Системы экспрессии рнк рекомбинантного вируса ньюкаслской болезни и вакцины

Системы экспрессии рнк рекомбинантного вируса ньюкаслской болезни и вакцины

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка является частичным продолжением заявки №09/152845, поданной 14 сентября 1998 года, которая во всей своей полноте включена в настоящее описание в качестве ссылки.

1. Введение

Настоящее изобретение относится к матрицам РНК рекомбинантного вируса ньюкаслской болезни, которые могут быть использованы для экспрессии продуктов гетерологичных генов в соответствующих системах клеток-хозяев и/или для конструирования рекомбинантных вирусов, которые экспрессируют, упаковывают и/или презентируют этот гетерологичный генный продукт. Эти продукты экспрессии и химерные вирусы могут быть использованы преимущественно в вакцинных препаратах. Настоящее изобретение также относится к генетически сконструированным рекомбинантным вирусам ньюкаслской болезни, содержащим модификации и/или мутации, которые делают этот рекомбинантный вирус подходящим для его использования в вакцинных препаратах, такие как аттенюированный фенотип или повышенная иммуногенность.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантным вирусам ньюкаслской болезни, которые индуцируют интерфероновые и связанные с ним пути метаболизма. Настоящее изобретение относится к использованию вирусов и вирусных векторов ньюкаслской болезни против патогенов и/или антигенов широкого ряда, включая опухолеспецифические антигены. Настоящее изобретение продемонстрировано на примерах, в которых были сконструированы РНК-матрицы рекомбинантного вируса ньюкаслской болезни, содержащие гетерологичный ген, кодирующий последовательности в отрицательной полярности. Настоящее изобретение также относится к конструированию РНК-матриц рекомбинантного вируса ньюкаслской болезни, содержащих гетерологичный ген, кодирующий последовательности в положительной полярности. Такими последовательностями гетерологичного гена являются последовательности, происходящие от вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

2. Предпосылки создания изобретения

Для управления экспрессией гетерологичных белков в системах клеток-хозяев был генетически сконструирован ряд ДНК-вирусов (например, вирус коровьей оспы, бакуловирус и т.п.). Недавно аналогичные успехи были также достигнуты в конструировании РНК-вирусов с позитивной цепью (например, полиовируса). Считается, что продукты экспрессии этих конструкций, т.е. продукт гетерологичного гена или химерный вирус, который экспрессирует продукт гетерологичного гена, может быть использован в вакцинных препаратах (в субъединичных вакцинах или в вакцинах на основе полноразмерного вируса). Одним из недостатков использования вирусов, таких как вирус коровьей оспы, в целях конструирования рекомбинантных или химерных вирусов для их использования в вакцинах является отсутствие вариабельности в их главных эпитопах. Такое отсутствие вариабельности в вирусных штаммах налагает строгие ограничения на повторное использование химерных вакцин на основе вируса коровьей оспы, заключающиеся в том, что множество вакцинаций будет приводить к вырабатыванию у хозяина резистентности к этому штамму, так, что инокулированный вирус больше не сможет инфицировать хозяина. Поэтому заражение резистентного индивидуума химерными вакцинами не будет индуцировать стимуляцию иммунного ответа.

В противоположность этому, РНК-вирус с негативной цепью должен быть привлекательным кандидатом для конструирования химерных вирусов в целях их использования в вакцинах. РНК-вирус с негативной цепью, например вирус гриппа, является желательным потому, что он имеет широкую генетическую вариабельность, позволяющую конструировать вакцинные препараты широкого спектра, которые стимулируют иммунный ответ без риска развития толерантности. В последнее время конструирование инфекционных рекомбинантных или химерных РНК-частиц с негативной цепью было осуществлено с использованием вируса гриппа (см. патент США №5166057, Palese и др., который во всей своей полноте включен в настоящее описание в качестве ссылки).

2.1. Вирус ньюкаслской болезни

Семейства вирусов, содержащие оболочечную одноцепочечную РНК антисмыслового генома, классифицируют на группы, имеющие несегментированные геномы (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae), или на группы, имеющие сегментированные геномы (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae и Arenaviridae). К семейству Paramyxoviridae, подробно описанному ниже и используемому в описанных здесь примерах, относится вирус ньюкаслской болезни (NDV), вирус парагриппа, вирус Сендай, обезьяний вирус 5 и вирус эпидемического паротита.

