Условно реплицирующийся ретровирусный вектор (варианты), способ его получения и использования (варианты), выделенная и очищенная молекула нуклеиновой кислоты

Условно реплицирующийся ретровирусный вектор (варианты), способ его получения и использования (варианты), выделенная и очищенная молекула нуклеиновой кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По данной заявке испрашивается приоритет в соответствии с заявкой No08/563459, поданной 28 ноября 1995, которая конвертирована во временную патентную заявку и во всей полноте включена в настоящее описание в виде ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к кондиционно реплицирующемуся вирусному вектору, способам получения, модификации, размножения и селективной упаковки такого вектора, выделенным молекулам специфических нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, относящихся к таким векторам, фармацевтической композиции и клетке-хозяину, содержащей такой вектор, а также к способам применения указанного вектора и клетки-хозяина.

Уровень техники

Открытие того факта, что вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) вызывает синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), способствовало развитию многочисленных исследований механизмов инфекционного цикла вирусов и вирусного патогененза. Изучение этих механизмов представляет исследователям все увеличивающееся число мишеней для разработки антивирусных агентов, эффективных не только в отношении ВИЧ, но и других вирусов. Эти антивирусные агенты, особенно направленные против ВИЧ, могут быть разделены на группы в зависимости от способа их действия. Такие группы включают ингибиторы обратной транскриптазы, конкуренты проникновения вируса в клетки, вакцины и ингибиторы протеазы, а также недавно образованную группу, обозначаемую здесь, как "генетически антивирусные агенты".

В целом каждый тип антивирусного агента имеет свои собственные преимущества и ограничения и должен оцениваться с точки зрения определенной терапевтической ситуации. Антивирусные агенты, такие как зидовудин (3'-азидо-3'-дезокситимидин, известный также как АЗТ), ингибиторы протеазы и т.д. могут быть относительно легко доставлены в клетки организма пациента и широко изучены. Будучи направленными на один специфический фактор инфекционного вирусного цикла, такие агенты обнаруживают относительную неэффективность в отношении ВИЧ. Это в основном обусловлено тем фактом, что штаммы ВИЧ быстро изменяются и становятся резистентными к агентам, воздействующим на один локус (Richman, AIDS Res. and Hum. Retrovir., 8, 1065-1071 (1992)).

Соответственно проблемы генетических вариаций и быстрых мутаций в геномах ВИЧ создают необходимость разработки новых антивирусных стратегий для лечения ВИЧ-инфекций. Среди этих направлений генетические антивирусные агенты являются наиболее перспективными, поскольку они "работают" в клетках на многих уровнях.

Генетические антивирусные агенты отличаются от других терапевтических агентов тем, что они переносятся как молекулярные элементы в клетку-мишень и защищают от вирусной инфекции (Baltimore, Natura, 325, 395-396 (1988); Dropulic' et al., Hum. Gene Ther., 5, 927-939 (1994)). Генетические антивирусные агенты могут быть представлены любой генетической последовательностью и включают, но не ограничиваются антисмысловыми молекулами, "ловушками" РНК, трансдоминантными мутантами, интерферонами, токсинами, иммуногенами и рибозимами. В частности, рибозимы являются антивирусными агентами, которые расщепляют РНК-мишени, в том числе РНК ВИЧ, последовательность-специфическим образом. Специфичность обусловленного рибозимом расщепления РНК-мишени предполагает возможность применения рибозимов как терапевтических ингибиторов репликации вирусов, включая ВИЧ. Различные типы рибозимов, такие как рибозимы в форме молотка и шпильки, были использованы в различных подходах для борьбы с ВИЧ (см., например, Патенты США № 5144019, 5180818 и 5272262 и патентные заявки PCT № WO 94/01549 и WO 93/23569). Оба рибозима - конфигурации молотка и шпильки - могут быть сконструированы для расщепления любой РНК-мишени, которая содержит последовательность GUC (Haseloff et al., Nature, 334, 585-591 (1988); Uhlenbeck, Nature, 334,585 (1987); Hampel et al., Nuc. Acids Res., 18, 299-304 (1990) и Symons, Ann Rev. Biochem., 61, 641-671 (1992)). В целом, рибозимы в форме молотка имеют два типа функциональных доменов, консервативный каталитический домен, фланкированный двумя гибридизационными доменами. Гибридизационные домены связывают последовательности, окружающие последовательность GUC, а каталитический домен расщепляет РНК-мишень с 3'-конца от последовательности GUC (Uhlenbeck(1987), supra; Haseloff et al. (1988), supra и Symons (1992), supra).

