Нуклеотидные и аминокислотные последовательности факторов яйцеклеток для изменения роста яичниковых фолликулов in vivo или in vitro

Нуклеотидные и аминокислотные последовательности факторов яйцеклеток для изменения роста яичниковых фолликулов in vivo или in vitro

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Данное изобретение относится к нуклеотидным и аминокислотным последовательностям факторов яйцеклеток для изменения роста яичниковых фолликулов in vivo или in vitro. Данное изобретение относится также к новым гомодимерным и гетеродимерным полипептидам и их применению для изменения роста яичниковых фолликулов млекопитающих in vivo или in vitro. В частности, данное изобретение в широком смысле относится к активной и пассивной иммунизации против этих гомо- или гетеродимерных полипептидов или их функциональных фрагментов или вариантов для изменения фолликулярного роста in vivo или in vitro.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Молекулярная природа регуляторных молекул, ответственных за стимуляцию ранних фаз яичникового фолликулогенеза (т.е. роста и дифференцировки примордиальных фолликулов в первичные, вторичные и преантральные фолликулы), является слабо исследованной. С другой стороны, фолликулостимулирующий гормон (FSH) и лютеинизирующий гормон являются гликопротеиновыми гормонами, происходящими из гипофиза, и обычно считаются ключевыми факторами, регулирующими более поздние стадии фолликулогенеза яичников. Кроме того, FSH считается единственным наиболее важным фактором для стимуляции большего, чем нормальное, числа фолликулов для овуляции, факта, который хорошо иллюстрируется широким применением коммерческих препаратов FSH в схемах гиперстимуляции яичников как в медицине, так и в ветеринарии. Недавние исследования показали, что ранний фолликулогенез регулируется внутрияичниковыми факторами, из которых наибольшее внимание привлекли полученный из клеток гранулезы (зернистой оболочки фолликулов яичника) фактор стволовых клеток (или c-kit-лиганд) и ооцитарный фактор-9 дифференцировки роста (GDF-9), так как оба, по-видимому, являются существенными для раннего фолликулогенеза млекопитающих.

GDF-9 был впервые описан в 1993 году как новый член надсемейства трансформирующих факторов роста бета (TGF-β), который специфически экспрессируется в яичнике (McPherron and Lee, 1993). Подобно другим членам TGF-β-семейства, GDF-9 кодируется в виде препропептида, состоящего из сигнального пептида, прорайона и так называемого С-концевого зрелого района, который отщепляется от пептида-предшественника внутриклеточной протеазой, принадлежащей к группе фурин-подобных протеаз. Факторы роста TGF-β-семейства характеризуются обычным распределением остатков цистеина, обнаруживаемым в зрелом районе, которое, по-видимому, образуется во всех членах этого семейства; это жесткая внутримолекулярная структура, известная как «цистеиновый узел», которая состоит из шести остатков Cys, образующих три характерных дисульфидных мостика в мономере члена TGF-β-семейства (Daopin et al., 1993; Schlunegger and Grutter, 1992 and 1993; Griffith et al., 1996; Scheufler et al., 1999). Большинство членов TGF-β-семейства имеют консервативный седьмой остаток Cys, который является ответственным за ковалентную гомодимеризацию двух идентичных мономеров (гомодимеры) или за гетеродимеризацию конкретного члена TGF-β-семейства с другим отличающимся членом этого семейства (гетеродимеры).

В мышах GDF-9 экспрессируется в яйцеклетках из первичной стадии фолликулярного развития до овуляции (McGrath et al., 1995; Laitinen et al., 1998). С использованием мышиной последовательности GDF-9 в качестве тест-последовательности для поисков в базах данных авторы изобретения идентифицировали кДНК GDF-9-подобной маркерной экспрессируемой последовательности (EST), полученной из библиотеки 2-клеточного мышиного эмбриона (Laitinen et al., 1998). Авторы показали, что транскрипт этого нового фактора, GDF-9В, который является на 55% гомологичным GDF-9, экспрессируется в яйцеклетках мышиного яичника одновременно с GDF-9 (Laitinen et al., 1998). С использованием ПЦР и праймеров, произведенных из мышиной EST-последовательности, авторы данного изобретения амплифицировали фрагмент соответствующего гена из геномной ДНК человека, картировали этот генный локус относительно хромосомы Хр11.2 и расшифровали структуру гена GDF-9В человека из выделенных космидных клонов (Aaltonen et al., 1999). Интересно, что в яичнике человека экспрессия мРНК GDF-9 начинается в первичных фолликулах несколько раньше, чем экспрессия мРНК GDF-9В (Aaltonen et al., 1999). Мышиный и человеческий гены GDF-9В клонировали, и белок, кодируемый этим геном, был назван также костным морфогенетическим белком 15 (ВМР-15) (Dube et al., 1998).