Вирус ньюкаслской болезни представляет собой оболочечный вирус, содержащий линейный одноцепочечный несегментированный антисмысловой РНК-геном. Эта геномная РНК содержит гены в следующем порядке: 3'-NP-P-M-F-HN-L, более подробно описанные ниже. Эта геномная РНК также содержит лидерную последовательность у 3'-конца.

Структурные элементы данного вириона включают вирус с оболочкой, который представляет собой липидный бислой, происходящий из плазматической мембраны клетки. Гликопротеин, гемаглютинин-нейраминидаза (HN), выступает из этой оболочки, благодаря чему этот вирус обладает гемаглютининовой и нейраминидазной активностью. Гибридный гликопротеин (F), который также взаимодействует с вирусной мембраной, сначала продуцируется как неактивный предшественник, а затем посттрансляционно отщепляется с образованием двух полипептидов, связанных дисульфидами. Активный белок F участвует в проникновении NDV в клетки-хозяева путем облегчения слияния вирусной оболочки с плазматической мембраной клетки-хозяина. Матриксный белок (М) участвует в сборке вируса и взаимодействует с вирусной мембраной, а также с нуклеокапсидными белками.

Главной субъединицей белка этого нуклеокапсида является нуклеокапсидный белок (NP), который наделяет этот капсид спиральной симметрией. В ассоциации с этим нуклеокапсидом находятся белки Р и L. Очевидно, что фосфопротеин (Р), подвергаемый фосфорилированию, играет роль регулятора транскрипции и может также участвовать в метилировании, фосфорилировании и полиаденилировании. Ген L, который кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу, необходим для синтеза вирусной РНК вместе с белком Р. Белок L, который берет на себя почти половину кодирующей функции вирусного генома, является наиболее крупным из этих вирусных белков и играет важную роль как в транскрипции, так и в репликации.

Репликация всех РНК-вирусов с негативной цепью, включая NDV, затруднена из-за отсутствия клеточного механизма, необходимого для репликации РНК. Кроме того, геном с негативной цепью не может непосредственно транслироваться в белок, и сначала он должен транскрибироваться в копию (мРНК) с позитивной цепью. Следовательно, после внедрения в клетку-хозяина эта геномная РНК сама по себе не может синтезировать нужную РНК-зависимую РНК-полимеразу. Белки L, P и NP должны проникать в клетку вместе с геномом после инфицирования.

Была высказана гипотеза, что большинство вирусных белков или все эти белки, которые транскрибируют мРНК NDV, также осуществляют репликацию вируса. Механизм, который регулирует альтернативную функцию (т.е. транскрипцию или трансляцию) того же комплемента белков, не был точно идентифицирован, однако, очевидно, что он приводит к образованию избытка свободных форм одного или нескольких нуклеокапсидных белков, а в частности, NP. Сразу после проникновения вируса транскрипция инициируется белком L с использованием антисмысловой РНК в нуклеокапсиде в качестве матрицы. Синтез вирусной РНК регулируется так, чтобы в процессе транскрипции он продуцировал моноцистронные мРНК.

После транскрипции вторым главным событием при инфицировании РНК-вирусами с негативной цепью является репликация вирусного генома. Как и для других РНК-вирусов с негативной цепью, репликация вирусного генома в вирусе ньюкаслской болезни (NDV) опосредуется вирусспецифическими белками. Первыми продуктами репликативного синтеза РНК являются комплементарные копии (т.е. копии с положительной полярностью) РНК генома NDV (кДНК). Эти копии с плюс-цепями (антигеномы) отличаются от позитивных мРНК-транскриптов по своей концевой структуре. В отличие от мРНК-транскриптов эти антигеномные кРНК не являются копированными и метилированными у 5'-конца и не являются усеченными и полиаденилированными у 3'-конца. кРНК имеют общий конец со своими негативными матрицами и содержат всю генетическую информацию в каждом геномном РНК-сегменте в комплементарной форме. кРНК служат в качестве матриц для синтеза вирусных NDV-геномов с негативной цепью (вРНК).

Геномы NDV с негативной цепью (вРНК) и антигеномы (кРНК) инкапсидируются нуклеокапсидными белками; при этом вирусными мРНК являются лишь неинкапсидированные виды РНК. Для NDV местом репликации, а также транскрипции вирусной РНК является цитоплазма. Сборка вирусных компонентов осуществляется в плазматической мембране клетки-хозяина и зрелый вирус высвобождается посредством отпочковывания.

