Мутантный штамм вируса гепатита в и его применение

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к биотехнологии и может найти применение в медицине. В изобретении описывается изолированный штамм вируса гепатита В человека «S»-133 Оон, геном которого относится к подтипу adr, депонирован в Европейской коллекции клеточных культур под №№ Р97121504, или Р97121505, или Р 97121506, и кодирует полипептид основного поверхностного антигена вируса гепатита В человека. Упомянутый антиген имеет мутацию в аминокислотной последовательности (полипептид), а именно в 133 положении метионин заменен на треонин. Раскрыты варианты изолированных нуклеиновых кислот, кодирующих мутированный полипептид, и варианты изолированных нуклеиновых кислот, кодирующих пептиды с антигенными свойствами указанного полипептида. В тексте описания приведены нуклеотидные последовательности вариантов нуклеиновых кислот (НК), кодирующих упомянутый полипептид и пептиды. Описаны также варианты векторов для клонирования фрагментов ДНК мутантного вируса гепатита В человека, включающие соответственно изолированную НК и изолированную НК, функционально связанную с промотором транскрипции РНК, где каждая из изолированных НК кодирует указанный полипептид. Раскрыты способы продуцирования полипептида и пептида и способы получения очищенного полипептида и пептида с использованием указанных векторов. Описаны соответствующие очищенные полипептиды и пептиды мутированного антигена, сохраняющие антигенные свойства полипептидов природного вируса гепатита В человека, и способы получения антител к ним и анти-антитела, в том числе моноклональные антитела. Раскрыты также различные способы применения упомянутых изолированных НК, полипептидов и пептидов с целью диагностики и лечения заболеваний, связанных с вирусом гепатита В человека. Использование изобретения позволяет разрабатывать схемы диагностики и лечения заболеваний, связанных с мутированным вирусом гепатита В человека. 34 н. и 32 з.п. ф-лы, 2 ил.

Реферат

Различные ссылки, проходящие по всему этому описанию, заключены в круглые скобки. Раскрытия этих публикаций в их полноте включено в настоящее описание в виде ссылок для более подробного описания того положения в данной технологии, к которому относится настоящее изобретение.

Предпосылки настоящего изобретения

Настоящее изобретение касается генома вируса гепатита В, выделенного из гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) и имеющего мутацию (метионина в треонин) у 133 аминокислотного остатка в пределах основного поверхностного антигена, его нуклеотидной последовательности, а также логически установленных четырех основных последовательностей белков, антигена, антитела, систем их обнаружения, разработки эффективных вакцин и антивирусных средств.

Гепатоцеллюлярная карцинома представляет собой один из наиболее распространенных видов рака печени человека, в особенности в Азии, где ежегодно выявляется 70% новых случаев этого заболевания. Обычно оно возникает при циррозе печени как осложнение хронического заболевания печени. Клинические проявления ГЦК неспецифичны, причем его признаки и симптомы появляются лишь на более поздних стадиях этого ракового заболевания.

Одним из основных случаев хронических заболеваний печени является инфекция гепатита В. Впервые открытый в 1963 году как человеческий вирус, который передается парентерально, вирусная инфекция хронического гепатита В обычно наиболее вовлечена в невыявляемый серологически патогенез ГЦК. Несмотря на тот факт, что вирус гепатита В не демонстрирует черты полного вирусного онкогена, его вовлеченность в развитие ГЦК можно отнести к различным аспектам его взаимодействия с гепатоцитными клетками хозяина. К этим аспектам относится неодинаковая транскрипционная активность белка вируса, имеющего наименьшие размеры, а именно - Х-белка, которая способствует экспрессии многих клеточных генов-мишеней, включая протоонкогены. С другой стороны, у пациентов с ГЦК в хромосомах клеток хозяина регулярно обнаруживается ДНК вируса, составляющая с ними единое целое. Существуют также доказательства того, что в развитии ГЦК активную роль играет основной поверхностный антиген. Этот белок служит основным маркером выявления носителей вируса гепатита В. Наибольшая антигенная детерминанта вируса гепатита В представляет собой хорошо сохранившуюся область, охватывающую 23 аминокислотных остатка, она располагается на основном поверхностном антигене на позициях аминокислот с номерами с 124 по 147. Эта небольшая зона, обозначенная как группа специфической детерминанты «а», была обнаружена во всех подтипах и была выделена из геномов вируса гепатита В. Предполагается, что антигенные свойства вызваны ее вероятной структурой с двойной петлей, с которой связывается поствакцинальное нейтрализующее антитело.