По-видимому, GDF-9 является существенным для яичникового фолликулогенеза. Из литературы известно, что GDF-9-дефицитные мыши (GDF-9 -/-) являются бесплодными вследствие раннего прекращения фолликулогенеза (Dong et al., 1996). В яичниках GDF-9 -/- фолликулогенез останавливается на стадии первичных фолликулов, когда яйцеклетка окружает один слой кубоидальных клеток гранулезы (зернистой оболочки фолликулов яичника). Даже хотя эта яйцеклетка продолжает расти, клетки гранулезы не могут пролиферировать и никакая дифференцировка текальных клеток не связана с увеличением фолликулов.

Ген плодовитости Inverdale (FecX¹) был идентифицирован как основной ген, влияющий на плодовитость овец стада Romney (Davis et al., 1991). Сегрегационные анализы определили, что этот ген находится на Х-хромосоме и что овцы (матки), несущие единственную копию этого гена (I/+), имеют размер приплода (помета) приблизительно на 0,6 ягнят больше, чем не несущие этого гена овцы (+/+). Увеличение в числе родившихся ягнят непосредственно связано с измененным характером фолликулярного развития и увеличением частоты овуляции до более высокой, чем в диком типе (˜1,0). (Shackell et al., 1993; Davis et al., 1991). В противоположность этому гомозиготные овцы-носители этого гена, имеющие две копии этого гена (I/I), являются бесплодными вследствие состояния яичниковой недостаточности (Davis et al., 1992). В яичниках овцы (I/I) фолликулогенез останавливается на первичной фолликулярной стадии, и этот фенотип не является несходным с фенотипом, наблюдаемым у GDF-9 (-/-) мышей (Braw-Tal et al., 1993; McNatty et al., 1995; Smith et al., 1997).

Было показано, что второе плодовитое стадо Romney (Hanna, 1995), без известной связи со стадом Inverdale, также несет Х-сцепленную мутацию с фенотипом, сходным с фенотипом Inverdale. Доказательство, что животные Hanna несли мутацию (FecX^H) в том же самом гене, что и Inverdale, было получено, когда были получены бесплодные самки в результате спаривания несущих ген Inverdale баранов с несущими ген Hanna овцами (Davis et al., 1995). Линия Hanna поддерживалась в исследовательском центре Invermay AgResearch Centre в виде отдельной группы вместе с линией Inverdale.

В заявке на выдачу патента Новой Зеландии №500844 авторы данного изобретения идентифицировали в овце Inverdale нуклеотидную замену за сайтом процессинга зрелого пептида гена GDF-9В, которая превращает кодон GTC (аминокислоты валина (V)) в GAC (аспарагиновой кислоты (D)). Авторы показали также, что в овце Hanna нуклеотид С за сайтом процессинга зрелого пептида превращен в Т. Это превращает кодон CAG (кодирующий глутамин (Q)) в кодон TAG (кодирующий терминацию), что приводит к укороченному зрелому белку. Предполагается, что эти соответствующие мутации в Inverdale и Hanna являются причинами "полосатых" яичников и неовуляционных состояний в гомозиготных овцах Inverdale и Hanna и потомстве овец Inverdale, спаренных с овцами Hanna.

Ранее было показано, что мыши GDF-9 -/- являются бесплодными, что указывало на то, что GDF-9 является важным для нормальной фертильности у некоторых животных. Однако, благодаря обнаружению родственного специфического для яйцеклетки фактора GDF-9В авторами данного изобретения были сделаны несколько новых открытий в поддержку точки зрения, что: (1) GDF-9В является существенным для нормального фолликулогенеза в некоторых млекопитающих; (2) что GDF-9В является критически важным для определения частоты овуляции в некоторых млекопитающих и, (3) поскольку GDF-9 и GDF-9В коэкспрессируются яйцеклетками, они функционируют совместно для усиления как фолликулярного развития, так и частоты овуляции. Вместе эти новые гипотезы стали возможными только после обнаружения авторами данного изобретения мутаций Inverdale и Hanna GDF-9В в овцах.

