Способ ингибирования активности человеческого tnf (варианты), применение выделенного антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента в качестве компонента для производства лекарственного средства (варианты) и выделенное человеческое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент

Способ ингибирования активности человеческого tnf (варианты), применение выделенного антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента в качестве компонента для производства лекарственного средства (варианты) и выделенное человеческое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицинской фармакологии и касается, в частности, применения антител человека, которые специфически связывают или нейтрализуют hTNFα, при производстве лекарственных препаратов для лечения нарушений, при которых активность TNFα является вредной.

Уровень техники

Фактор некроза опухоли α(TNFα) является цитокином, образуемым множеством типов клеток, включая моноциты и макрофаги, который был исходно идентифицирован на основе своей способности индуцировать некроз некоторых мышиных опухолей (см., например, Old L. (1985) Science 230:630-632). Впоследствии было показано, что фактор, называемый кахектин, ассоциированный с кахексией, является той же молекулой, что TNFα. TNFα участвовал в генерации шока (см., например, Beutler В. and Cerami A. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:505-518; Beutler В. and Cerami A. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7:625-655). Более того, TNFα участвовал в патофизиологии ряда других заболеваний и нарушений человека, включая сепсис, инфекции, аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантата и болезнь трансплантат против хозяина (см..например, MoellerA. et al., (1990) Cytokine 2:162-169; Патент США No 5231024 Moeller et al.; Европейский Патент No 260610 B1 Moeller A. et al.; Vasilli P. (1992) Annu. Rev. Immunol 10:411-452; Tracey K.J. and Cerami A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503).

Вследствие вредной роли человеческого TNFα (hTNFα) в ряде нарушений у человека были разработаны терапевтические способы ингибирования или противодействия активности hTNFα. В частности, антитела, которые связывают или нейтрализуют hTNFα, рассматривались как средства ингибирования активности hTNFα. Одними из самых ранних таких антител были мышиные моноклональные антитела (mAbs), секретируемые гибридомами, полученными из лимфоцитов мышей, иммунизированных hTNFα (см., например, Hahn Т. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3814-3818; Liang C-M. et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 137: 847-854; Hirai M. et al.(1987) J. Immunol. Methods 96: 57-62; Fendly B.M. et al.(1987) Hybridoma 6:359-370; Moeller A. et al. (1990) Cytokine 2:162-169; Патент США No 5231024 Moeller et al.; Европейский Патент No 186833 B1 Wallach D.; Европейская Патентная Заявка No 218868 А1 Old et al.; Европейский Патент No 260610 B1 Moeller A. et al.). Поскольку эти мышиные антитела против hTNFα часто проявляли высокую аффинность к hTNFα (например, K_d≤10^-9 M) и были способны нейтрализовать активность hTNFα, их применение in vivo могло ограничиваться проблемами, связанными с введением мышиных антител человеку, такими как короткий период полужизни в сывортке, неспособность включать определенные функции эффекторов человека и появление нежелательного иммунного ответа против мышиных антител у человека (реакция "человеческих антител против мыши" (НАМА)).

При попытке преодолеть проблемы, связанные с использованием полностью мышиных антител у человека, мышиные антитела против hTNFα были с помощью генетической инженерии сделаны "человекоподобными". Например, были получены химерные антитела, в которых вариабельные участки цепей антител имеют мышиную природу, а константные участки цепей антител - человеческую (Knight D.M. et al. (1993) Mol. Immunol. 30:1443-1453; Публикация РСТ No WO 92/16553 Daddona P.E. et al.). Кроме того, были также получены человекоподобные антитела, в которых гипервариабельные домены вариабельных участков антитела имеют мышиную природу, но остальные вариабельные участки и константные участки антител имеют человеческую природу (Публикация РСТ No WO 92/11383 Adair J.R. et al.). Однако поскольку эти химерные и гуманизированные антитела еще сохраняют некоторые мышиные последовательности, они еще могут вызвать нежелательную иммунную реакцию, реакцию человеческих антихимерных антител (НАСА), особенно при введении в течение длительных периодов, например при хронических показаниях, таких как ревматоидный артрит (см,, например, Elliott M.J. et al. (1994) Lancet 344:1125-1127; Elliott M.J. et al. (1994) Lancet 344: 1105-1110).