Наши эпидемиологические данные показывают, что основной поверхностный антиген вируса натурального типа был обнаружен у большинства пациентов с ГЦК. Более того, наблюдения показывают, что некоторые варианты этого основного поверхностного антигена от пациентов с ГЦК могут быть вовлечены в патогенез ГЦК. Непосредственное секвенирование показало, что у 24 из 63 пациентов с ГЦК (около 38%) имеются различные мутации в антигенной детерминанте «а» основного поверхностного антигена. При сочетании вируса натурального типа с другими разновидностями доля разновидностей вируса с мутацией (метибнина в треонин) у 133 аминокислотного остатка, расположенного на первой петле детерминанты «а» основного поверхностного антигена, у 63 пациентов с ГЦК (регион юго-восточная Азия) составляет 12,7%, и эта разновидность была обнаружена в 5 случаях локальной ГЦК. Однако та же самая мутация выявляется только у 2% носителей вируса гепатита В из случайной выборки населения (более 100 случаев). Важность указанной разновидности с мутацией у 133 аминокислотного остатка усиливает тот факт, что доля разновидностей вируса с мутацией у 145 аминокислотного остатка (глицина в аргинин), лучше известная как поствакцинальный мутант и расположенная на второй петле указанной антигенной детерминанты «а», остается постоянной у 8% носителей вируса гепатита В из случайной выборки населения.

Хотя этот вариант штамма вируса гепатита В, несущий мутацию у 133 аминокислотного остатка (метионина в треонин) основного поверхностного антигена, может возникнуть у пациентов с ГЦК по-иному, чем в поствакцинальных вариантах (т.е. с мутацией у 145 аминокислотного остатка основного поверхностного антигена), эти штаммы имеют сходные характеристики. Они заключаются в том, что оба штамма стабильны, имеются сведения об их вертикальной трансмиссии, несмотря на то что эффективно используется профилактика вируса гепатита В и иммуноглобулин гепатита В (HBIG).

Рассматривается появление варианта вируса гепатита В, несущего мутации в антигенной детерминанте «а» основного поверхностного антигена в случае ГЦК. Большая доля указанных мутантных вирусов с замещением у 133 аминокислотного остатка основного поверхностного антигена представляет собой особый интерес, поскольку это может указать на непосредственную связь с патогенезом ГЦК. Эта взаимосвязь потребует неотложную разработку специфических систем выявления наряду с разработкой эффективных профилактических вакцин и противовирусных средств. Определение нуклеотидной последовательности в этом мутантном вирусе представляет собой первый шаг в достижении этих целей и будет определенно полезным для разработки указанных выше диагностических схем и схем лечения.

Краткое содержание настоящего изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает изолированный штамм вируса гепатита В, обозначенный как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионин заменен на треонин), составная часть которого - геном вируса - был депонирован Европейской коллекцией клеточных культур 15 декабря 1997 года под инвентарными номерами Р97121501, Р97121502 и Р97121503.

Настоящим изобретением обеспечивается также изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В; причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота, занимающая позицию под номером 133 этого полипептида, представляет собой скорее треонин, чем метионин.

Это изобретение обеспечивает также способ продуцирования полипептида и способ получения указанного полипептида в очищенной форме, для того чтобы выявить очищенный полипептид, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота, занимающая позицию под номером 133 этого полипептида, представляет собой скорее треонин, чем метионин.

Настоящее изобретение обеспечивает также олигонуклеотид, включающий по меньшей мере 15 нуклеотидов, способных к специфической гибридизации только с последовательностями указанного штамма мутантного вируса гепатита В.

Это изобретение обеспечивает также способ получения антител к указанному полипептиду и продуцируемых им антител.

Настоящее изобретение обеспечивает применение описанной выше нуклеиновой кислоты, полипептида, пептида или антител, для того чтобы определить, инфицирован ли субъект описанным выше штаммом вируса.

Настоящее изобретение обеспечивает использование описанной выше нуклеиновой кислоты, полипептида, пептида или антител, для того чтобы определить, имеет ли субъект предрасположенность к гепатоцеллюлярной карциноме.

Это изобретение обеспечивает также вакцину, способную предотвратить или лечить гепатоцеллюлярную карциному, а также вакцину для лечения или предотвращения инфекции, вызванной описанным выше штаммом мутантного вируса гепатита В.