Авторы изобретения впервые определили полную генную структуру овечьего гена GDF-9В, кодирующего белок дикого типа, и показали, что он является необходимым для поддержания нормального яичникового фолликулогенеза в овцах. Авторы данного изобретения идентифицировали также полную генную структуру вариантов GDF-9В в овцах Inverdale и Hanna, которые обусловливают более высокие, чем нормальные, частоты овуляции в гетерозиготных животных и бесплодие в гомозиготных животных. Данное изобретение в широком смысле относится к полноразмерным последовательностям GDF-9В дикого типа и мутированным последовательностям GDF-9В и их вариантам и их применению в модуляции фертильности млекопитающих.

Все ссылки, в том числе патенты и заявки на патент, цитированные в данном описании, тем самым включены в качестве ссылки. Не предполагается, что какая-либо ссылка представляет собой прототип данного изобретения. Обсуждение этих ссылок показывает, что утверждают их авторы, а авторы данного изобретения (заявители) сохраняют за собой право оспаривать точность и уместность цитированных документов. Следует ясно понимать, что, хотя ряд публикаций предыдущего уровня цитируется здесь, эта ссылка не является признанием того, что любой из этих документов образует часть обычного общего уровня знаний в данной области, в Новой Зеландии или в любой другой стране.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, в первом аспекте данное изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты GDF-9В дикого типа, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

а) SEQ ID NO:1;

b) последовательности, способной гибридизоваться в жестких условиях с молекулой в (а);

с) последовательности, которая является функциональным вариантом или фрагментом молекулы в (а);

d) последовательности, комплементарной молекуле, определенной в (а), (b) или (с); и

е) антисмысловой последовательности, соответствующей любой из молекул в (а)-(d).

Во втором аспекте данное изобретение относится к выделенной молекуле полноразмерной мутированной нуклеиновой кислоты GDF-9В, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

а) SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:5;

b) последовательности, способной гибридизоваться в жестких условиях с молекулой (молекулами) в (а);

с) последовательности, которая является функциональным вариантом или фрагментом молекулы (молекул) в (а);

d) последовательности, комплементарной молекуле (молекулам), определенной (определенным) в (а), (b) или (с); и

е) антисмысловой последовательности, соответствующей любой из молекул в (а)-(d).

Молекулой нуклеиновой кислоты может быть молекула РНК, кРНК, геномной ДНК или кДНК, и она может быть одноцепочечной или двухцепочечной. Эта молекула нуклеиновой кислоты может необязательно содержать одно или несколько синтетических, неприродных или измененных нуклеотидных оснований или их комбинации.

В третьем аспекте данное изобретение относится к выделенному полноразмерному полипептиду GDF-9В, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

а) SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6 и

b) функционального варианта или фрагмента последовательности (последовательностей) в (а).

В четвертом варианте данное изобретение относится к гомодимерному зрелому полипептиду GDF-9В, имеющему субъединицы, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:2 или функционального фрагмента или варианта указанной последовательности.

В пятом аспекте данное изобретение относится к гетеродимерному полипептиду, имеющему субъединицы, выбранные из группы, состоящей из:

а) зрелого полипептида GDF-9В, содержащего аминокислотную последовательность, произведенную из SEQ ID NO:2, или функционального фрагмента или варианта указанной последовательности; и

b) зрелого полипептида GDF-9 или его функциональных вариантов или фрагментов.

Данное изобретение относится дополнительно в шестом аспекте к способу экспрессии биологически активного процессированного гомодимерного полипептида GDF-9В, предусматривающему стадии:

а) создания экспрессирующей конструкции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1 или функционального фрагмента или варианта указанной последовательности этой группы;

b) трансфицирования подходящих клеток-хозяев указанной конструкцией;

с) отбора стабильных клонов и

d) выделения и очистки экспрессированного полипептида.

В седьмом варианте данное изобретение относится к способу экспрессии биологически активных процессированных гетеродимерных полипептидов GDF-9В и GDF-9, предусматривающему стадии:

а) создания экспрессирующей конструкции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую:

i) последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO:1 или функционального фрагмента или варианта указанной последовательности; и

ii) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую GDF-9, или ее функциональный фрагмент или вариант;

b) трансфицирования подходящих клеток указанной конструкцией;

с) отбора стабильных клонов и

d) выделения и очистки экспрессированного полипептида.

Предпочтительно, трансфицироваными клетками являются клетки позвоночных животных, однако предполагается также применение других типов клеток.

Последовательности нуклеиновой кислоты и белка GDF-9 доступны в публичных базах данных, таких как GENbank и SWISS-PROT. Номер доступа для нуклеиновой кислоты GDF-9 овцы - AFO78545, а для белка - ААС28089.

