу получения гуманизированного антитела, предусматривающему такое культивирование клетки-хозяина, которая включает нуклеиновую кислоту, при котором происходит экспрессия нуклеиновой кислоты, и необязательно также предусматривающему выделение гуманизированного антитела из культуры клетки-хозяина (например, из культуральной среды клетки-хозяина).

Изобретение также относится к иммуноконъюгату, представляющему собой антитело, которое связывает ErbB2, конъюгированное с одной или несколькими молекулами калихеамицина, и применению таких конъюгатов для лечения рака, при котором происходит экспрессия ErbB2, например рака, при котором происходит сверхэкспрессия ErbB2, у человека. Предпочтительно антитело в конъюгате представляет собой моноклональное антитело 4D5, например гуманизированное антитело 4D5 (и предпочтительно huMab4D5-8 (HERCEPTIN®); или моноклональнок антитело 2С4, например, гуманизированное антитело 2С4). Антитело в конъюгате может представлять собой интактное антитело (например, интактное антитело в виде IgG₁) или фрагмент антитела (например, Fab, F(ab)₂, двойное антитело и т.д.).

Краткое описание чертежей

На фиг.1А и 1Б представлены результаты картирования эпитопов, представляющих собой остатки 22-645 во внеклеточном домене (ECD) ErbB2 (аминокислотная последовательность, включающая сигнальную последовательность, представлена на фиг.1А; SEQ ID NO: 13), проведенного с помощью анализа укороченных мутантов и сайтнаправленного мутагеназа (Nakamura и др., J. of Virology, 67(10): 6179-6191 (1993) и Renz и др. J.Cell Biol, 125(6): 1395-1406 (1994). Различные укороченные версии ECD ErbB2 или точковые мутации получали из кДНК с помощью метода полимеразной цепной реакции. Мутанты ErbB2 экспрессировали в виде слитых протеинов gD в экспрессионной плазмиде млекопитающих. В этой экспрессионной плазмиде используют промотор цитомегаловируса/энхансер с терминатором SV40 и сигналы полиаденирования, локализованные по ходу транскрипции относительно встроенной кДНК. Плазмидной ДНК трансфектировали клетки линии 293. Через 1 день после трансфекции клетки метаболически метили в течение ночи в несодержащей метионин и цистеин среде DMEM с низким содержанием глюкозы, включающей 1% подвергнутой диализу фетальной телячьей сыворотки и по 25 мкКи ³⁵S-метионина и ³⁵S-цистеина. Собирали супернатанты и к супернатанту добавляли либо моноклональные антитела к ErbB2, либо контрольные антитела и инкубировали в течение 2-4 ч при 4°С. Комплексы осаждали, вносили в градиентный гель, содержащий 10-20% трицина-ДСН, и подвергали электрофорезу при 100 В. Гель подвергали электроблоттингу на мембране и анализировали с помощью авторадиографии. Как видно из фиг.1Б антитела к ErbB2 7С2, 7F3, 2C4, 7D3, 3Е8, 4D5, 2Н11 и 3Н4 обладают способностью связывать различные эпитопы ECD ErbB2.

На фиг.2А и 2Б представлены данные о воздействии моноклональных антител к ErbB2 2C4 и 7F3 на активацию rHRGβ1 клеток линии MCF7. На фиг.2А приведены графики зависимости реакции от дозы для ингибирования с помощью 2C4 и 7F3 стимулированного HRG фосфорилирования тирозина. На фиг.2Б приведены графики зависимости реакции от дозы для ингибирования с помощью 2C4 и 7F3 связывания ¹²⁵I-rHRGβ1_177-244 с клетками линии MCF7.

На фиг.3 представлены данные о ингибировании специфического связывания ¹²⁵I-rHRGβ1_177-244 с панелью линий человеческих клеток опухолей с помощью моноклональных антител к ErbB2 2C4 или 7F3. Моноклональные антитела, применяемые в качестве контроля, представляют собой изотипические меченые мышиные антитела, которые не блокируют связывание rHRG. Неспецифическое связывание ¹²⁵I-rHRGβ1_177-244 определяли из параллельных опытов, в которых инкубации осуществляли в присутствии 100 нМ rHRGβ1. Для всех изученных линий клеток неспецифическое связывание ¹²⁵I-rHRGβ1_177-244 составляло менее 1% от общего связывания.