Кроме того, это изобретение обеспечивает способ идентификации химического соединения, способного лечить или предотвращать гепатоцеллюлярную карциному, а также составы, содержащие это соединение.

Настоящее изобретение обеспечивает также способ идентификации химического соединения, способного лечить или предотвратить инфекцию, вызванную определенным выше мутантным штаммом, а также составы, содержащие это соединение.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Структура четырех открытых рамок считывания генома вируса гепатита В человека, выделенного из ГЦК (имеющаяся мутация метионина в треонин у 133 аминокислотного остатка основного поверхностного антигена помечена звездочкой). Основные белки вируса, которые представляют собой: ДНК-полимеразу, большой/средний/основной поверхностный антиген, прекапсиду, капсиду и трансактивирующий Х-белок, обозначены соответственно как Р, PreS1/Pres S2/S, PreC, С.

Фиг.2. Стратегия клонирования и секвенирование того же генома вируса гепатита В.

Подробное описание настоящего изобретения

По всему настоящему описанию делаются ссылки на специфические нуклеотиды, эти ссылки относятся к нуклеотидам, присутствующим в кодирующей цепи нуклеиновой кислоты. Для обозначений специфических нуклеотидов в описании используется следующая стандартная аббревиатура:

Ц = цитозинА = аденозин
Т = тимидинГ = гуанозин

Настоящее изобретение обеспечивает нуклеотидную последовательность генома вируса гепатита В, выделенного из гепатоцеллялярной карциномы (ГЦК) и имеющего мутацию (метионина в треонин) у 133 аминокислотного остатка основного поверхностного антигена, содержащего 3215 нуклеотидов (рис.4), которая кодирует 4 перекрывающиеся последовательности белка вируса, изображенные на рис.4-7.

Изобретение обеспечивает последовательности аминокислот четырех основных белков вируса, которые включают: ДНК-полимеразу, большой/средний/основной поверхностный антиген, капсиду и трансактивирующий Х-белок. Эти белки могут быть продуцированы по рекомбинантной технологии и использованы при разработке поликлональных или моноклональных антител.

Настоящее изобретение обеспечивает также систему диагностики вируса гепатита В, специфическую для мутации (метионина в треонин) у 133 аминокислотного остатка основного поверхностного антигена, в которой используются описанные выше последовательности нуклеотидов или последовательности белков, или антитела.

Настоящее изобретение обеспечивает изолированный штамм вируса гепатита В, обозначенный как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионин заменен на треонин), составная часть которого - геном вируса - был депонирован под инвентарными номерами Р97121501, Р97121502 и Р97121503.

Настоящим изобретением обеспечивается также изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В; причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин. В специфическом воплощении настоящего изобретения указанный полипептид кодируется нуклеотидами с номерами с 155 по 835 из последовательности нуклеиновых кислот (обозначенной как последовательность I.D. No.1); на 587-589 позициях этой последовательности вместо нуклеотидов «АЦГ» находятся нуклеотиды «АТГ».

Указанная нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК или РНК, в частности кДНК или ДНК генома.

В другом воплощении настоящего изобретения указанный полипептид имеет последовательность аминокислот, в значительной степени такую же, как аминокислотные остатки с номерами с 174 по 400 из последовательности аминокислот, обозначенной как I.D. No.3.

Это изобретение обеспечивает, кроме того, изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, причем этот пептид кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотиды с номерами с 527 по 595 из последовательности I.D. No.1.

Это изобретение обеспечивает также изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, причем в последовательность аминокислот этого пептида входят аминокислотные остатки с номерами с 298 по 320 из последовательности аминокислот, обозначенной как I.D. No.3.

Настоящее изобретение обеспечивает также вектор, включающий изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота, занимающая позицию под номером 133 этого полипептида, представляет собой скорее треонин, чем метионин, и функционально связана с промотором транскрипции РНК.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает вектор, включающий изолированную нуклеиновую кислоту, которая кодирует пептид, причем этот пептид кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды с номерами с 527 по 595 из последовательности I.D. No.1.

В частности, оба упомянутые выше вектора включают вирус-специфическую ДНК.

Настоящее изобретение обеспечивает также систему «хозяин - вектор», предназначенную для продуцирования полипептида или пептида, в которую входят описанные выше вектора в подходящей клетке-хозяине.