Данное изобретение относится также к рекомбинантным экспрессирующим векторам, которые содержат молекулу ДНК данного изобретения или ее функциональный вариант, и хозяевам, трансформированным вектором данного изобретения, способных экспрессировать полипептид данного изобретения.

Дополнительный аспект данного изобретения относится к лиганду, который связывается с полипептидом данного изобретения. Наиболее обычно, лигандом является антитело. Должно быть понятно, что термин "антитело" включает в себя фрагменты или аналоги антител, которые сохраняют способность связываться с полипептидом данного изобретения, в том числе, но не только, фрагменты Fv, F(ab)₂, молекулы ScFv и т.п. Антитело может быть поликлональным или моноклональным, но является предпочтительно моноклональным. В некоторых вариантах лигандом может быть молекула фагового дисплея, генерируемая против полипептидов данного изобретения, одиночный рецептор поверхности клетки или комплексный рецептор поверхности клетки. Этот полипептид или пептид может присутствовать в виде мономера, димера, гетеродимера, мультимера или их варианта.

В восьмом аспекте данное изобретение относится к способу оценки активности гомодимеров GDF-9В и/или гетеродимеров GDF-9В/GDF-9, предусматривающему стадии:

а) добавления эффективного количества гомодимерного полипептида GDF-9В; и/или гетеродимерного полипептида GDF-9В/GDF-9 к культуре клеток или органа яичника с другими факторами роста яичника, такими как IGF-1 и/или другие члены надсемейства трансформирующих факторов роста (например, активин, ВМР2, TGFβ1), или без них; и

b) проведения биоанализа на указанной культуре клеток или органа для оценки биологической активности указанных гомодимерных или гетеродимерных полипептидов.

В девятом аспекте данное изобретение относится к моделям трансгенных животных, применимым для демонстрации действия системного продуцирования гомодимеров GDF-9В и гетеродимеров GDF-9В/GDF-9 на рост фолликулов.

В десятом аспекте данное изобретение относится к способу адреновирусного, ретровирусного и альфавирусного переноса экспрессионных кассет GDF-9В или экспрессионных кассет GDF-9 в клетки или организмы хозяина для выполнения посредством этого экспрессии in vivo гомодимеров GDF-9В или гетеродимеров GDF-9В/GDF-9, предусматривающему стадию переноса в культуру реципиентной клетки, культуру органа или в реципиентное животное рекомбинантного аденовируса, включающего в себя экспрессионную кассету, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:1 или функционального фрагмента или варианта указанной последовательности, причем указанная молекула нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи с регуляторной последовательностью экспрессии.

В одиннадцатом аспекте данное изобретение относится к применению агента, выбранного из группы, состоящей из:

а) гомодимерного полипептида, имеющего субъединицы, содержащие GDF-9В или его функциональный фрагмент или вариант, с гомодимерным полипептидом, имеющим субъединицы, содержащие полипептид GDF-9 или его функциональный фрагмент или вариант, или без него;

b) гетеродимерного полипептида, имеющего субъединицы, содержащие полипептиды GDF-9В и GDF-9, или функциональные фрагменты или варианты указанных полипептидов GDF-9В или GDF-9;

вместе с (или без них) дополнительными гонадотропинами (например, FSH и/или LH) и/или другими факторами роста яичников, такими как IGF-1, kit-лиганд (фактор стволовых клеток), эпидермальный фактор роста или член надсемейства TGFβ (т.е. агонистами или антагонистами) для

1) изменения фолликулярного роста в яичниках млекопитающего или другого позвоночного животного либо in vivo, либо in vitro; или

2) изменения роста/созревания выделенных клеток яичника in vitro (например, яйцеклетки - клеток кумулюса (яйцевого бугорка в полости яичникового фолликула, в которой заключено яйцо) и/или клеток гранулезы)).

В двенадцатом аспекте данное изобретение относится к композиции, содержащей эффективное количество агента, выбранного из группы, состоящей из:

а) гомодимерного полипептида, имеющего субъединицы, содержащие полипептид GDF-9В или его функциональный фрагмент или вариант, с гомодимерным полипептидом, имеющим субъединицы, содержащие полипептид GDF-9 или его функциональный фрагмент или вариант, или без него;

b) гетеродимерного полипептида, имеющего субъединицы, содержащие полипептиды GDF-9В и GDF-9, или функциональные фрагменты или варианты указанных полипептидов GDF-9В или GDF-9;

вместе с фармацевтически или ветеринарно приемлемым носителем (в том числе адъювантами) или разбавителем; и необязательно включающая в себя дополнительно гонадотропины и/или другие релевантные агонисты/антагонисты факторов роста яичников.