На фиг.4А и 4Б представлены данные о воздействии моноклональных антител 2C4 и 4D5 на пролиферацию клеток линии MDA-MB-175 (фиг.4А) и SK-BR-3 (фиг.4Б). Клетки MDA-MB-175 и SK-BR-3 высевали в 96-луночные планшеты и давали им прилипнуть в течение 2 ч. Эксперимент осуществляли в среде, содержащей 1% сыворотки. Добавляли антитела к ErbB2 или только среду и клетки инкубировали в течение 2 ч при 37°С. Затем добавляли rHRGβl (1 нМ) или только среду и клетки инкубировали в течение 4 дней. Монослои промывали и окрашивали/фиксировали с помощью 0,5%-ного кристаллического фиолетового. Для оценки пролиферации клеток измеряли абсорбцию при 540 нм.

На фиг.5А и 5Б представлены данные о воздействии моноклонального антитела 2C4, антитела HERCEPTIN® или антитела к EGFR на зависящее от херегулина (HRG) связывание ErbB2 с ErbB3 в клетках линии MCF7, экспрессирующих низкие/нормальные уровни ErbB2 (фиг.5А), и в клетках линии SK-BR-3, экспрессирующих высокие уровни ErbB2 (фиг.5Б); см. пример 2 ниже.

На фиг.6А и 6Б приведено сравнение активностей интактного мышиного моноклонального антитела 2С4 (mu 2С4) и химерного Fab-фрагмента 2С4. На фиг.6А представлено ингибирование связывания ¹²⁵I-HRG с клетками линии MCF7 с помощью химерного Fab-фрагмента 2С4 или интактного мышиного моноклонального антитела 2С4. Клетки линии MCF7 высевали в 24-луночные планшеты (1·10⁵ клеток/лунку) и выращивали до примерно 85%-ной конфлюэнции в течение 2 дней. Эксперименты по связыванию осуществляли согласно методу, описанному у Lewis и др. Cancer Research, 56: 1457-1465 (1996). На фиг.6Б представлены данные об ингибировании активации с помощью rHRGβ1 фосфорилирования тирозина р180 в клеткх линии MCF7, что осуществляли согласно методу, описанному у Lewis и др., Cancer Research, 56: 1457-1465 (1996).

На фиг.7А и 7Б представлен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей вариабельных областей легких (V_L) (фиг.7А) и вариабельных областей тяжелых (V_H) (фиг.7Б) цепей мышиного моноклонального антитела 2С4 (SEQ ID NO:1 и 2 соответственно); V_L- и V_H-областей гуманизированной версии 574 2С4 (SEQ ID NO:3 и 4 соответственно); и человеческих консенсусных каркасных участков (hum k1, т.е. подгруппа I легкой каппа-цепи; humIII, т.е. подгруппы III тяжелой цепи) (SEQ ID NO:5 и 6 соответственно). Звездочками обозначены различия между каркасными участками гуманизированной версии 574 2С4 и мышиным моноклональным антителом 2С4 или между гуманизированной версией 574 2С4 и человеческим каркасным участком. Гиперварибельные участки (CDR) заключены в скобки.

На фиг.8А-8В представлены данные о связывании химерного Fab-фрагмента 2С4 (Fab v1) и нескольких гуманизированных вариантов антитела 2С4 к внеклеточному домену (ECD) ErbB2, которое определяли с помощью метода ELISA, описанного в примере 3.

На фиг.9 приведена ленточная диаграмма V_L- и V_H-областей моноклонального антитела 2С4, где белым цветом обозначены каркасные области CDR (L1, L2, L3, H1, Н2, Н3). Также обозначены боковые цепи V_H-области, которые выявляли с помощью мутагенеза в процессе гуманизации (см. пример 3, таблица 2).

На фиг.10 представлены данные о воздействии моноклонального антитела 2С4 или HERCEPTIN® на опосредуемую EGF, TGF-α или HRG активацию активируемой митогеном протеинкиназы (МАРК).

На фиг.11 представлена столбчатая диаграмма, на которой показано воздействие антител к ErbB2 (по отдельности или в комбинации) на ксенотрасплантаты (трехкратный уровень (3+) сверхэкспрессии ErbB2) аденокарциномы легкого линии Саlu3. Примечание: обработку прекращали на 24-й день.

На фиг.12 представлены данные о воздействии рекомбинантного гуманизированного моноклонального антитела 2С4 (rhuMAb 2C4) или HERCEPTIN® на рост клеток линии MDA-175 при оценке анализом с использованием Alamar Blue (аламарового синего).

На фиг.13 представлены данные об эффективности rhuMAb 2C4 в отношении ксенотрансплантатов MCF7.

Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления

I. Определения

Понятие "рецептор ErbB" обозначает рецептор протеина тирозинкиназы, который принадлежит к семейству ErbB-рецепторов и включает рецепторы EGFR, ErbB2, ErbB3 и ErbB4, в будущем следует ожидать обнаружение других представителей этого семейства. Рецептор ErbB, как правило, включает внеклеточный домен, который может связывать лиганд ErbB; липофильный трансмембранный домен; консервативный внутриклеточный тирозинкиназный домен; С-концевой сигнальный домен, несущий несколько остатков тирозина, которые могут быть фосфорилированы. Рецептор ErbB может иметь "нативную последовательность" рецептора ErbB или "вариант его аминокислотной последовательности". Предпочтительно рецептор ErbB имеет нативную последовательность человеческого рецептора ErbB.

Понятия "ErbB1", "рецептор эпидермального фактора роста" и "EGFR" в контексте настоящего описания используются взаимозаменяемо и обозначают EGFR, например, у Carpenter и др., Ann. Rev. Biochem., 56: 881-914 (1987), включая его встречающиеся в естественных условиях мутантные формы (например, полученный в результате делеции мутант EGFR, описанный у Humphrey и др., PNAS (USA), 87: 4207-4211 (1990). Понятие "erbB1" обозначает ген, кодирующий протеин EGFR.

Понятия "ErbB2" и "HER2" в контексте настоящего описания используются взаимозаменяемо и обозначают человеческий протеин HER2, описанный, например, у Semba и др., PNAS (USA), 82: 6497-6501 (1985) и у Yamamoto и др., Nature, 319: 230-234 (1986) (регистрационный номер Genebank X03363). Понятие "erbB2" обозначает ген, кодирующий человеческий ErbB2, а "neu" обозначает ген, кодирующий крысиный p185^neu. Предпочтительно ErbB2 имеет нативную последовательность человеческого ErbB2.

Понятия "ErbB3" и "HER3" обозначают рецепторный полипептид, который описан, например, в патентах США 5183884 и 5480968, а также у Kraus и др., PNAS (USA), 86: 9193-9197 (1989).

Понятия "ErbB4" и "HER4" обозначают рецепторный полипептид, который описан, например, в ЕР-А 599274; у Plowman и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 1746-1750 (1993) и у Plowman и др., Nature, 366: 473-475 (1993), включая его изоформы, описанные, например, в WO 99/19488, которая опубликована 22 апреля 1999 г.

Понятие "лиганд ErbB" обозначает полипептид, который связывается с рецептором ErbB и/или активирует его. Представляющий особенный интерес лиганд ErbB представляет собой лиганд, имеющий нативную последовательность человеческого лиганда ErbB, такого как эпидермальный фактор роста (EGF) (Savage и др., J.Biol. Chem., 247: 7612-7621 (1972)); трансформирующий фактор роста альфа (TGF-α) (Marquardt и др., Science, 223: 1079-1082) (1984); амфирегулин, также известный как шваннома или кератиноцитный аутокринный фактор роста (Shoyab и др., Science, 243: 1074-1076 (1989); Kimura и др., Nature, 348: 257-260 (1990); и Cook и др., Mol. Cell. Biol., 11: 2547-2557 (1991); бетацеллулин (Shing и др., Science, 259: 1064-1607 (1990) и Sasada и др., Biochem. Biophys. Res. Commun., 190: 1173 (1993); гепаринсвязывающий эпидермальный фактор роста (HB-EGF) (Higashiyama и др., Science, 251: 936-939 (1991); эпирегулин (Toyoda и др., J. Biol. Chem., 270: 7495-7500 (1995) и Komurasaki и др., Oncogene, 15: 2841-2848 (1997)); херегулин (см. ниже); неурегулин-2 (NRG-2) (Carraway и др., Nature, 387: 512-516 (1997); неурегулин-3 (NRG-3) (Zhang и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 9562-9567 (1997)); неурегулин-4 (NRG-4) (Harari и др., Oncogene, 18: 2681-2689 (1999) или крипто (CR-1) (Kannan и др., J.Biol. Chem., 272(6): 3330-3335 (1997)). Лиганды ErbB, которые связываются с EGFR, включают EGF, TGF-α, амфирегулин, бетацеллулин, HB-EGF и эпирегулин. Лиганды ErbB, которые могут связываться с ErbB3, включают херегулины. Лиганды ErbB, которые могут связываться с ErbB4, включают бетацеллулин, эпирегулин, НВ-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 и херегулины.