Многочисленные исследования подтвердили, что рибозимы могут быть, по меньшей мере, частично эффективными при ингибировании размножения ВИЧ в клетках тканевой культуры (см., например, Sarver et al., Science, 247, 1222-1225 (1990); Sarver et al., NIH Res., 5, 63-67 (1993a); Dropulic' et al., J. Virol., 66, 1432-1441 (1992), Dropulic' et al., Methods: Comp. Meth. Enzymol., 5, 43-49 (1993); Ojwang et al., PNAS, 89, 10802-10806 (1992); Yu et al., PNAS, 90, 6340-6344 (1993) и Weerasinghe et al., J. Virol., 65, 5531-5534 (1991). В частности, Sarver et al. ((1990), supra) продемонстрировали, что рибозимы в форме молотка, полученные с целью расщепления транскрибированного участка гена gag ВИЧ, т.е. анти-gag рибозимы, способны специфически расщеплять РНК gag ВИЧ in vitro. Более того, когда клеточные линии, экспрессирующие анти-gag рибозимы, были инфицированы ВИЧ-1, наблюдалось ингибирование репликации ВИЧ в 50 до 100 раз. Аналогично, Weerasinghe et al. ((1901), supra) показали, что ретровирусные векторы, кодирующие рибозимы, сконструированные для расщепления последовательности U5 РНК ВИЧ-1, обусловливают резистентность к ВИЧ трансдуцированных клеток при последующем заражении ВИЧ. Хотя различные клоны трансдуцированных клеток продемонстрировали различные уровни резистентности к заражению, что было определено с помощью промоторной системы, используемой для направления экспрессии рибозима, большинство из экспрессирующих рибозим клеточных линий "не выдержали" экспрессии ВИЧ через определенное время культивирования.

Показано, что трансдукция клеток тканевой культуры провирусом, в ген nef которого (не являющийся основным для репликации вируса в культуре ткани) был интродуцирован рибозим с гибридизационными доменами, специфичными к участку U5 ВИЧ, ингибирует репликацию вируса в трансдуцированных клетках в 100 эффективнее по сравнению с клетками, трансдуцированными провирусами дикого типа (см., например, Dropulic' et al. (1992) и (1993), supra). Аналогичным образом показано, что рибозимы в форме шпильки ингибируют репликацию ВИЧ в Т-клетках, трансдуцированных векторами, содержащими рибозимы-шпильки U5, и зараженных ВИЧ (Ojwang et al. (1992), supra). Другие исследования показали, что векторы, содержащие рибозимы, экспрессированные с помощью промотора тРНК, также ингибируют некоторые штаммы ВИЧ (Yu et al. (1993), supra).

Доставка рибозимов или других генетических антивирусных агентов к клеточным мишеням ВИЧ (например, к CD4+ Т-клеткам и моноцитарным макрофагам) была основным препятствием эффективной генетической терапии СПИДа. Существующие подходы к обеспечению "нацеливания" на клетки гемопоэтической системы (т.е. первичные мишени инфекционного ВИЧ) предусматривают интродукцию терапевтически активных генов в мультипотентные стволовые клетки-предшественники, которые дифференцируются и дают зрелые Т-клетки или, альтернативно, зрелые СD4+ Т-лимфоциты. Однако обеспечение "нацеливания" на стволовые клетки проблематично, поскольку указанные клетки трудно культивировать и трансдуцировать in vitro. Направленность на циркулирующие в крови Т-лимфоциты также является проблематичной, поскольку они так широко диссеменированы в организме, что все клетки-мишени трудно достижимы при использовании имеющихся векторных систем доставки. Более того, макрофаги следует рассматривать как клеточную мишень, поскольку они являются основным резервом для передачи вирусов в другие органы. Однако, поскольку макрофаги представляют собой терминально дифференцированные клетки и вследствие этого не подвергаются клеточному делению, их трудно трансдуцировать с помощью обычно используемых векторов.

Соответственно преобладающий современный подход к лечению ВИЧ предусматривает использование репликационно-дефектных вирусных векторов и упаковывающих (т.е. "хелперных" (вспомогательных)) клеточных линий (см., например, Buchschacher, JAMA, 269 (22), 2880-2886 (1993); Anderson, Science, 256, 808-813 (1992); Miller, Nature, 357, 455-460 (1992); Mulligan, Science, 260, 926-931 (1993); Friedmann, Science, 244, 1275-1281 (1989) и Cournoyer et al., Ann Rev. Immunol., 11, 297-329 (1993)) для интродукции в клетки, чувствительные к вирусной инфекции (такой как ВИЧ-инфекция) чужеродного гена, который специфически интерферирует с репликацией вируса или вызывает гибель инфицированной клетки (обзор Buchschacher (1993), supra). Такие репликационно-дефектные вирусные векторы содержат кроме чужеродного гена, представляющего интерес, цис-действующие последовательности, необходимые для репликации вируса, но не последовательности, которые кодируют основные вирусные белки. Следовательно, такой вектор не способен к осуществлению полного цикла вирусной репликации, и для его размножения используют линию хелперных клеток, которая содержит в составе генома и конститутивно экспрессирует вирусные гены в своем геноме. После интродукции репликационно-дефектного вирусного вектора в линию хелперных клеток вектор получает trans-образом белки, необходимые для образования вирусных частиц, и формируются векторные вирусные частицы, способные инфицировать клетки-мишени и экспрессировать в них ген, который интерферирует с репликацией вируса или вызывает гибель инфицированных вирусом клеток.