В тринадцатом аспекте данное изобретение относится к способу изменения роста яичниковых фолликулов у самки млекопитающего или самки другого позвоночного животного in vivo, причем указанный способ предусматривает стадию трансформации клеток-хозяев яичника млекопитающего и другого позвоночного животного экспрессионными кассетами GDF-9В и GDF-9 для обеспечения возможности сверхэкспрессии гомодимеров GDF-9В и гетеродимеров GDF-9В/GDF-9.

В четырнадцатом аспекте данное изобретение относится к способу изменения роста яичниковых фолликулов у самки млекопитающего или самки другого позвоночного животного in vitro, причем указанный способ предусматривает стадию трансформации клеток-хозяев яичника млекопитающего и другого позвоночного животного экспрессионными кассетами GDF-9В и GDF-9 для обеспечения возможности сверхэкспрессии гомодимеров GDF-9В и гетеродимеров GDF-9В/GDF-9.

Согласно следующему аспекту данное изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13 и SEQ ID NO:15 или функционального фрагмента или варианта указанной последовательности.

Согласно следующему аспекту данное изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:12 и SEQ ID NO:16 или функционального фрагмента или варианта указанной последовательности.

Согласно другому аспекту данное изобретение относится к способу изменения фолликулярного роста, предусматривающему стадию введения лиганда, заявленного в любом из пунктов 9-15, для:

i) изменения фолликулярного роста в яичниках млекопитающего или другого позвоночного либо in vivo, либо in vitro; или

ii) изменения роста/созревания выделенных клеток яичника in vitro.

Предпочтительно, указанное млекопитающее выбрано из группы, состоящей из овец, крупного рогатого скота, коз, оленей, свиней, людей, лошадей, верблюдов и поссумов, кошек и собак и любых других коммерчески важных видов, имеющих ген GDF-9В, обладающий существенной идентичностью с последовательностями GDF-9В данного изобретения. Указанное позвоночное животное предпочтительно выбрано из группы, состоящей из кур, уток, гусей, лососевых и любых других коммерчески важных видов, имеющих ген GDF-9В, обладающий существенной идентичностью с последовательностями GDF-9В данного изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

В частности, предпочтительные аспекты данного изобретения будут описаны в связи с прилагаемыми чертежами, в которых:

Фигура 1 показывает нуклеотидную последовательность GDF-9В дикого типа овцы.

Фигура 2 показывает часть нуклеотидной последовательности фигуры 1 и иллюстрирует мутацию Inverdale.

Фигура 3 показывает часть нуклеотидной последовательности фигуры 1 и иллюстрирует мутацию Hanna.

Фигура 4 показывает расшифрованную аминокислотную последовательность GDF-9В дикого типа овцы.

Фигура 5 показывает часть аминокислотной последовательности фигуры 1 и иллюстрирует мутацию Inverdale.

Фигура 6 показывает аминокислотную последовательность фигуры 1 и иллюстрирует мутацию Hanna.

Фигура 7 показывает полиморфизм сигнальных последовательностей для GDF-9В овцы.

Фигура 8 показывает дополнительный кодон ATG против хода транскрипции, присутствующий у овцы.

Фигура 9 показывает микрофотографию, иллюстрирующую локализацию GDF-9В в яйцеклетке.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как обсуждалось выше, первичным предметом данного изобретения является модуляция фоллликулярного роста яичников через активность гомодимеров GDF-9В и гетеродимеров GDF-9В/GDF-9 in vivo и in vitro.

Термин "выделенные" означает по существу выделенные или очищенные от загрязняющих последовательностей в клетке или организме, в которой данная нуклеиновая кислота природно встречается, и включает в себя нуклеиновые кислоты, очищенные стандартными способами очистки, а также нуклеиновые кислоты, полученные рекомбинантной технологией, в том числе технологией ПЦР, и нуклеиновые кислоты, синтезированные химически.

Предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1 является выделенной из геномной ДНК овцы, а молекула нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:5 является выделенной из ДНК овцы, экспрессирующей фенотип Inverdale или Hanna.