Понятие "херегулин" (HRG) в контексте настоящего описания обозначает полипетид, кодируемый херегулиновым генным продуктом, как он описан в патенте США 5641869 или у Marchionni., Nature, 362: 312-318 (1993). Примеры херегулинов включают херегулин-α, херегулин-β1, херегулин-β2 и херегулин-β3 (Holmes и др., Science, 256: 1205-1210 (1992) и патент США 5641869); neu-фактор дифференцировки (NGF) (Peles и др., Cell, 69: 205-216 (1992); индукторы активности ацетилхолинового рецептора (ARIA) (Fals и др., Cell, 72: 801-815 (1993)); глиальные факторы роста (GGF) (Marchionni и др. Nature, 362: 312-318 (1993)); факторы, происходящие из сенсорных и моторных нейронов (SMDF) (Но и др., J.Biol. Chem., 270: 14523-14532 (1995)); γ-херегулин (Schaefer и др., Oncogene, 15: 1385-1394 (1997)). Понятие включает биологически активные фрагменты и/или варианты аминокислотной последовательности нативной последовательности полипептида HRG, такие как фрагмент его EGF-подобного домена (например, HRGβ1_177-244).

Понятие "гетероолигомер ErbB" в контексте настоящего описания обозначает нековалентно связанный олигомер, включающий, по меньшей мере, два различных рецептора ErbB. Такие комплексы могут образовываться, когда клетку, экспрессирующую два или большее количество рецепторов ErbB, обрабатывают лигандом ErbB, и они могут быть выделены путем иммунопреципитации и проанализированы с помощью ДСН-ПААГ согласно методике, например, описанной у Silwkowski и др., J. Biol. Chem., 269 (20): 14661-14665 (1995). Примеры таких гетероолигомеров ErbB включают комплексы EGFR-ErbB2, ErbB2-ErbB3 и ErbB3-ErbB4. Кроме того, гетероолигомер ErbB может включать два или большее количество рецепторов ErbB2, объединенных с другим рецептором ErbB, таким как ErbB3, ErbB4 или EGFR. В гетероолигомер могут быть включены другие протеины, такие как субъединица рецептора цитокина (например, gp130).

Понятие "активация лигандом рецептора ErbB" обозначает трансдукцию сигнала (например, вызываемую фосфорилированием остатков тирозина внутриклеточного киназного домена рецептора ErbB или субстратного полипептида), которая опосредована связыванием лиганда ErbB с гетероолигомером ErbB, включающим представляющий интерес рецептор ErbB. Как правило, это может включать связывание лиганда ErbB с гетероолигомером ErbB, что активирует киназный домен одного или нескольких рецепторов ErbB в гетероолигомере и тем самым приводит к фосфорилированию остатков тирозина в одном или нескольких рецепторах ErbB и/или к фосфорилированию остатков тирозина в дополнительном(ых) субстратном(ых) полипептиде(ах). Активация рецептора ErbB может быть количественно оценена с помощью различных методов анализа фосфорилирования тирозина.

Понятие полипептид, имеющий "нативную последовательность", бозначает полипептид, который характеризуется такой же аминокислотной последовательностью, что и полипептид (например, рецептор ErbB или лиганд ErbB), имеющий естественное происхождение. Такие полипептиды, имеющие нативные последовательности, могут иметь естественное происхождение или быть получены рекомбинантным или синтетическим путями. Так, полипептид с нативной последовательностью может иметь аминокислотную последовательность встречающегося в естественных условиях человеческого полипептида, мышиного полипептида или полипептида, выделенного из любых других видов млекопитающих.

Понятие "вариант аминокислотной последовательности" относится к полипептидам аминокислотные последовательности, которых отличаются в определенной степени от нативной последовательности полипептида. Как правило, варианты аминокислотной последовательности должны быть, по меньшей мере, примерно на 70% гомологичны, по меньшей мере, с одним связывающимся с рецептором доменом нативного лиганда ErbB или, по меньшей мере, с одним связывающимся с лигандом доменом нативного рецептора ErbB, и предпочтительно они должны быть, по меньшей мере, примерно на 80%, более предпочтительно они должны быть, по меньшей мере, примерно на 90% гомологичны таким связывающимся с рецептором или лигандом доменам. Варианты аминокислотной последовательности несут замены, делеции и/или инсерции в определенных положениях в аминокислотной последовательности нативной аминокислотной последовательности.

"Гомологию" выражают в виде процента остатков в варианте аминокислотной последовательности, которые оказались идентичными после сравнительного анализа последовательностей и введения при необходимости брешей для достижения максимального процента гомологии. Методы и компьютерные программы для сравнительного анализа последовательностей хорошо известны в данной области. Одна из таких компьютерных программ представляет собой "Align 2", разработанную на фирме Genetech Inc., которая передана вместе с документацией для пользователя в United States Copyright Office, Washington, DC 20559, 10 декабря 1991 г.