2.2. Конструирование РНК-вирусов с негативной цепью

РНК-зависимые РНК-полимеразы вирусов животных были широко изучены в отношении многих аспектов структуры белка и реакционных условий. Однако элементы РНК-матрицы, которые стимулируют оптимальную экспрессию посредством полимеразы, могут быть изучены лишь благодаря предположению о существовании вирусных РНК-последовательностей. Такой анализ промоторов представляет определенный интерес, поскольку неизвестно, каким образом вирусная полимераза распознает специфические вирусные РНК из множества РНК, кодируемых хозяином и обнаруживаемых в инфицированной клетке.

Вирусы животных, содержащие плюс-смысловую геномную РНК, могут реплицироваться при введении плазмидной РНК в клетки путем трансфикции (например, Racaniello et al., 1981, Science 214:916-919; Levis et al., 1986, Cell 44:137-145). В случае полиовируса очищенная полимераза будет реплицировать геномную РНК в in vitro-реакциях, и при трансфицировании этого плюс-смыслового РНК-препарата в клетки она становится инфекционной (Kaplan et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8424-8428). Однако элементы матрицы, которые служат в качестве транскрипционного промотора для кодируемой полиовирусом полимеразы, неизвестны, поскольку даже гомополимеры РНК могут быть копированы (Ward, et al., 1988, J.Virol. 62:558-562). Для продуцирования модели дефектных интерферирующих (ДИ) РНК для генома вируса Синдбис также были использованы транскрипты SP6. При введении РНК в инфицированные клетки она реплицируется и упаковывается. Было показано, что РНК-последовательности, которые ответственны за распознавание полимеразой вируса Синдбис и упаковку этого генома в вирусные частицы, составляют последовательность в 162 нуклеотидов (нк) с 5'-конца и 19 нуклеотидов с 3'-конца генома (Levis, et al., 1986, Cell 44:137-145). В случае вируса мозаики костра (BMV), растительного РНК-вируса с позитивной цепью, транскрипты SP6 были использованы для идентификации промотора как 134-нуклеотидного тРНК-подобного 3'-конца (Dreher & Hall, 1988, J.Mol.Biol., 201:31-40). Было показано, что распознавание и синтез полимеразы зависят как от последовательности, так и от вторичных структурных признаков (Dreher et al., Nature 311:171-175).

Антисмысловые РНК-вирусы не поддавались исследованию в отношении последовательности, требуемой для репликазы. Очищенная полимераза вируса везикулярного стоматита является активной лишь при транскрипции в том случае, когда вирусные рибонуклеопротеиновые комплексы (РНП) включаются в качестве матрицы (De & Banerjee, 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 126:40-49; Emerson & Yu, 1975, J.Virol. 15:1348-1356; Natio & Ishihama, 1976, J.Biol.Chem. 251:4307-4314). Что касается вирусов гриппа, то сообщалось, что "голая" РНК, выделенная из вируса, была использована для восстановления РНП. Вирусные нуклеокапсидные и полимеразные белки подвергали гель-очистке и ренатурировали на вирусной РНК с использованием тиоредоксина (Szewczyk et al, 1988, Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 85:7907-7911). Однако эти авторы не указывают ни на то, что активность этого препарата является специфичной для РНК-вируса гриппа, ни на то, что ими были проанализированы сигналы, которые стимулируют транскрипцию.

Лишь недавно стало возможным выявить РНК-вирусы с негативной цепью путем использования рекомбинантных методов обратной генетики (патент США №5166057, Palease и др.). Хотя этот метод был сначала применен для конструирования геномов вируса гриппа (Luytjes et al, 1989, Cell 59: 1107-1113; Enami et al. 1990, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:11563-11567), однако, он был успешно применен к широкому ряду сегментированных и несегментированных РНК-вирусов с негативной цепью, включая вирус бешенства (Schnell et al. 1994, EMBO J. 13:4195-4203); респираторно-синцитиальные вирусы (Collins et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9663-9667); и вирус Сендай (Park et al. 1991, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:5537-5541; Kato et al., 1996, Genes Cells 1:569-579). Однако этот способ можно еще применить к РНК-геномам вируса ньюкаслской болезни.