Отмечалось, что может встречаться полиморфизм в сигнальном пептиде GDF-9В овцы (SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8). Предсказанная сигнальная последовательность имеет, по-видимому, длину около 25 аминокислот, как предсказано программой Signal P (Signal P VI.1 server в http://genom.cbs.dtu.dk/services/SignalP) (Neilsen et al., 1997) от ATG (Met) до ACA (Thr) в SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8. Делеция из 3 пар оснований наблюдается в некоторых овцах, где не присутствует одна из двух последовательностей СТТ. Таким образом, некоторые овцы имеют более короткую сигнальную последовательность, хотя большинство овец имеют полную длину этой последовательности. Из исследований овец Hanna, гибридов Hanna х Inverdale, овец Inverdale и дикого типа, родственного или неродственного Inverdale или Hanna, большинство были гомозиготными в отношении двух СТТ, хотя некоторые были гетерозиготными в отношении одного СТТ. Было обнаружено, что преобладание более короткого варианта сигнального пептида является более высоким в породе мериносовых овец, но низким в породах Romney, что указывает на то, что полиморфизм может быть связан с породой. Большинство овец Romney несли более длинную сигнальную последовательность независимо от их статуса в отношении Inverdale или Hanna. Хотя этот полиморфизм должен быть признан, он не влияет на формулу изобретения и не модифицирует формулу изобретения данного изобретения.

Также отмечалось, что дополнительный стартовый кодон ATG в рамке считывания присутствует в геномной последовательности ДНК овцы на 27 нуклеотидов слева от стартового кодона ATG GDF-9В (SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10). Эта последовательность присутствует во всех использованных для секвенирования овцах, несущих ген дикого типа, Inverdale или Hanna, и является явно независимой от мутаций Inverdale и Hanna. Неизвестно, используется ли этот левый стартовый кодон во время трансляции белка в овцах (SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10). Если он используется, это должно было бы приводить к сигнальной последовательности из дополнительных 9 аминокислот. Такое различие между белками GDF-9В овец и других млекопитающих вряд ли влияло бы на функцию зрелого белка, так как эта часть данной молекулы отщепляется в активном зрелом GDF-9В, но авторы упоминают эту возможность альтернативного стартового сайта трансляции, который может присутствовать в гене овцы. Программа предсказания сигнальных пептидов (Neilsen et al., 1997) показывает, что эта дополнительная аминокислотная последовательность из 9 аминокислот может функционировать в качестве сигнального пептида и что вероятным конечным сайтом для этого сигнального пептида была бы все еще аминокислота Thr (T), указанная в SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8.

В следующем аспекте данное изобретение относится к выделенному полипептиду, выбранному из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:6 или их функционального варианта, который функционирует для манипуляции фолликулярного роста яичников у самки млекопитающего.

Этот полипептид может быть получен экспрессией подходящего вектора, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты данного изобретения или ее функциональный вариант, в подходящей клетке-хозяине, как будет понятно специалисту в данной области.

Термин "вариант" в применении здесь относится к нуклеотидным и полипептидным последовательностям, причем эта нуклеотидная или аминокислотная последовательность проявляет приблизительно 50%-ную или более высокую гомологию с нуклеотидной или аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1-6, соответственно, предпочтительно 75%-ную гомологию и наиболее предпочтительно 90-95%-ную гомологию с последовательностями данного изобретения: при условии, что указанный вариант имеет определенную здесь биологическую активность. Этот вариант может быть получен модификацией нативной нуклеотидной или аминокислотной последовательности посредством таких модификаций, как инсерция, замена или делеция одного или нескольких нуклеотидов или аминокислот, или может быть встречающимся в природе вариантом. Термин "вариант" включает в себя также гомологичные последовательности, которые гибридизуются с последовательностями данного изобретения в стандартных или предпочтительно жестких условиях гибридизации, известных специалистам в данной области. Примеры обычно используемой процедуры in situ гибридизации описаны в Tisdal et al., 1999; Juengel et al., 2000. Если желателен такой вариант, нуклеотидную последовательность нативной ДНК изменяют подходящим образом. Это изменение может выполняться селективным синтезом ДНК или модификацией нативной ДНК, например, при помощи сайт-специфического или кассетного мутагенеза. Предпочтительно, если части кДНК или геномной ДНК требуют модификаций последовательности, используют управляемый сайт-специфическим праймером мутагенез с применением стандартных способов, известных в данной области.