Такие репликационно-дефектные ретровирусные векторы включают аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы, а также те ретровирусные векторы, которые используют в клинических исследованиях генотерапии ВИЧ, в частности мышиный амфотропный ретровирусный вектор, известный как вирус мышиного лейкоза мышей Молони (MuLV). Эти дефектные вирусные векторы были использованы для трансдукции CD4+ клеток генетическими антивирусными агентами, такими как анти-Вич рибозимы, с разной степенью успеха (Sarver et al. (1990), supra; Weerasinghe et al. (1991), supra; Dropulic' et al. (1993), supra; Ojwang et al. (1992), supra и Yu et al. (1993), supra). Однако указанные векторы по своей природе имеют ограниченное применение в генотерапии ВИЧ. Например, высокая частота трансдукции является особенно важной при лечении ВИЧ, где вектор должен трансдуцировать либо редкие гемопоэтические CD34+стволовые клетки-предшественники, либо широко распространенные в организме CD4+ Т-клетки-мишени, большинство из которых во время клинической "латентной" стадии болезни являются уже инфицированными ВИЧ. Однако трудно получить векторы MuLV в высоких титрах, что приводит к малоэффективной трансдукции. Более того, в CD34+ стволовых клетках-предшественниках не получена длительная экспрессия трансдуцированной ДНК, особенно после дифференцировки в зрелые Т-лимфоциты. Кроме того, для использования дефектных вирусных векторов требуются стратегии переноса генов ex vivo (см., например, Патент США №5399346), которые могут быть дорогими и недоступными для основной части населения.

Указанные недостатки, связанные с использованием имеющихся в настоящее время векторов для генетической терапии СПИДа, обусловили разработки новых вирусных векторов. Одним из таких векторов является сам ВИЧ. ВИЧ-векторы были использованы для изучения инфекционности (Page et al., J. Virol., 64, 5270-5276 (1990)) и для интродукции генов (таких как суицидные гены) в CD4+ клетки, в особенности в ВИЧ-инфицированные CD4+ клетки (см., например, Buchschacher et al., Hum. Gener. Ther., 3, 391-397 (1992); Richardson et al., J. Virol., 67, 3997-4005 (1993); Carroll et al., J. Virol, 68, 6047-6051 (1994) и Parolin et al., J. Virol., 68, 3888-3895 (1994)). Стратегией этих исследований является использование ВИЧ-векторов для интродукции генов в CD4+ Т-клетки и моноциты.

В настоящее время, однако, данные векторы являются чрезвычайно сложными. Более того, использование векторов сопровождается риском генерации ВИЧ дикого типа при внутриклеточной рекомбинации. Котрансфекция/коинфицирование дефектных векторных последовательностей и хелперного вируса, как было показано, приводит к рекомбинации между гомологичными участками вирусных геномов (Inoue et al., PNAS, 88, 2278-282 (1991)). Наблюдаемая in vitro комплементация указывает на то, что в подобном репликационно-дефектном ВИЧ-векторе in vivo могла бы происходить рекомбинация, усиливая таким образом уже существующую ВИЧ-инфекцию. Тот факт, что ретровирусы упаковывают два генома РНК в один вирион, привел исследователей к предположению, что ретровирусы содержат две вирусные РНК для того, чтобы обходить любые генетические дефекты, вызываемые комплементацией и/или рекомбинацией (Inoue et al. (1991), supra).

В дополнение к риску внутриклеточной рекомбинации, в результате которой образуется ВИЧ дикого типа, ВИЧ-векторы обнаруживают ассоциированный риск мутации in vivo, который повышает патогенность вирусного вектора. Это привело Sarver et al. (AIDS Res. and Hum. Retrovir., 9, 483-487 (1993b)) к предположению относительно разработки рекомбинантных ВИЧ-векторов второго поколения, которые являются репликационно-компетентными, но непатогенными. Такие векторы в сравнении с широко используемыми нереплицирующимися векторами (т.е. по репликации дефектными векторами) продолжают реплицироваться в организме пациента, обеспечивая таким образом постоянную конкуренцию с ВИЧ дикого типа. Однако авторы изобретения не располагают указанными векторами.