Краткое описание изобретения

Были описаны матрицы рекомбинантного РНК-вируса ньюкаслской болезни, которые могут быть использованы с РНК-зависимой РНК-полимеразой для экспрессии гетерологичных генных продуктов в соответствующих клетках-хозяевах и/или для спасения гетерологичного гена в вирусных частицах. В одном из вариантов своего осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантным вирусам ньюкаслской болезни, которые индуцируют интерфероновый и связанные с ним пути метаболизма. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным вирусам ньюкаслской болезни, содержащим модификации, приводящие к фенотипам, которые делают эти рекомбинантные вирусы более подходящими для использования в вакцинных препаратах, например к аттенюированным фенотипам и фенотипам с повышенной иммуногенностью. В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к конструированию рекомбинантных вирусов и вирусных векторов ньюкаслской болезни, которые содержат гетерологичные гены, включая гены других вирусов, патогены, клеточные гены, опухолевые антигены и т.п.

В другом варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к конструированию рекомбинантных вирусов и вирусных векторов ньюкаслской болезни для использования их в качестве вакцин. Настоящее изобретение относится к вакцинным препаратам, подходящим для введения человеку, а также для использования в ветеринарии. Вакцины настоящего изобретения могут быть сконструированы для введения домашним животным, включая кошек и собак; диким животным, включая лисиц и енотов; скоту и домашней птице, включая лошадей, крупный рогатый скот, овец, индеек и кур.

В еще одном варианте своего осуществления настоящее изобретение относится к рекомбинантным вирусным векторам ньюкаслской болезни и вирусам, которые были сконструированы так, чтобы они содержали мутантные вирусные гены ньюкаслской болезни или комбинации генов различных штаммов вируса ньюкаслской болезни. РНК-матрицы настоящего изобретения получают путем транскрипции соответствующих ДНК-последовательностей ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Полученные РНК-матрицы имеют отрицательную полярность и содержат соответствующие концевые последовательности, которые дают возможность аппарату синтеза вирусной РНК распознавать эту матрицу. Альтернативно, могут быть также использованы РНК-матрицы с положительной полярностью, содержащие соответствующие концевые последовательности, которые дают возможность аппарату синтеза вирусной РНК распознавать эту матрицу. Экспрессия из РНК-матриц с положительной полярностью может быть достигнута путем трансфикции плазмид, имеющих промоторы, распознаваемые ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Так, например, плазмидная ДНК, кодирующая положительные РНК-матрицы под контролем промотора Т7, может быть использована в комбинации с системой вируса коровьей оспы Т7.

Бицистронные мРНК могут быть сконструированы для достижения внутренней инициации трансляции вирусных последовательностей и осуществления экспрессии чужеродного белка, кодирующего последовательности от регулярного терминального сайта инициации или наоборот. Альтернативно, чужеродный белок может быть экспрессирован от внутренней транскрипционной единицы, где данная транскрипционная единица имеет сайт инициации и сайт полиаденилирования. В другом варианте настоящего изобретения чужеродный ген встраивают в ген NDV, так, чтобы полученный экспрессированный белок был слитым белком.

Матрицы рекомбинантной вирусной РНК ньюкаслской болезни настоящего изобретения могут быть использованы для трансфикции трансформированных клеточных линий, которые экспрессируют РНК-зависимую РНК-полимеразу и обеспечивают комплементацию. Альтернативно, плазмида, экспрессирующаяся с соответствующего промотора, может быть использована для трансфикции вирус-специфической (химерной) РНК. Комплементация может быть также достигнута с использованием вируса-помощника, который имеет РНК-зависимую РНК-полимеразу. Кроме того, для вируса ньюкаслской болезни также описана система вирус-независимой репликации. Минимальной подгруппой белков вируса ньюкаслской болезни, необходимых для специфической репликации и экспрессии вируса, являются три белка, L, Р и NP, которые могут быть экспрессированы из плазмид с помощью системы Т7 вируса коровьей оспы. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, в случае, когда для получения вирусного генома используются плазмиды, кодирующие антигеномную копию генома NDV, минимальной подгруппой белков вируса ньюкаслской болезни, необходимых для специфической репликации и экспрессии вируса, являются белки L и Р. При транскрибировании антигеномной копии NDV первым транскрибируется полимеразный белок NP, a поэтому нет необходимости дополнительно вводить полимеразу NP in trans.