Предпочтительным ингибирующим hTNFα агентом по отношению к мышиным mAbs и их производным (например, химерным или человекоподобным антителам) было бы полностью человеческое антитело против hTNFα, поскольку такой агент не вызывал бы реакции НАМА, даже если бы применялся в течение длительных периодов. Человеческие моноклональные аутоантитела против hTNFα были получены способами с использованием человеческой гибридомы (Boyle P. Et al. (1993) Cell. Immunol. 152:556-568; Boyle P. et al. (1993) Cell. Immunol. 152:569-581; Европейская Патентная Заявка No 614984 А2 Boyle et al.). Однако, как сообщалось, эти моноклональные аутоантитела гибридомной природы обладали настолько низкой аффинностью в отношении hTNFα, что ее трудно было подсчитать известными способами, не были способны к связыванию растворимого hTNFα и не были способны нейтрализовать hhTNFα-индуцированную цитотоксичность (см. Boyle et al., supra). Более того, успех способа с использованием человеческой гибридомы зависит от естественного присутствия в периферической крови человека лимфоцитов, продуцирующих аутоантитела, специфичные для hTNFα. В ряде исследований у человека обнаружены сывороточные аутоантитела против hTNFα (Fomsgaard A. et al. (1989) Scand. J. Immunol. 30: 219-223; Bendtzen К. et al. (1990) Prog. Leukocyte Biol. 10B: 447-452), тогда как в других исследованиях они не были обнаружены (Leusch H-G. et al. (1991) J.Immunol. Methods 139: 145-147).

Альтернативой существующим в естественных условиях человеческим антителам против hTNFα были бы рекомбинантные антитела против hhTNFα. Описаны рекомбинантные человеческие антитела, которые связывают hTNFα с относительно низкой аффинностью (т.е. К_d ˜ 10^-7 М) и быстрой скоростью диссоциации (т.е. К_off ˜ 10^-2 с^-1). Однако ввиду относительно быстрой кинетики диссоциации эти антитела не могут быть применены для терапевтических нужд. Кроме того, были описаны рекомбинантные человеческие антитела против hTNFα, которые не нейтрализуют активность DTNFα, но значительно усиливают связывание hTNFα с поверхностью клеток и усиливают внедрение в цитоплазму hTNFα (Lidbury A. et al. (1994) Biotechnol. Ther. 5:27-45; Публикация РСТ No WO 92/03145 Aston R. et al.).

Соответственно человеческие антитела, такие как рекомбинантные человеческие антитела, которые связывают растворимый hTNFα с высокой аффинностью и низкой кинетикой диссоциации и которые способны нейтрализовать активность hTNFα, включая hTNFα-индуцированную цитотоксичность (in vitro и in vivo) и hTNFα-индуцированную активацию клеток, все еще являются необходимыми.

Сущность изобретения

Изобретение относится к применению человеческих антител, в частности, рекомбинантных человеческих антител, которые специфически связывают человеческий TNFα. Антитела, соответствующие изобретению, характеризуются связыванием hTNFα с высокой аффинностью и медленной кинетикой диссоциации, а также нейтрализацией активности hTNFα, включая hTNFα-индуцированную цитотоксичность (in vitro и in vivo) и hTNFα-индуцированную активацию клеток. Антитела, соответствующие изобретению, далее характеризуются связыванием hTNFα, но не hTNFα (лимфотоксина) и наличием способности связывать кроме человеческого TNFα также факторы некроза опухоли (TNFα) других приматов и TNFα неприматов.

Антитела, соответствующие изобретению, могут быть полной длины (например, антитело lgG1 или lgG4) или могут содержать только антиген-связывающий фрагмент (например, фрагмент Fab, F(ab')₂ или scFv). Наиболее предпочтительное рекомбинантное антитело, соответствующее изобретению, обозначаемое D2E7, имеет домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 3 и домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 4. Предпочтительно антитело D2E7 имеет вариабельный участок легкой цепи (LCVR), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 1 и вариабельный участок тяжелой цепи (HCVR), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 2.