В идеале наилучшая возможность лечения инфицированного индивидуума существует во время инокуляции, даже перед тем, как вирус инфицирует хозяина. Однако это трудно осуществимо, поскольку многие индивидуумы до клинической латентной фазы заболевания не предполагают, что они инфицированы ВИЧ. Таким образом, стадией, на которой антивирусное лечение наиболее необходимо, является клиническая латентная фаза заболевания. Терапия на этой стадии требует, чтобы атака большого числа уже инфицированных CD4+-лимфоцитов, которые содержат вирусные геномы, была отражена. Это не столь просто, что подтверждается тем фактом, что на данный момент СПИД остается неизлечимым и слабо поддается воздействию современных способов терапии. Эффективная вакцина пока не разработана и, хотя было показано, что ингибиторы обратной транскриптазы и протеазы препятствуют репликации ВИЧ в тканевой культуре, генерация вирусной резистентности in vivo не привела к появлению успешных терапевтических подходов. Таким образом, генотерапия ВИЧ может не иметь большого значения для подавляющего большинства ВИЧ-инфицированных индивидуумов, число которых по прогнозам превысит 40 миллионов к 2000 году.

В свете изложенного выше все более важной становится генерация длительных и устойчивых иммунологических ответов в отношении определенных патогенов, особенно вирусов, в частности, в контексте СПИДа и рака. Получены живые аттенуированные (LA) вакцины с использованием репликационно-компетентных, но непатогенных вирусов (Daniel et al., Science, 258, 1938-1941 (1992) и Desrosiers, AIDS Res. & Human Retrovir., 10, 331-332 (1994)). Однако такие непатогенные вирусы, отличающиеся от соответствующих вирусов дикого типа делецией в одном или более генов, либо (1) не могут вызывать защитный иммунный ответ, потому что отсутствует персистенция антигена (поскольку LA-вирус не является эффективно реплицирующимся), либо (2) LA-вирус реплицируется, но имеет другой патогенный потенциал, что подтверждается способностью LA-вируса вызывать заболевание у молодых модельных животных (Baba et al., Science, 267, 1823-1825(1995)).

По вышеупомянутым причинам сохраняется необходимость разработки альтернативных профилактических и терапевтических способов лечения вирусной инфекции, особенно СПИДа и раковых заболеваний. Настоящее изобретение обеспечивает такие альтернативные способы посредством кондиционно реплицирующегося вектора. Изобретение также относится к дополнительным способам, в которых может быть использован такой вектор. Указанные и другие объекты и преимущества настоящего изобретения, а также дополнительные отличительные признаки изобретения будут очевидны из приведенного ниже описания изобретения.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к кондиционно реплицирующемуся вирусному вектору, который характеризуется способностью реплицироваться только в клетке-хозяине, пермиссивной для репликации вектора.

Согласно другому варианту осуществления изобретения кондиционно реплицирующийся вирусный вектор содержит, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, наличие, транскрипция или трансляция которой обеспечивает вектору в репликационно-пермиссивной клетке-хозяине селективное преимущество перед штаммом вируса дикого типа, соответствующего вирусу, из которого получен вектор.

Согласно другому варианту осуществления изобретения кондиционно реплицирующийся вирусный вектор, который предпочтительно является ретровирусом, содержит, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, наличие, транскрипция или трансляция которой обеспечивает клетке-хозяину, которая инфицирована вектором, селективное преимущество перед клеткой, инфицированной штаммом вируса дикого типа, соответствующим вирусу, из которого получен вектор.

В настоящем изобретении заявлена также фармацевтическая композиция, содержащая кондиционно реплицирующийся вирусный вектор и фармацевтически приемлемый носитель. Заявлена и клетка-хозяин, содержащая кондиционно реплицирующийся вирусный вектор. Другим объектом изобретения является вектор, который в случае ДНК-вектора содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID No 2, 3, 4, 5, 6, 14, в которых, по меньшей мере, один из нуклеотидов (N) является мутантным, 15 и 16, и в случае РНК-вектора содержит нуклеотидную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, включающей SEQ ID No 2, 3, 4, 5, 6, 14, в которых, по меньшей мере, один из N является мутантным, 15 и 16, а также выделенные и указанные очищенные молекулы нуклеиновой кислоты. Заявлены также способ конструирования вектора с рибозимом, способы модификации вектора и способ размножения и селективной упаковки кондиционно реплицирующегося вектора без использования упаковывающей клеточной линии.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ терапевтической и профилактической обработки клетки-хозяина при вирусной инфекции. Такие способы могут предусматривать соответствующее дополнительное использование хелперного экспрессирующего вектора, цитотоксического лекарственного вещества, белков/факторов или ингибитора протеазы/обратной транскриптазы соответствующим образом. Способ может быть использован, например, для ингибирования репликации вируса, лечения рака, переноса генов in vivo или для экспрессии гена, представляющего интерес, в клетке-хозяине.