Это изобретение обеспечивает также способ продуцирования полипептида, включающий культивирование описанной выше системы «хозяин - вектор» в подходящих для этого условиях, позволяющих продуцирование указанного полипептида или пептида и их обнаружение.

Это изобретение, кроме того, обеспечивает способ получения полипептида или пептида в очищенной форме, который включает: (а) введение любого из описанных выше векторов в подходящую клетку-хозяин; (б) культивирование полученной в результате клетки-хозяина в целях продуцирования ей указанного полипептида; (в) обнаружение полипептида, продуцированного на стадии (б); и (г) очистку обнаруженного полипептида или пептида.

Настоящее изобретение обеспечивает также очищенный полипептид, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота, занимающая позицию под номером 133 этого полипептида, представляет собой скорее треонин, чем метионин. В частности, можно получить очищенный полипептид или пептид при использовании описанных выше способов.

Это изобретение обеспечивает также очищенный пептид, причем последовательность аминокислот этого пептида включает аминокислотные остатки с номерами с 298 по 320 из последовательности аминокислот, обозначенной как I.D. No.3.

Это изобретение обеспечивает, кроме того, олигонуклеотид, содержащий по крайней мере 15 нуклеотидов, способных к специфической гибридизации с однозначно определяемой последовательностью нуклеотидов в пределах нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионинин, при условии, что отсутствует гибридизация с любой последовательностью нуклеотидов в пределах нуклеиновой кислоты, которая кодирует основный поверхностный антиген вируса натурального гепатита В. В одном из воплощений указанный олигонуклеотид содержит нуклеотиды с номерами с 527 по 595 из последовательности I.D. No.1.

Настоящее изобретение обеспечивает также состав, способный стимулировать продуцирование антител к указанному полипептиду или способствовать их продуцированию.

Это изобретение обеспечивает также способ получения антител к полипептиду, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; а не к основному поверхностному антигену вируса натурального гепатита В. Этот способ включает: (а) получение указанного полипептида в очищенной форме; (б) иммунизацию организма, способного продуцировать антитела к указанному очищенному полипептиду; (в) сбор продуцированных антител; (г) соединение продуцированных антител и указанного очищенного полипептида в условиях, приводящих к образованию комплекса; и (д) определение, какие из продуцированных антител образуют комплекс с указанным очищенным полипептидом, для того чтобы получить антитела к указанному полипептиду. В одном частном воплощении настоящего изобретения этот полипептид кодируется нуклеотидами с номерами с 155 по 835 из последовательности нуклеиновых кислот, обозначенной как I.D. No.1. В другом воплощении настоящего изобретения указанный полипептид имеет последовательность аминокислот, в значительной степени идентичную аминокислотным остаткам с номерами с 174 по 400 из последовательности аминокислот, обозначенной как I.D. No.3.

Возможно получение этих антител из такого организма, как кролик или мышь.

Изобретение обеспечивает также способ получения антител к пептиду, причем указанный пептид имеет последовательность аминокислот, включающую аминокислотные остатки с номерами с 298 по 320 из последовательности аминокислот, обозначенной как I.D. No.3, который включает: (а) получение указанного пептида в очищенной форме; (б) иммунизацию организма, способного продуцировать антитела к указанному очищенному пептиду; (в) сбор продуцированных антител; (г) соединение продуцированных антител и указанного очищенного пептида в условиях, приводящих к образованию комплекса; и (д) определение, какие из полученных антител образуют комплекс с указанным очищенным пептидом, для того чтобы получить антитела к указанному пептиду.

Это изобретение обеспечивает также антитела, полученные описанными выше способами, более конкретно, - моноклональные антитела.

Кроме того, это изобретение обеспечивает антитела, способные выявлять полипептид, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин, и не способны выявлять основный поверхностный антиген вируса натурального гепатита В.

Это изобретение обеспечивает и антитела, способные выявлять пептид, причем указанный пептид имеет последовательность аминокислот, содержащую аминокислотные остатки с номерами с 298 по 320 из последовательности аминокислот, обозначенной как I.D. No.3.

Это изобретение обеспечивает также применение нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин, для того чтобы установить, инфицирован ли субъект вирусом штамма гепатита В, обозначенным как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионий заменен на треонин). Причем такое определение включает: (а) получение от этого субъекта пробы соответствующей нуклеиновой кислоты; и (б) определение, является ли эта проба нуклеиновой кислоты со стадии (а) той нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; или же производным этой кислоты.