Термин «фрагмент» нуклеиновой кислоты обозначает часть нуклеиновой кислоты, которая меньше, чем полная длина, и содержит по меньшей мере минимальную последовательность, способную гибридизоваться специфически с молекулой нуклеиновой кислоты данного изобретения или комплементарной ей последовательностью в жестких условиях, определенных ниже. «Фрагмент» полипептида является частью полипептида, которая меньше, чем полная длина, но которая все еще сохраняет биологическую активность, определенную здесь.

Термин «биологически активный» относится к полипептиду данного изобретения, который способен индуцировать измеряемый физиологический эффект в яичнике или клетке яичника млекопитающего или другого позвоночного животного. Физиологические эффекты могут измеряться такими анализами, как включение меченного тритием тимидина в клетки гранулезы. Примером такого анализа является анализ, в котором фолликулы (с диаметром 1-2,5 мм) иссекают из стромы яичника и клетки гранулезы выделяют из комплексов теки и кумулюса яйцеклеток. Эти клетки промывают и ресуспендируют в свежей среде в конечной концентрации для биоанализа 100000 жизнеспособных клеток на лунку и инкубируют с полипептидом или без полипептида в течение 48 часов. В это время измеряют включение меченного тритием тимидина.

Термин "белок (или полипептид)" относится к белку, кодируемому молекулой нуклеиновой кислоты данного изобретения, в том числе фрагментам, мутациям и гомологам, имеющим ту же самую биологическую активность, т.е. активность манипуляции овуляции. Полипептид данного изобретения может быть выделенным из природного источника, полученным экспрессией рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты или может быть химически синтезированным.

Термин "лиганд" относится к любой молекуле, которая может связываться с другой молекулой, такой как полипептиды или пептид, и включает в себя, но не ограничивается ими, антитела, рецепторы поверхности клеток или молекулы фагового дисплея.

Кроме того, нуклеотиды и пептиды, имеющие существенную идентичность относительно нуклеотидных и аминокислотных последовательностей данного изобретения, могут также использоваться в предпочтительных вариантах. Здесь термин "существенная идентичность" означает, что две последовательности, при оптимальном сопоставлении, например, при помощи программ GAP или BESTFIT (пептиды) с использованием статистических весов пропуска по умолчанию или при измерении при помощи компьютерных алгоритмов BLASTX или BLASTP, имеют по меньшей мере 50%, предпочтительно 75% или наиболее предпочтительно 90-95% идентичность последовательности. Предпочтительно, положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. Например, замена аминокислот, имеющих сходные химические свойства, такие как заряд или полярность, вряд ли будут влиять на свойства белка. Неограничивающие примеры включают в себя глутамин вместо аспарагина или глутаминовую кислоту вместо аспарагиновой кислоты.

В следующем аспекте данное изобретение обеспечивает реплицируемые векторы-переносчики, пригодные для применения в получении полипептида или пептида данного изобретения. Эти векторы могут быть сконструированы в соответствии со способами, хорошо известными в данной области, или могут быть выбраны из клонирующих векторов, доступных в данной области.

Клонирующий вектор может быть выбран в соответствии с используемым хозяином или клеткой-хозяином. Применимые векторы обычно будут иметь следующие характеристики:

(а) способность к саморепликации;

(b) обладание единственной мишенью для любой конкретной рестрикционной эндонуклеазы (рестриктазы) и

(с) желательно, если они несут гены для легко селектируемого маркера, например, устойчивости к антибиотику.

Двумя основными типами векторов, обладающих этими характеристиками, являются плазмиды и бактериальные вирусы (бактериофаги или фаги). Предпочтительными в настоящее время векторами являются бактериальные векторы, векторы насекомых или векторы млекопитающих и они могут включать в себя: серии pUC, pBlueScript, pGEM, pGEX, pBK-CMV, lambda ZAP, lambda GEM, pEFIRES-P, pUB6/V5/His, pBC1, pADTrack-CMV, pAdenovator, pAdEasy-1, pSFV-PD, pCA3, pBABE, pPIC9, pA0815, pET и pSP. Однако этот список не должен рассматриваться как ограничение рамок данного изобретения.

Примерами предпочтительных экспрессирующих систем являются следующие:

1. Для системы клеточной экспрессии in vitro может быть использована система клеток 293Т с вектором pEFIRES-P (Hobbs S et al., 1998), которая придает устойчивость к пуромицину. Для коэкспрессии двух генов вышеуказанный вектор может быть модифицирован для изменения гена устойчивости к антибиотику на ген устойчивости к блеомицину. Альтернативно, коэкспрессия двух генов и отбор гена могут быть достигнуты конструированием трехцистронного экспрессирующего вектора. Может быть также использована соответствующая стабильно трансфицируемая система клеток насекомых, например, система клеток S2, использующая «DES»-векторную экспрессирующую систему; www.invitrogen.com.