Еще одним объектом настоящего изобретения является способ применения клетки-хозяина, содержащей кондиционно реплицирующийся вектор, для детекции взаимодействия между лекарственным веществом/фактором и белком. Такой способ обеспечивает возможность характеризации белка и скрининга активности лекарственных веществ/факторов в отношении данного белка.

Перечень фигур чертежей

На Фигурах 1А-1Е представлены схематические изображения структуры вирусного генома, присутствующего в ВИЧ дикого типа (Фиг.1А), crВИЧ-1.1 (Фиг.1В), crВИЧ-1.11 (Фиг.1C), crВИЧ-1.12 (Фиг.1D) и crВИЧ-1.111 (Фиг.1Е).

Обозначения: cr - кондиционно реплицирующийся; U5 - U5-кодирующая последовательность; Rz - рибозим; φ - сигнал упаковки; gag, pol и env - кодирующие последовательности белков, которые образуют вирусное ядро, обратную транскриптазу и оболочку вируса соответственно; tat, rev, rre и nef - дополнительные вирусные гены; незакрашенные прямоугольники - вирусные длинные концевые повторы. Крестами в кодирующем участке U5 дикого типа обозначены примерные локусы, в которых рибозимы в соответствии с заявленным изобретением расщепляют РНК U5 дикого типа, но не модифицированную PHK U5 crВИЧ (т.е. "mU5").

На Фигуре 2 показаны последовательности ДНК U5 РНК ВИЧ дикого типа (SEQ ID No1) (А) и модифицированной РНК U5 crВИЧ (SEQ ID No2) (В). Цифрами обозначено число оснований, расположенных ниже области начала транскрипции.

На Фигуре 3 представлен график зависимости активности обратной транскриптазы (cpm/мкл) от времени (дни после котрансфекции) для вызываемого crВИЧ ингибирования репликации ВИЧ дикого типа в клетках Jurkat, котрансфицированных ВИЧ дикого типа и crВИЧ-1.1 (незакрашенные прямоугольники), ВИЧ дикого типа и crВИЧ-1.11 (незакрашенные перечеркнутые прямоугольники), ВИЧ дикого типа и crВИЧ-1.12 (незакрашенные заштрихованные прямоугольники) и ВИЧ дикого типа и контрольной плазмидой pGEM-3Z (черные прямоугольники).

На Фигуре 4 представлен график зависимости активности обратной транскриптазы (cpm/мкл) от времени (дни после котрансфекции) для вызываемого crВИЧ ингибирования репликации ВИЧ дикого типа в клетках Jurkat, котрансфицированных ВИЧ дикого типа и crВИЧ-1.1 (незакрашенные прямоугольники), ВИЧ дикого типа и crВИЧ-1.11 (незакрашенные перечеркнутые прямоугольники), ВИЧ дикого типа и crВИЧ-1.12 (незакрашенные заштрихованные прямоугольники) и ВИЧ дикого типа и контрольной плазмидой pGEM-3Z (черные прямоугольники).

На Фигурах 5А-5С приведены схематические изображения праймеров и зондов, используемых для детекции транскриптов РНК U5 ВИЧ дикого типа (Фиг.5А), crВИЧ-1.1 (Фиг.5В) и crВИЧ-1.111 (Фиг.5С). Обозначения: U5 - U5-кодирующая последовательность; φ - сигнал упаковки; gag, pol и env - кодирующие последовательности белков, которые образуют ядро вируса, обратную транскриптазу и оболочку вируса соответственно; незакрашенные прямоугольники - вирусные длинные концевые повторы; черные прямоугольники - последовательности, кодирующие tat и rev, и РЕ, V1, V2, V3, R1 и R2 - праймеры, используемые для реплицирующихся вирусов дикого типа и/или кондиционно реплицирующихся вирусов. Крестом в кодирующем участке U5 дикого типа отмечен примерный локус, в котором рибозимы в соответствии с заявленным изобретением расщепляют РНК U5 дикого типа, но не модифицированную РНК U5 crВИЧ (т.е. "mU5").

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к способу ингибирования репликации штамма вируса дикого типа. Способ предусматривает обеспечение контактирования хозяина, который способен подвергаться инфицированию таким штаммом вируса дикого типа и предпочтительно действительно инфицирован таким штаммом вируса дикого типа, с вектором, размножающимся только в хозяине, который является пермиссивным в отношении репликации вектора (т.е. непатогенным кондиционно реплицирующимся (cr) вектором).