В одном воплощении настоящего изобретения проба нуклеиновой кислоты со стадии (а) содержится мРНК, соответствующую транскрипту ДНК, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; причем определение на стадии (б) включает: (i) контактирование указанной мРНК с описанным выше олигонуклеотидом в условиях, допускающих сцепление этой мРНК с указанным олигонуклеотидом с образованием комплекса; (ii) выделение образовавшегося при этом комплекса; и (iii) идентификацию в выделенном комплексе указанной мРНК, для того чтобы определить, является ли эта мРНК той нуклеиновой кислотой, которая кодирует данный полипептид, или является ее производным.

В другом воплощении настоящего изобретения указанная проба нуклеиновой кислоты со стадии (а) содержит мРНК, соответствующую транскрипту ДНК, кодирующей полипептид, который является мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; причем определение на стадии (б) включает: (i) трансляцию указанной мРНК в условиях, подходящих для получения последовательности аминокислот; и (ii) сравнение последовательности аминокислот со стадии (i) с последовательностью аминокислот, кодируемой описанной выше изолированной нуклеиновой кислоты, для того чтобы определить, представляет ли эта проба нуклеиновой кислоты ту нуклеиновую кислоту, которая кодирует данный полипептид, или является ее производным.

Далее, стадию (б) можно определить как: (i) амплификацию нуклеиновой кислоты, присутствующей в пробе со стадии (а); и (ii) выявление присутствия полипептида в полученной в результате амплификации нуклеиновой кислоте.

Это изобретение обеспечивает применение антител, которые распознают полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; для того чтобы определить, инфицирован ли данный субъект штаммом вируса гепатита В, обозначенным как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионин заменен на треонин); причем такое определение включает: (а) получение от указанного субъекта соответствующей пробы; и (б) определение, представляет ли эта проба со стадии (а) ту нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин, или же ее производным. Это определение проводят путем контактирования указанной пробы при условиях, соответствующих ее связыванию с антителами, распознающими указанный полипептид, для того чтобы выявить, инфицирован ли данный субъект.

В описанных выше применениях эта изолированная нуклеиновая кислота, олигонуклеотид или антитело могут иметь метку, нанесенную выявляемым маркером. Примеры выявляемых маркером включают радиоактивные изотопы, флуорофоры и ферменты.

В разных воплощениях настоящего изобретения указанная проба может включать кровь, ткани организма или сыворотки.

Это изобретение обеспечивает также применение нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; для того чтобы определить, имеет ли субъект предрасположенность к гепатоцеллюлярной карциноме. Причем такое определение включает: (а) получение от указанного субъекта пробы соответствующей нуклеиновой кислоты; и (б) определение, является ли эта проба нуклеиновой кислоты со стадии (а) той нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; или же производным этой кислоты.

В одном воплощении настоящего изобретения эта проба нуклеиновой кислоты со стадии (а) содержит мРНК, соответствующую транскрипту ДНК, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; а определение на стадии (б) включает: (i) контактирование указанной мРНК с олигонуклеотидом в условиях, допускающих сцепление этой мРНК с указанным олигонуклеотидом с образованием комплекса; (ii) выделение образовавшегося при этом комплекса; и (iii) идентификацию в выделенном комплексе указанной мРНК, для того чтобы определить, является ли эта мРНК той нуклеиновой кислотой, которая кодирует данный полипептид, или является ее производным.

В другом воплощении настоящего изобретения указанная проба нуклеиновой кислоты со стадии (а) содержит мРНК, соответствующую транскрипту ДНК, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на 133 позиции этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; а определение на стадии (б) включает: (i) трансляцию указанной мРНК в условиях, подходящих для получения последовательности аминокислот; и (ii) сравнение указанной последовательности аминокислот со стадии (i) с последовательностью аминокислоты указанной изолированной нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, причем последовательность аминокислот указанного полипептида в существенной степени идентична аминокислотам с номерами с 174 по 400 из последовательности аминокислот, обозначенной как последовательность I.D.No.3; для того чтобы определить, является ли эта проба нуклеиновой кислоты той нуклеиновой кислотой, которая кодирует данный полипептид, или она представляет собой производное этой кислоты.

В другом воплощении настоящего изобретения определение на стадии (б) включает: (i) амплификацию нуклеиновой кислоты, присутствующей в пробе со стадии (а); и (ii) выявление присутствия полипептида в полученной в результате амплификации нуклеиновой кислоте.