В изобретении предлагаются способ ингибирования активности человеческого TNFα, в котором осуществляют контактирование человеческого TNFα с выделенным антителом человека или его антиген-связывающим фрагментом и при этом ингибируют активность человеческого TNFα, а также применение выделенного антитела человека или его антиген-связывающего фрагмента в качестве компонента для производства средства (лекарственного препарата) для лечения нарушений, при которых активность TNFα является вредной, посредством введения антитела субъекту. В одном из вариантов осуществления изобретения упомянутое выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмента диссоциирует из человеческого TNFα с К_d равной 1×10^-8 М или менее и c константой скорости К_off 1×10^-3 с^-1 или менее (оба значения определены с помощью поверхностного плазменного резонанса) и нейтрализуют цитотоксичность человеческого hTNFα в стандартном анализе с использованием L929 in vitro с IC₅₀ равной 1×10^-7 М или меньше. Более предпочтительно, если выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент диссоциируют из ассоциации (комплекса) с человеческим TNFα с К_off равной 5×10^-4 с^-1 или менее и даже более предпочтительно с К_off 1×10^-4 с^-1 или менее. Более предпочтительно, если выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент нейтрализуют цитотоксичность человеческого TNFα в стандартном анализе с использованием L929 in vitro с IC₅₀ 1×10^-8 М или менее и еще более предпочтительно с IC₅₀ 5×10^-10 М или менее.

В другом варианте осуществления изобретения используется человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент со следующими характеристиками:

a) диссоциирует из hTNFα с К_off 1×10^-3 с^-1 или менее, что определено с помощью поверхностного плазменного резонанса;

b) имеет по меньшей мере домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 3 или SEQ ID No 3, модифицированную посредством замены одним аланином в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или заменой от одной до пяти консервативных аминокислот в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9;

c) имеет по меньшей мере домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID No 4 или SEQ ID No 4, модифицированную посредством замены одним аланином в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или заменой от одной до пяти консервативных аминокислот в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

Более предпочтительно, если антитело или его антиген-связывающий фрагмент диссоциируют из человеческого TNFα с К_off 5×10^-4 с^-1 или менее. Еще более предпочтительно, если антитело или его антиген-связывающий фрагмент диссоциируют из человеческого TNFα с К_off 1×10^-4 с^-1 или менее.

В еще одном варианте осуществления изобретения используется выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент с LCVR, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID No 1, и с HCVR, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID No 2. В некоторых вариантах осуществления антитело может иметь константный участок тяжелой цепи lgG1 или константный участок тяжелой цепи lgG4. В других вариантах осуществления антитело является фрагментом Fab, фрагментом F(ab')₂ или фрагментом Fv одной цепи.

В следующем варианте осуществления изобретение в качестве компонента для производства упомянутого средства для лечения нарушений предлагается применение антитела D2E7.

В других вариантах осуществления изобретение представляет антитела или его антиген-связывающие фрагменты с LCVR, имеющим домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No3, SEQ ID No 11, SEQ ID No 12, SEQ ID No 13, SEQ ID No 14, SEQ ID No 15, SEQ ID No 16, SEQ ID No 17, SEQ ID No 18, SEQ ID No 19, SEQ ID No 20, SEQ ID No 21, SEQ ID No 22, SEQ ID No 23, SEQ ID No 24, SEQ ID No 25, SEQ ID No 26, или с HCVR, имеющим домен CDR3, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No 4, SEQ ID No 27, SEQ ID No 28, SEQ ID No 29, SEQ ID No 30, SEQ ID No 31, SEQ ID No 32, SEQ ID No 33, SEQ ID No 34 и SEQ ID No 35.

В еще одном варианте осуществления изобретение представляет выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые нейтрализуют активность человеческого TNFα, но не человеческого TNFα (лимфотоксина). В предпочтительном варианте осуществления человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент нейтрализуют активность человеческого TNFα, TNFα шимпанзе и TNFα по меньшей мере еще одного примата, выбранного из группы, состоящей из hTNFα павиана, TNFα игрунки, hTNFα циномолгуса и TNFα резуса. Предпочтительно, если антитело также нейтрализует активность TNFα по меньшей мере одного непримата. Например, в одном варианте осуществления выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент нейтрализуют также активность собачьего TNFα. А в другом варианте выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент нейтрализуют также активность свиного TNFα. В еще одном варианте осуществления выделенное человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент нейтрализуют также активность мышиного TNFα.