Как здесь далее описано, основной целью способа является генерирование конкурентной инфекции в организме хозяина с помощью такого непатогенного кондиционно реплицирующегося вектора. В целом, кондиционно реплицирующийся вектор по изобретению содержит, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая обусловливает селективное преимущество для репликации и распространения кондиционно реплицирующегося вектора по сравнению с вирусом дикого типа, и/или, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая обусловливает селективное преимущество для размножения вирусных частиц в клетке-хозяине, содержащей кондиционно реплицирующийся вектор по сравнению с клеткой-хозяином, содержащей вирус дикого типа.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения вектор содержит последовательность ВИЧ и используется для лечения ВИЧ-инфекции. Таким образом, вектор или клетка-хозяин, несущая вектор, содержат, по меньшей мере, одну последовательность нуклеиновой кислоты, которая (1) обеспечивает геному crВИЧ селективное преимущество перед геномом ВИЧ дикого типа с точки зрения упаковки потомства вирионов (т.е. в клетках, где находятся оба вириона) и/или (2) обеспечивает клетке-хозяину, продуцирующей кондиционно реплицирующийся вектор (вирус) селективное преимущество с точки зрения образования вирионов crВИЧ по сравнению с клеткой-хозяином, продуцирующей вирус дикого типа. Один способ (которым изобретение не ограничивается) предусматривает обеспечение геномов crВИЧ селективным преимуществом с точки зрения упаковки посредством введения в них одного или более рибозимов, способных расщеплять геном ВИЧ дикого типа.

Вирус Дикого Типа

Согласно изобретению "вирус" представляет собой инфекционный агент, который состоит из белка и нуклеиновой кислоты и использует генетические механизмы клетки-хозяина для образования вирусных продуктов, кодируемых вирусной нуклеиновой кислотой. "Нуклеиновая кислота" означает полимер ДНК или РНК, который является одно- или двунитевым, линейным или кольцевым и (необязательно) содержит синтетические, неприродные или модифицированные нуклеотиды, которые способны включаться в полимеры ДНК или РНК. Полинуклеотид ДНК предпочтительно состоит из последовательностей геномных или кДНК.

"Штамм вируса дикого типа" представляет собой штамм, который не содержит никаких генерированных человеком мутаций, т.е. любой вирус, который может быть выделен из природных источников. Альтернативно, штамм дикого типа является любым вирусом, который культивируют в лабораторных условиях, но который при отсутствии любого другого вируса способен к образованию геномов или вирионов потомства, подобных природным. Например, молекулярный клон ВИЧ pNL 4-3, описанный в следующих Примерах, является штаммом дикого типа, который получен в соответствии с the AIDS Reserch and Reference Reagent Program Catalog Национального института здравоохранения (см. также Adachi et al., J. Virol., 59, 284-291 (1986)).

В целом способ, описанный в настоящей заявке, предпочтительно используют для лечения вирусных заболеваний, которые развиваются в результате вирусной инфекции. Желательно, чтобы вирус (а также вектор, как обсуждается ниже) являлся РНК-вирусом, но он может быть и ДНК-вирусом. РНК-вирусы - это разнообразная группа вирусов, которая инфицирует прокариот (например, бактериофаги), а также многочисленных эукариот, включая млекопитающих, в частности человека. Геном большинства РНК-вирусов представлен однонитевой РНК, хотя, по меньшей мере, у одного семейства генетический материал представлен двунитевой РНК. РНК-вирусы подразделяются на три основные группы: вирусы с положительной цепью (т.е. переносимый вирусом геном, транслируется с образованием белка, и депротеинизированной нуклеиновой кислоты вируса достаточно для начала инфекции), вирусы с отрицательной цепью (т.е. переносимый вирусом геном, является комплементарным смысловому и должен транскрибироваться вирион-ассоциированными ферментами для того, чтобы могла произойти трансляция), а также двунитевые РНК-вирусы. Способ по настоящему изобретению предпочтительно используют в отношении вирусов с положительной цепью, вирусов с отрицательной цепью и двунитевых РНК-вирусов.

Как указывается в настоящем описании, РНК-вирус относится к Синдбис-подобным вирусам (например, Togaviridae, Bromovirus, Cucumovirus, Tobamovirus, Ilarvirus, Tobravirus и Potexvirus), пикорнавирус-подобным вирусам (например, Picornaviridae, Caliciviridae, Comovirus, Nepovirus и Potyvirus), вирусам с отрицательной цепью (например, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae и Arenaviridae), двунитевым вирусам (например, Reoviridae и Birnaviridae), флавивирус-подобным вирусам (например, Flaviviridae и Pestivirus), ретровирус-подобным вирусам (например, Retroviridae), Coronaviridae и другим группам вирусов, включающим, но не ограничивающимся Nodaviridae.

Предпочтительным РНК-вирусом по изобретению является вирус семейства Flaviviridae, предпочтительно вирус рода Filovirus и особенно вирус Марбурга или Эбола. Предпочтительно, чтобы вирус семейства Flaviviridae представлял собой вирус рода Flavivirus, например вирус желтой лихорадки, вирус Западного Нила, вирус энцефалита Сан-Луи, вирус японского энцефалита, вирус энцефалита долины Мюррей, вирус Рокио, вирус клещевого энцефалита и т.д.