Это изобретение обеспечивает, кроме того, применение антител, распознающих полипептид, который является мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин, для того чтобы определить, предрасположен ли субъект к гепатоцеллюлярной карциноме, причем такое определение включает в себя: (а) получение от этого субъекта соответствующей пробы; и (б) определение, является ли проба со стадии (а) той нуклеиновой кислотой, которая кодирует полипептид, являющийся мутантом основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин, или же производным этой кислоты; это определение проводят при контактировании с указанной пробой в условиях, соответствующих связыванию с антителами, выявляющими указанный полипептид, для того чтобы выявить, инфицирован ли субъект.

В описанных выше применениях эта изолированная нуклеиновая кислота, олигонуклеотид или антитело могут иметь метку, нанесенную выявляемым маркером. Примеры выявляемых маркером включают радиоактивные изотопы, флуорофоры и ферменты.

В разных воплощениях настоящего изобретения указанная проба может включать кровь, ткани организма или сыворотки.

Настоящее изобретение обеспечивает способ идентификации химического соединения для получения лекарственного средства, способного лечить инфекцию штамма вируса гепатита В, обозначенного как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионин заменен на треонин), который включает: (а) контактирование полипептида, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; с указанным химическим соединением в условиях, допускающих связывание указанного пептида с химическим соединением; (б) выявление специфического связывания указанного химического соединения с этим полипептидом; и (в) определение, ингибирует ли это химическое соединение указанный полипептид, для того чтобы идентифицировать химическое соединение, способное лечить инфекцию указанного штамма вируса.

Настоящее изобретение обеспечивает также способ идентификации химического соединения для получения лекарственного средства, способного предотвратить инфекцию штамма вируса гепатита В, обозначенного как поверхностный антиген вируса гепатита В человека-'S'-133 штамм ООН (метионин заменен на треонин), который включает: (а) контактирование полипептида, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; с указанным химическим соединением в условиях, допускающих связывание указанного пептида с химическим соединением; (б) выявление специфического связывания указанного химического соединения с этим полипептидом; и (в) определение, ингибирует ли это химическое соединение указанный полипептид, для того чтобы идентифицировать химическое соединение, способное предотвратить инфекцию этого штамма вируса.

Настоящее изобретение обеспечивает также способ идентификации химического соединения для получения лекарственного средства, способного лечить гепатоцеллюлярную карциному, который включает: (а) контактирование полипептида, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; с указанным химическим соединением в условиях, допускающих связывание указанного полипептида с химическим соединением; (б) выявление специфического связывания указанного химического соединения с этим полипептидом; и (в) определение, ингибирует ли это химическое соединение указанный полипептид, для того чтобы идентифицировать химическое соединение, способное лечить инфекцию этого штамма вируса.

Настоящее изобретение обеспечивает также способ идентификации химического соединения для получения лекарственного средства, способного предотвратить гепатоцеллюлярную карциному, который включает: (а) контактирование полипептида, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 такого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин; с указанным химическим соединением в условиях, допускающих связывание указанного полипептида с химическим соединением; (б) выявление специфического связывания указанного химического соединения с этим полипептидом; и (в) определение, ингибирует ли это химическое соединение указанный полипептид, для того чтобы идентифицировать химическое соединение, способное предотвратить инфекцию этого штамма вируса.

Настоящее изобретение обеспечивает, кроме того, состав, содержащий химическое соединение, идентифицируемое приведенными выше способами, в таких количествах, которые эффективны для лечения или предотвращения инфекции этого штамма; а также фармацевтически эффективный носитель.

Настоящее изобретение обеспечивает, кроме того, состав, содержащий полипептид, который представляет собой мутант основного поверхностного антигена штамма вируса гепатита В, причем последовательность аминокислот такого полипептида отличается от последовательности аминокислот основного поверхностного антигена вируса натурального гепатита В тем, что аминокислота на позиции под номером 133 этого полипептида представляет собой скорее треонин, чем метионин, или его производное; причем количество такого полипептида эффективно для того, чтобы стимулировать продуцирование антител у субъекта или усилить их продуцирование; а также фармацевтически приемлемый носитель.

Указанное реальное эффективное количество полипептида будет зависеть от размера конкретного полипептида, его способности к биологической деструкции, биологической активности этого полипептида и его биологической доступности. Если конкретный полипептид не характеризуется быстрой деструкцией, биологически доступен и имеет высокую активность, то для обеспечения эффективности будет необходимо меньшее количество этого полипептида. Это эффективное количе