Другой аспект изобретения относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих соответствующие изобретению антитела или их антиген-связывающие фрагменты. Предпочтительная нуклеиновая кислота, соответствующая изобретению, кодирующая LCVR D2E7, имеет нуклеотидную последовательность, представленную на Фигуре 7, и SEQ ID No 36. Другая предпочтительная нуклеиновая кислота, соответствующая изобретению, кодирующая HCVR D2E7, имеет нуклеотидную последовательность, представленную на Фигуре 8, и SEQ ID No 37. Рекомбинантные экспрессирующие векторы, несущие кодирующие антитела нуклеиновые кислоты, соответствующие изобретению, и клетки-хозяева, в которые интродуцированы такие векторы, также охватываются изобретением, как и способы получения антител, соответствующих изобретению, посредством культивирования клеток-хозяев, соответствующих изобретению.

Еще один аспект изобретения относится к способам ингибирования активности человеческого TNFα с использованием антитела или его антиген-связывающегофрагмента, соответствующего изобретению. В одном варианте осуществления способ предусматривает контактирование человеческого ТМРα с антителом, соответствующим изобретению, или его антиген-связывающим фрагментом, при этом ингибируется активность человеческого TNFα. В другом варианте осуществления способ предусматривает введение антитела, соответствующего изобретению, или его антиген-связывающего фрагмента человеку, страдающему от нарушения, при котором активность TNFα является вредной, при этом у человека ингибируется активность TNFα. Нарушением может быть, например, сепсис, аутоиммунное заболевание (например, ревматоидный артрит, аллергия, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет, аутоиммунный увеит и почечный синдром), инфекционное заболевание, злокачественное новообразование, отторжение трансплантата или болезнь трансплантат против хозяина, легочное нарушение, костное нарушение, кишечное нарушение или сердечное нарушение.

Упомянутые выделенные антитела человека или его антиген-связывающего фрагмента согласно изобретению могут применяться для производства средств для лечения, в частности, следующих нарушений: аутоиммунные заболевания, инфекционные болезни, болезни, связанные с отторжением трансплантата (болезни трансплантат против хозяина), нарушения, связанные со злокачественным образованием, легочные нарушения, кишечные нарушения, сердечные нарушения, сепсис, ревматоидный артрит, ревматоидный спондилит, остеоартрит, подагрический артрит, аллергия, рассеянный склероз, аутоиммунный диабет, аутоиммунный увеит, почечный синдром, воспалительные костные заболевания, заболевания, связанные с резорбцией кости, алкогольный гепатит, вирусный гепатит, нарушения свертывания крови, ожоги, реперфузионные повреждения, нарушения, связанные с образованием келоида, нарушения, связанные с формированием рубцовой ткани, гипертермия, септический шок, эндотоксический шок, сепсис, вызываемый грамотрицательными бактериями, токсический шоковый синдром, малярия, менингит, кахексия, СПИД, бактериальный менингит, СПИД-ассоциированный комплекс (ARC), вторичная инфекция цитомегаловируса при трансплантации, нарушения, связанные с лихорадкой и миалгией, обусловленные инфекцией, и вторичная кахексии при инфекции, нарушения, связанные с отторжением аллотрансплантата, нарушения, связанные со стимуляцией роста опухоли, нарушения, связанные с усилением метастатического потенциала и появлением цитотоксичности при злокачественных образованиях, нарушения, связанные с ингибированием роста опухоли или метастазов, нарушения, связанные с респираторным дистресс-синдромом взрослых, легочный шок, хронические легочные воспалительные заболевания, легочный саркоидоз, легочный фиброз, силикоз, воспалительные кишечные нарушения, идиопатические воспалительные заболевания кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, ишемия сердца, сердечная недостаточность, гепатит.