Кроме того, предпочтительным является вирус семейства Picornaviridae, в особенности вирус гепатита A (HAV), вирус гепатита В (HBV) или вирус гепатита ни-А ни-В.

Другим предпочтительным РНК-вирусом является вирус семейства Retroviridae (т.е. ретровирус), в частности вирус рода или подсемейства Oncovirinae, Spumavirinae, Spumavirus, Lentivirinae и Lentivirus. Желательно, чтобы РНК-вирус подсемейства Oncovirinae представлял собой Т-лимфотропный (в отношении Т-клеток человека) вирус типа 1 или 2 (т.е. HTLV-1 или HTLV-2) или вирус бычьего лейкоза (BLV), вирус лейкосаркомы птиц (например, вирус саркомы Роуз (RSV), вирус миелобластоза птиц (AMV), вирус эритробластоза птиц (AEV) и Раус-ассоциированный вирус (RAV; RAV-0 до RAV-50), вирус млекопитающих С-типа (например, вирус лейкоза мышей Молони (MuLV), вирус саркомы Харвей мышей (HaMSV), вирус лейкоза мышей Абелсона (A-MuLV), AKR-MuLV, вирус лейкоза кошек (FeLV), вирус саркомы обезьян, вирус ретикулоэндотелиоза (REV), вирус некроза селезенки (SNV), вирус В-типа (например, вирус опухоли молочной железы мышей (MMTV)) и вирус D-типа (например, обезьяний вирус Мейсон-Пфайзер (MPMV) и вирусы "SAIDS"). РНК-вирусы подсемейства Lentivirus предпочтительно являются вирусами иммунодефицита человека типов 1 и 2 (т.е. ВИЧ-1 или ВИЧ-2, при этом ВИЧ-1 раньше называли с лимфаденопатией вирусом 3 (HTLV-III) и вирусом, ассоциированным с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД) (ARV)), или другим вирусом, близким ВИЧ-1 или ВИЧ-2, который был идентифицирован и ассоциирован со СПИДом или СПИД-подобным заболеванием. Акроним "ВИЧ" или термины "вирус СПИДа" или "вирус иммунодефицита человека" употребляются здесь по отношению к вирусам ВИЧ и ВИЧ-подобным и ВИЧ-ассоциированным вирусам. Более того, РНК-вирус подсемейства Lentivirus предпочтительно представляет собой вирус Висны/Маэди (например, инфицирующий овец), вирус иммунодефицита кошек (FIV), бычий лентивирус, вирус иммунодефицита обезьян (SIV), вирус инфекционной анемии лошадей (EIAV) и вирус артрита-энцефалита коз (CAEV).

Вирус по изобретению предпочтительно является ДНК-вирусом. Предпочтительно ДНК-вирус представляет собой вирус Эпштейн-Барра, аденовирус, вирус простого герпеса, вирус папилломы, вирус вакцины и т.п.

Многие из указанных вирусов классифицируются как патогены "Уровня Биобезопасности 4" (т.е. 4-ой группы риска" по классификации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)), которые требуют определенного обеспечения оборудованием при всех лабораторных исследованиях, осуществляемых с ними. Однако обычный квалифицированный специалист знаком с мерами предосторожности, обеспечивающими безопасность, необходимую для работы с данными вирусами, и способен их выполнить.

"Клетка-хозяин" может быть любой клеткой и предпочтительно является эукариотической клеткой. Желательно, чтобы клетка-хозяин являлась лимфоцитом (например, Т-лимфоцитом) или макрофагом (например, моноцитарным макрофагом) или предшественником любой из указанных клеток, например гемопоэтической стволовой клеткой. Предпочтительно, чтобы клетки экспрессировали на клеточной поверхности CD4+ гликопротеин, т.е. являлись CD4+-клетками. Желательно, однако, чтобы CD4+ Т-лимфоцит, который инфицирован вирусом СПИДа, еще не был активированным (т.е. предпочтительно, чтобы экспрессия гена net еще не началась и даже более предпочтительно отсутствие регуляции по типу обратной связи экспрессии гена CD4, как будет обсуждаться ниже). Более того, предпочтительно, чтобы клетка-хозяин представляла собой клетку, у которой отсутствует маркер CD4, но которая еще способна инфицироваться вирусом, заявленным в соответствии с настоящим изобретением. Такая клетка может быть (без ограничений указанным) астроцитом, фибробластом кожи, клеткой кишечного эпителия и т.д. Предпочтительно клетка-хозяин является эукариотической клеткой многоклеточного организма (например, в противоположность одноклеточным дрожжам) и более предпочтительно клеткой млекопитающего, например человека. Клетка может быть представлена отдельной клеткой или частью более крупной клеточной популяции. Такая "более крупная популяция клеток" может включать, например, культуру клеток (смешанную или чистую), ткань (например, эпителиальную или иную ткань), орган (например, сердце, легкое, печень, желчный пузырь, мочевой пузырь, глаз и другие органы), систему органов (например, кровеносную систему, мочеиспускательную систему, нервную систему, систему наружных покровов или другую систему) или организм (например, птицу, млекопитающее и т.п.). Предпочтительно органы/ткани/клетки-мишени относятся к кровеносной системе (например, включают, но не ограничиваются сердцем, кровеносными сосудами и кровью), дыхательной системе (например, носу, глотке, гортани, трахеи, бронхам, бронхиолам, легким и т.п.), желудочно-кишечной системе (например, рту, глотке, пищеводу, желудку, кишечнику, слюнным железам, поджелудочной железе, печени, желчному пузырю и т.д.), мочеиспускательной системе (например, почкам, мочеточникам, мочевому пузырю, уретре и т.д.), нервной системе (например, включают, но не ограничиваются, головным мозгом, спинным мозгом и специальными органами чувств, такими как глаз) и системе наружных покровов (например, коже). Более предпочтительно, если клетки-мишени выбраны из группы, состоящей из клеток сердца, кровеносных сосудов, легкого, печени, желчного пузыря и глаза.