Понятие "антитело" в контексте настоящего описания используется в наиболее широком смысле и, в частности, относится к интактным моноклональным антителам, поликлональным антителам, мультиспецифическим антителам (например, биспецифическим антителам), образованным по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагментам антител, в том случае, если они обладают требуемой биологической активностью.

Понятие "моноклональное антитело" в контексте настоящего описания обозначает антитело, полученное из популяции практически гомогенных антител, т.е. входящие в популяцию индивидуальные антитела идентичны за исключением возможных встречающихся в естественных условиях мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими и представляют собой антитела к отдельному сайту антигена. Кроме того, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело направлено к одной детерминанте антигена. Помимо их специфичности преимуществом моноклональных антител является то, что они могут быть синтезированы без загрязнения другими антителами. Прилагательное "моноклональное" свидетельствует о том, что антитело получено из практически гомогенной популяции антител, при этом не предполагается, что оно должно быть получено с помощью какого-либо конкретного метода. Например, моноклональные антитела, которые могут применяться согласно изобретению, могут быть получены с помощью метода на основе гибридом, впервые описанного Kohler и др., Nature, 256: 495 (1975), или могут быть сконструированы методами рекомбинатной ДНК (см., патент США 4816567). "Моноклональные антитела" могут быть выделены также из фаговых библиотек антител с помощью методик, описанных, например, у Clackson и др., Nature, 352: 624-628 (1991) и у Marks и др., J.Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

Моноклональные антитела в контексте настоящего описания включают, в частности, "химерные" антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученным из конкретных видов, или принадлежит к конкретным классам или подклассам антител, а остальной участок цепи(ей) идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям антител, полученным из других видов, или принадлежит к другим классам или подклассам антител, включая фрагменты таких антител, в случае, если они обладают требуемой биологической активностью (патент США 4816567; и Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Представляющие интерес в контексте настоящего описания химерные антитела включают "приматизированные" антитела, которые содержат антигенсвязывающие последовательности вариабельных областей, полученные из приматов, не включая людей (например, низших узконосых обезьян, обезьян и т.д.), и последовательности человеческих константных областей.

"Фрагмент антитела" включает часть интактного антитела, предпочтительно включает его антигенсвязывающую или вариабельную области. Примеры фрагментов антитела включают Fab-, Fab-', F(ab')₂- и Fv-фрагменты; двойные антитела, линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител; и мультиспецифические антитела, полученные из фрагмента(ов) антител.

"Интактное антитело" представляет собой антитело, которое содержит вариабельную антигенсвязывающую область, а также константную область легкой цепи (С_L) и константные области тяжелой цепи С_н ¹, С_н ² и С_н ³. Константные области могут представлять собой константные области, имеющие нативные последовательности (например, человеческие константные области, имеющие нативные последовательности), или варианты их аминокислотных последовательностей. Предпочтительно интактное антитело обладает одной или несколькими эффекторными функциями.

Понятие "эффекторные функции" антитела относится к биологическим активностям, связанным с Fc-областью (нативной последовательностью Fc-области или с вариантом аминокислотной последовательности Fc-области) антитела. Примерами эффекторных функций антитела являются С1_q-связывание; зависящая от комплемента цитотоксичность; связывание Fc-рецептора; опосредуемая антителами клеточная цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора, BCR) и т.д.

В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей интактные антитела могут быть разделены на различные "классы". Известно 5 основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, при этом некоторые из них могут быть подразделены на "подклассы" (изотипы): например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам антител, обозначают α, δ, ε, γ и μ соответственно. Строение субъединиц и трехмерная конфигурация различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Понятия "опсредуемая антителом клеточная цитотоксичность" и "ADCC" обозначают опосредуемую клеткой реакцию, при которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc-рецепторы (FcR) (например, естественные киллеры (NK-клетки), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени и далее вызывают лизис клетки-мишени. Основные клетки, для которых характерна ADCC, т.е. NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Данные о экспрессии FcR на поверхности гематопоэтических клеток обобщены в таблице 3 на стр. 464 статьи Ravetch и Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9: 457-492 (1991). Для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы может применяться ADCC-анализ in vitro, например, описанный в патентах США 5500362 или 5821337. Эффекторные клетки, которые могут применяться для таких анализов, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные киллеры (NK-клетки). В другом или дополнительном варианте для оценки ADCC-активности представляющей интерес молекулы может применяться анализ in vivo, например, с использованием в качестве моделей животных согласно методу, описанному у Clynes и др., PNAS (USA), 95: 652-656 (1998).

"Человеческие Эффекторные клетки" представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и обладают эффекторными функциями. Предпочтительно клетки экспрессируют, по меньше мере, FcγRIII и обладают ADCC-эффекто