Упомянутые выделенные антитела человека или его антиген-связывающего фрагмента согласно изобретению могут также применяться для введения антитела человеку вместе с цитокином интерлейкином-6 (IL-6) или введения человеку, у которого концентрация IL-6 в сыворотке или плазме превышает 500 пг/мл, а также для производства средства, в котором выделенное антитело используется в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, или для производства средства для введения выделенного антитела с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом.

В предпочтительном варианте осуществления изобретение в качестве упомянутого субъекта выступает человек и применение упомянутых выделенных антител человека или его антиген-связывающего фрагмента согласно изобретению предназначается для производства лекарственного препарата для лечения нарушений, при которых активность TNFα является вредной, посредством введения антитела человеку для ингибирования активности человеческого TNFα.

Перечень фигур чертежей

На Фигурах 1 и 2 представлены последовательности нуклеиновых кислот вариабельного участка легкой цепи D2E7 (D2E7 VL; показано также в SEQ ID No 1), аланин-сканмутанты D2E7VL (LD2E7^*.A1, LD2E7^*.A3, LD2E7^*.A4, LD2E7^*.A5, LD2E7^*.A7 и LD2E7^*.A8), вариабельный участок легкой цепи подобного D2E7 антитела 2SD4 (2SD4 VL; показано также в SEQ ID No 9) и другие вариабельные участки легкой цепи, подобные D2E7 (ЕР В12, VL10E4, VL100А9, VL100D2. VL10F4, LOE5, VLLOF9, VLLOF10, VLLOG7, VLLOG9, VLLOH1, VLLOH10, VL1B7, VL1С1, VL1C7, VL0.1F4.VL0.1H8, LOE7, LOE7.A и LOE7.T). На Фигуре 1А представлены домены FR1, CDR1, FR2 и CDR2. На Фигуре 1В представлены домены FR3, CDR3 и FR4. Домены легкой цепи CDR1 ("CDR L1"), CDR2 ("CDR L2") и CDR3 ("CDR L3") находятся в прямоугольнике.

На Фигурах 3 и 4 представлены аминокислотные последовательности вариабельного участка D2E7 (D2E7 VH; показано также в SEQ ID No 2), аланин-сканмутанты D2E7VH (HD2E7^*.A1, HD2E7^*.A2, HD2E7^*.A3, HD2E7^*.A4, HD2E7^*.A5, HD2E7^*.A6, HD2E7^*.A7, HD2E7^*.A8 и HD2E7^*.A9), вариабельный участок тяжелой цепи, подобного D2E7 антитела 2SD4 (2SD4 VH, показано также в SEQ ID No 10) и другие вариабельные участки тяжелой цепи, подобные D2E7 (VH1B11, VH1D8, VH1A11, VH1B12, VH1-D2, VH1E4, VH1F6, VH1G1, 3С-Н2, VH1-D2.N и VH1-D2.Y). На Фигуре 2А представлены домены FR1, CDR1, FR2 и CDR2. На Фигуре 2В представлены домены FR3, CDR3 и FR4. Домены тяжелой цепи CDR1 ("CDR H1"), CDR2 ("CDR H2") и CDR3 ("CDR Н3") находятся в прямоугольнике.

На Фигуре 5 графически представлено ингибирование TNFα-индуцированной цитотоксичности L929 человеческим антителом D2E7 против hTNFα по сравнению с мышиным антителом МАК 195 против hTNFα.

На Фигуре 6 графически представлено ингибирование связывания rhTNFα с рецепторами hTNFα на клетках U-937 с помощью человеческого антитела D2E7 против hTNFα по сравнению с мышиным антителом МАК 195 против hTNFα.

На Фигуре 7 графически представлено ингибирование индуцированной TNFα экспрессии ELAM-1 на HUVEC с помощью человеческого антитела D2E7 против hTNFα по сравнению с мышиным антителом МАК 195 против hTNFα.

На Фигуре 8 представлен график в виде столбиков защиты от TNFα-индуцированной гибели сенсибилизированных D-галактозамином мышей посредством введения человеческого антитела против hTNFα D2E7 (черные столбики) по сравнению с мышиным антителом МАК 195 против hTNFα (заштрихованные столбики).