Вектор

"Вектор" представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты (в обычном случае ДНК или РНК), которая служит для переноса последовательности "нуклеиновой кислоты-пассажира" (т.е. ДНК или РНК) в клетку-хозяин. Три обычных типа векторов включают плазмиды, фаги и вирусы. Предпочтительным вектором является вирус.

Желательно, чтобы вектор не являлся штаммом вируса дикого типа, поскольку он содержит генерированные человеком мутации. Таким образом, вектор обычно получают на основе штамма вируса дикого типа с помощью генетических манипуляций (т.е. посредством делеции), и он представляет собой кондиционно реплицирующийся вирус, как далее будет описано. Оптимально, вирусный вектор представляет собой штамм вируса, того же типа, что и вирус дикого типа, вызывающий инфекцию, которая подлежит лечению, и предпочтительно является одним из вышеупомянутых вирусов дикого типа. В соответствии с указанным предпочтительно получение вектора на основе РНК-вируса, более предпочтительно получение вектора на основе ретровируса и оптимально получение вектора на основе вируса иммунодефицита человека. Такой вектор, выделенный из вируса иммунодефицита человека, здесь обозначают общим термином "crВИЧ"-вектор.

Предпочтительно вектор представляет собой "химерный вектор", например комбинацию вирусного вектора с другими последовательностями, например комбинацию последовательностей ВИЧ с другим вирусом (который предпочтительно получен на основе штамма вируса дикого типа и представляет собой кондиционно реплицирующийся вектор). В частности, последовательности ВИЧ предпочтительно могут быть связаны с последовательностями модифицированного (т.е. недикого типа) штамма аденовируса, адено-ассоциированного вируса, вектора на основе вируса Синдбис или амфотропного мышиного ретровирусного вектора.

Как указывается здесь, вектор может содержать либо ДНК, либо РНК. Например, либо ДНК-, либо РНК-вирус может быть использован для получения вектора. Аналогично, копия кДНК может быть получен на основе геномной РНК вируса. Альтернативно, фрагмент кДНК (или вирусной геномной ДНК) может быть транскрибирован in vitro с образованием РНК. Эти методики хорошо известны специалистам, а также описаны в нижеследующих Примерах.

"Кондиционно реплицирующийся вирус" представляет собой репликационно-дефектный вирус, который дефектен только в определенных условиях. В частности, вирус может завершать свой репликационный цикл в пермиссивной клетке-хозяине и не может завершать репликационный цикл в рестриктивной клетке-хозяине. "Пермиссивная клетка-хозяин" является клеткой-хозяином, инфицированной штаммом вируса дикого типа. Такая инфекция может происходить либо до, либо после инфицирования кондиционно реплицирующимся вирусом, заявленным в соответствии с настоящим изобретением. Альтернативно, "пермиссивная клетка-хозяин" является клеткой, которая кодирует генные продукты вируса дикого типа, необходимые для репликации вируса. Таким образом, кондиционно реплицирующийся вектор, заявленный в соответствии с настоящим изобретением, является вирусом (предпочтительно вирусом того же типа, что и вирус, вызывающий инфекцию, которая подлежит лечению), реплицирующийся только при комплементации со штаммом вируса дикого типа или в том случае, когда вирус дикого типа инфицирует клетки, содержащие геномы кондиционно реплицирующихся векторов.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения вектор представляет собой РНК-вирус (например, кондиционно реплицирующийся вирус ВИЧ), который интродуцируется в форме ДНК. Этот предпочтительный вариант