2. Что касается экспрессии GDF во всех тканях трансгенных животных, один из подходов состоит в применении вектора pUB6/V5-His A (www.invitrogen.com.) для получения конструкций.

Для тканеспецифической экспрессии крысиный промотор PEPCK 0,6 т.п.н. для экспрессии в печени и почках может быть включен в конструкцию посредством замены промотора Ubi-C в векторе pUB6/V5-His A промотором PEPCK. Для экспрессии GDF в ткани млекопитающего могла бы быть предпочтительной другая промоторная система. Для этой ткани одним из подходов могло бы быть применение промотора гена бычьего β-лактоглобулина и/или бычьего промотора α S1 казеина (например, вектора рВС1, www.invitrogen.com.) для регуляции экспрессии GDF в молоко. Для глобальной сверхэкспрессии в трансгенных животных может быть использован также CMV-усиленный промотор β-актина (Okabe M, et al., FEBS Letters 407: 313-319, 1997) или модифицированный α-промотор EF1 (Taboit-Dameron F, et al., Transgenic Research 8: 223-235, 1998).

Другими подходящими экспрессионными системами млекопитающих являются аденовирусы, ретровирусы и альфавирусы. Типичным подходом для специалистов в данной области является подход, описанный (ТС Не et al., 1998). Что касается экспрессии GDF, вектор pAd Track-CMV или векторы pAdenovator (www.qbiogene.com) могут быть использованы для приготовления конструкции, которую затем котрансформируют с аденовирусной плазмидой pAd Easy-1 в E. coli для получения рекомбинантного аденовирусного генома, который содержит запускаемую CMV-промотором экспрессионную кассету GDF. Затем этот рекомбинантный аденовирусный геном трансфицируют в клетки 293Т для получения исходного вируса. Альтернативные способы для генерирования аденовирусов могут быть также использованы для той же самой цели (например, перенос генов на основе плазмиды PCA3 (www.microbix.com); или способ COS-TPC (Miyake S et al., 1996).

3. Нецитопатогенные вирусы лесов Семлики, экспрессирующие GDF, могут быть получены с использованием, например, векторов pSFV-PD, как описано Lundstrom et al., Histochem Cell Biol 115: 83-91, 2001. Кроме того, ретровирусные системы экспрессии на основе, например, векторов рВАВЕ могут быть использованы для экспрессии GDF в клетках млекопитающих (Morgenstern, JP and Land, H, 1990; Nucleic Acids Res 18: 3587-3596).

4. Другой хорошо установленной экспрессионной системой для специалистов в данной области являются дрожжевые клетки (C Hadfield, et al., 1993); (MA Romanos et al., 1992). Например, вектор рРIC9 (www.invitrogen.com.) может быть использован в Pichia pastoris для экспрессии GDF. Для коэкспрессии двух генов предпочтительным кандидатом является вектор рА0815 (www.invitrogen.com).

5. Escherichia coli (E.coli) является стандартной лабораторной системой экспрессии, широко распространенной в данной области. Например, система экспрессии с рЕТ (www.novagen.com) может быть использована для экспрессии рекомбинантных GDF-9 и GDF-9В млекопитающих (steve.lawrence@agresearch.co.nz).

Молекулы ДНК данного изобретения могут быть экспрессированы помещением их в функциональную связь с подходящими регуляторными последовательностями в реплицируемом экспрессирующем векторе. Регуляторные последовательности могут включать в себя точки начала репликации, промотор, энхансер и последовательности терминации транскрипции, среди прочих элементов. Выбор регуляторной последовательности для включения в экспрессирующий вектор зависит от типа хозяина или клетки-хозяина, предназначенных для применения для экспрессии этой ДНК, как будет понятно специалисту в данной области.

Экспрессирующие векторы, применимые в данном изобретении, могут содержать по меньшей мере одну регуляторную последовательность экспрессии, которая функционально связана с экспрессируемой ДНК-последовательностью или ее фрагментом. Регуляторную последовательность инсертируют в вектор для контроля и регуляции экспрессии клонированной ДНК-последовательности. Примерами применимых регуляторных последовательностей экспрессии являются lac-система, trp-система, tac-система, trc-система, основные районы оператора и промотора фага лямбда, гликолитические промоторы дрожжевой кислой фосфатазы, например, Pho5, промоторы факторов альфа-сп