На Фигуре 9 представлена нуклеотидная последовательность вариабельного участка легкой цепи D2E7c прогнозированной аминокислотной последовательностью, находящейся ниже нуклеотидной последовательности. Участки CDR L1, CDR L2 и CDR L3 подчеркнуты.

На Фигуре 10 представлена нуклеотидная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи D2E7 с прогнозированной аминокислотной последовательностью, находящейся ниже нуклеотидной последовательности. Участки CDR H1, CDR H2 и CDR H3 подчеркнуты.

На Фигуре 10 приведен график, представляющий эффект лечения антителами D2E7 трансгенных мышей Тg197 со средним размером суставов в качестве модели полиартрита.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Данное изобретение относится к выделенным человеческим антителам или их антиген-связывающим фрагментам, которые связывают TNFα с высокой аффинностью, низкой скоростью диссоциации и высокой нейтрализующей активностью, и применению этих антител для ингибирования активности человеческого TNFα и в качестве компонентов лекарственных средств для лечения различных нарушений, при которых активность TNFα является вредной. В частности в изобретении предлагаются способы применения антител, соответствующих изобретению, для детекции человеческого TNFα или для ингибирования активности человеческого TNFα либо in vitro, либо in vivo.

С целью более легкого понимания изобретения сначала определяются некоторые термины.

Термин "человеческий TNFα" (сокращаемый здесь как hTNFα или просто hTNF), используемый здесь, предназначен для определения человеческого цитокина, который существует в виде секретируемой формы с молекулярной массой 17 кД и ассоциированной с мембаной формы с молекулярной массой 26 кД, биологически активная форма которого содержит тример нековалентно связанных молекул с массой 17 кД. Структура hTNFα описана далее в, например, Pennica D. et al., (1984) Nature 312:724-729; Davis J.M. et al. (1987) Biochemistry 26:1322-1326; Jones E.Y. et al,(1989) Nature 338:225-228. Термин человеческий TNFα предполагает включение рекомбинантного человеческого TNFα (rhTNFα), который может быть получен стандартными способами рекомбинантной экспрессии или закуплен (R & D Systems, Catalog No. 210-TA, Minneapolis, MN).

Термин "антитело", используемый здесь, предназначен для определения молекул иммуноглобулина, состоящего из четырех полипептидных цепей (две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи), связанных дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный участок тяжелой цепи (сокращенный здесь как HCVR или VH) и константный участок тяжелой цепи. Костантный участок тяжелой цепи содержит три домена СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь содержит вариабельный участок легкой цепи (сокращенный здесь как LCVR или VL) и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи содержит один домен CL Участки VH и VL могут далее подразделяться на участки гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность участками (CDR), окруженные участками, которые являются более консервативными, называемыми скелетными участками (FR). Каждая из VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR участков, расположенных от амино- до карбоксильного конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Термин "антиген-связывающий фрагмент" антитела (или просто "фрагмент антитела"), используемый здесь, относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связывать антиген (например, hTNFα). Показано, что антиген-связывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами антитела полной длины. Примеры связывающих фрагментов, охватываемые термином "антиген-связывающий фрагмент" антитела, включают (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CHl; (ii) фрагмент Р(ab')₂, бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком в районе петли; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH, и (vi) выделенный участок (CDR), определяющий комплементарность. Более того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть рекомбинантными способами связаны с помощью синтетического линкера, который обеспечивает их получение в виде одной белковой цепи, в которой участки VL и VH спарены с образованием моновалентных молекул (известных как Fv одной цепи (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al.,(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Предполагается, что такие антитела из одной цепи также охватываются термином "антиген-связывающий фрагмент" антитела. К ним относятся также другие формы антител из одной цепи, такие как диатела. Диатела являются бивалентными, биспецифическими антителами, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволять спаривание двух доменов на одной и той же цепи, что заставляет домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антиген-связывающих сайта (см., например, Holliger Р. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak R.J. et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Далее, антитело или его антиген-связывающий фрагмент могут быть частью более крупных молекул иммуноадгезии, образованных ковалентной или нековалентной связью антитела или фрагмента антитела с одним или более белком или пептидом. Примеры таких молекул иммуноадгезии включают использование участка ядра стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov S.M. et al (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки для получения бивалентных и уменьшенных биомолекул scFv (Kipriyanov S.M. et al (1994) Mol. Immunol., 31:1047-1058). Фрагменты антител, такие как Fab F(ab')₂, могут быть получены из целых антител с использованием принятых способов, таких как разложение папаином или пепсином соответственно целых антител. Более того, антитела, фрагменты антител и молекулы иммуноадгезии могут быть получены с использованием стандартных способов с применением рекомбинантной ДНК, как описано здесь.

Термин "человеческое антитело", используемый здесь, включает антитела, имеющие вариабельные и константные участки, выделенные из последовательностей зародышевого иммуноглобулина человека. Человеческие антитела, соответствующие изобретению, могут включать остатки аминокислот, не кодируемые последовательностями зародышевого иммуноглобулина человека (например, мутации, интродуцированные ненаправленным или сайт-специфическим мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo), например, в CDR и особенно в CDR3. Однако термин "человеческое антитело", используемый здесь, не включает антитела, в которых последовательности CDR, выделенные из эмбрионов других видов млекопитающих, таких как мышь, были пересажены на человеческие скелетные последовательности.

Термин "рекомбинантное человеческое антитело", используемый здесь, включает все человеческие антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными средствами, такие как антитела, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессирующего вектора, введенного в клетку-хозяин (описано далее в Разделе II ниже), антитела, выделенные из набора известных рекомбинантных комбинаторных человеческих антител (описано далее в Разделе III ниже), антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным в отношении генов человеческого иммуноглобулина (см., например, Taylor L.D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими средствами, которые включают сплайсинг последовательности гена человеческого иммуноглобулина до других последовательностей ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные участки, выделенные из последовательностей человеческого зародышевого иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления, однако, такие рекомбинантные человеческие антитела подвергают мутагенезу in vitro (или, если используют животное, трансгенное по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности участков VH и VL рекомбинантных антител являются последовательностями, которые, поскольку они выделены из последовательностей зародышевых VH и VL человека и близки к ним, не могут в естественных условиях существовать в зародышевом наборе антител человека in vivo.

"Выделенное антитело", как используют здесь, предназначено для определения антитела, которое практически не содержит других антител, имеющих различные антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывает hTNFα, практически не содержит антител, которые специфически связывают антигены, отличные от hTNFα). Выделенное антитело, которое специфически связывает hTNFα, может, однако, иметь перекрестную реактивность с другими антигенами, такими как молекулы TNFα из других видов (детально обсуждается ниже). Более того, выделенное антитело может практически не содержать иной клеточный материал и/или химические соединения.

"Нейтрализующее антитело", как используют здесь, (или "антитело, которое нейтрализовало активность hTNFα) подразумевает антитело, связывание которого с hTNFα приводит к ингибированию биологической активности hTNFα. Это ингибирование биологической активности hTNFα может быть оценено измерением одного или более индикаторов биологической активности hTNFα, таких как hTNFα-индуцированной активации клетки и связывания hTNFα с рецепторами hTNFα. Эти индикаторы биологической активности hTNFα могут быть оценены одним или более методом различных стандартных анализов in vitro и in vivo, известных в уровне техники (см. Пример 4). Предпочтительно способность антитела нейтрализовать активность hTNFα оценивается по ингибированию hTNFα-индуцированной цитотоксичности клеток L929. В качестве дополнительного или альтернативного параметра активности hTNFα может быть оценена способность антитела ингибировать hTNFα-индуцированную экспрессию ELAM-1 на HUVEC как степень hTNFα-индуцированной активации клеток.

Термин "поверхностный плазменный резонанс", используемый здесь, относится к оптическому явлению, положенному в основу проведения анализа протекающих в данный момент биоспецифических взаимодействий по детекции изменений концентраций белка в матриксе биосенсора, например, с использованием системы BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). Дальнейшее описание см. в Примере 1 и Jönsson U. et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jönsson U. et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnson B. et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131 и Johnson В. et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

Термин "K_off", используемый здесь, предназначен для определения константы скорости диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.

Термин "К_d", используемый здесь, предназначен для обозначения константы диссоциации определенного взаимодействия антитело-антиген.

Термин "молекула нуклеиновой кислоты", используемый здесь, включает молекулы ДНК и молекулы РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть однонитиевой или двунитевой, но предпочтительно двунитевой ДНК.

Термин "выделенная молекула нуклеиновой кислоты", используемый здесь в отношении нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или фрагменты антител (например, VH, VL, CDR3), которые связывают hTNFα, предназначен для определения молекулы нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или фрагменты антител, не содержат другие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или фрагменты антител, которые связывают антигены, отличные от hTNFα, эти другие последовательности могут в естественных условиях примыкать к нуклеиновой кислоте в геномной ДНК человека. Таким образом, например, выделенная нуклеиновая кислота, соответствующая изобретению, кодирующая участок VH антитела против TNFα, не содержит другие последовательности, кодирующие другие участки VH, которые связывают антигены, отличные от TNFα.

Термин "вектор" в контексте описания обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой он был связан. Одним типом вектора является "плазмида", которая означает кольцевую петлю двунитевой ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в геном вируса. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они интродуцированы (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный ориджин (точку начала) репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина введением в клетку-хозяин и вследствие этого реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, определенные векторы могут направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы называются в контексте заявки "рекомбинантные экспрессирующие векторы" (или просто "экспрессирующие векторы"). В основном экспрессирующие векторы для использования в способах с применением рекомбинантной ДНК часто находятся в форме плазмид. В настоящем описании "плазмида" и "вектор" могут быть использованы взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее часто применяемой формой вектора. Однако изобретение включает другие формы экспрессирующих векторов, такие как вирусные векторы (например, репликационно-дефектные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

Термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") в контексте заявки предназначен для определения клетки, в которую интродуцирован рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует понимать, что такие термины обозначают только определенную данную клетку, но не потомство такой клетки. Поскольку определенные модификации в последующих поколениях могут происходить вследствие мутаций или воздействия окружающей среды, такое потомство может на самом деле не быть идентичными родительской клетке, но также подпадает под определение термина "клетка-хозяин" в контексте заявки.

Различные аспекты изобретения подробно описываются в следующих подразделах.

1. Человеческие антитела, которые связывают TNFα человека

В изобретении представлены выделенные человеческие антитела или их антиген-связывающие фрагменты, которые связывают человеческий TNFα с высокой аффинностью, низкой скоростью диссоциации и высокой нейтрализующей способностью. Предпочтительно человеческие антитела, соответствующие изобретению, являются рекомбинантными нейтрализующими человеческими антителами против hTNFα. Наиболее предпочтительным рекомбинантным нейтрализующим антителом согласно изобретению является D2E7, которое имеет последовательности VL и VH, как показано на Фигурах 1, 2 и Фигурах 3 4, соответственно (аминокислотная последовательность участка VL D1E7 также представлена как SEQ ID No 1; аминокислотная последовательность участка VH D1 Е7 также представлена как SEQ ID No 2). Связывающие свойства D2E7 по сравнению с мышиными mAB МАК 195 против hTNFα, которые обладают высокой аффинностью и низкой кинетикой диссоциации, и другими человеческими антителами против hTNFα 2SD4 с близкой D2E7 последовательностью сведены ниже в таблицу:

Антитело	Koff c-1	kon М-1 сек-1	Кd М	Стехиометрия
D2E7 lgG1	8,81×10-5	1,91×105	6,09×10-10	1,2
2SD4 lgG4	8,4×10-3	4,20×105	2,00×10-8	0,8
МАК 195	8,70×10-5	1,90×105	4,60×10-10	1,4
F(ab')2

Антитела D2E7 и близкие антитела также обладают высокой способностью к нейтрализации активности hTNFα, что было определено в ряде анализов in vitro и in vivo (см. Пример 4). Например, эти антитела нейтрализуют hhTNFα-индуцированную цитотоксичность клеток L929