Продукты экспрессии и/или полученные химерные вирионы могут быть преимущественно использованы в вакцинных препаратах. Продукты экспрессии и химерные вирионы настоящего изобретения могут быть сконструированы в целях создания вакцин против патогенов широкого ряда, включая вирусные антигены, опухолевые антигены и аутоантигены, вовлеченные в патогенез аутоиммунных заболеваний. В частности, химерные вирионы настоящего изобретения могут быть сконструированы для создания вакцин против ВИЧ, где иммуногенный полипептид от gp160 и/или от внутренних белков ВИЧ встраивают в белок гликопротеина HN для конструирования вакцины, которая способна продуцировать как гуморальные, так и клеточно-опосредованные ответы у позвоночных. Использование рекомбинантного вируса ньюкаслской болезни в этих целях представляет особый интерес, поскольку вирус ньюкаслской болезни не является патогенным для человека. Кроме того, использование рекомбинантного вируса ньюкаслской болезни для доставки опухолевых антигенов представляет особый интерес еще и тем, что этот вирус, как известно, обладает противоопухолевыми и иммунопотенцирующими свойствами.

Определения

Используемые в настоящем описании термины имеют следующие значения:

кРНК=антигеномная РНК

ВИЧ=вирус иммунодефицита человека

L=большой белок

М=матриксный белок (выстилает оболочку изнутри)

MDCK=клетки собачьей почки Madin Darby

MDBK=клетки коровьей почки Madin Darby

МЗ=множественность заражения

NA=нейрамидиназа (гликопротеин оболочки)

NDV=вирус ньюкаслской болезни

NP=нуклеопротеин (ассоциированный с РНК и необходимый для

полимеразной активности)

NS=неструктурный белок (неизвестной функции)

нк=нуклеотид

PA, РВ1, РВ2=компоненты РНК-зависимой РНК-полимеразы

РНП=рибонуклеопротеин

рРНП=рекомбинантный РНП

вРНК=геномная вирусная РНК

WSN=вирус гриппа A/WSN/33

вирус WSN-HK=реассортантный вирус (псевдовирус), содержащий семь генов от вируса WSN и ген NA от вируса гриппа А/НК/8/68

Описание чертежей

Фиг.1. Схематическое представление минигенома NDV. В верхней части изображена плазмида PNDVCAT, включающая промотор Т7; 5'-концевую последовательность (5'-конец геномной РНК, 191 нк); вставленные нуклеотиды (СТТАА); 667 нуклеотидов ОРС CAT; 3'-концевую последовательность (3'-конец геномной РНК, 121 нк); BbsI-сайт и сайты нуклеазы. В нижней части изображена химерная РНК NDV-CAT, полученная в результате in vitro-транскрипции. В результате NDV-амплификации и транскрипции химерного минигенома NDV-CAT в трансфицированных клетках обнаруживалась САТ-активность.

Фиг.2А-С. Схематическое представление экспрессирующих векторов PTMI.

PTMI-NP кодирует белок NP NDV.

PTMI-P кодирует белок Р NDV.

PTMI-L кодирует белок L NDV.

Фиг.3. РНК-последовательность 5'- и 3'-некодирующих концевых областей NDV (плюс-смысловых). Последовательности, расположенные у 5'-конца гена CAT, представляют собой 121 нуклеотид 5'-некодирующей концевой области плюс-смыслового генома NDV, содержащего 65 нк лидерной последовательности (жирный шрифт), за которыми расположены 56 нк гена NP UTR. Последовательности, находящиеся со стороны 3'-конца по отношению к гену CAT, представляют собой встроенные нуклеотиды cuuaa (строчные буквы) и 191 нк некодирующей концевой области плюс-смыслового генома NDV, содержащего 127 нк UTR гена L, за которыми расположены 64 нк трейлерной области (жирный шрифт).

Фиг.4А-В. Схематическое представление структуры рекомбинантных клонов NDV. На Фиг.4В представлен инфекционный NDV, экспрессирующий Env и Gag ВИЧ. Верхняя панель: Env и Gag ВИЧ находятся между генами М и L. Нижняя панель: Env и Gag ВИЧ расположены со стороны 3'-конца по отношению к гену NP.

Фиг.5. Схематическое представление 3'- и 5'-концов NDV в виде первичной последовательности Kurilla et al., 1985 Virology 145:203-212 (3'-концы) и Yusoff et al., 1987 Nucltic Acids Research 15:3961 (5'-концы).

Фиг.6. Методы обратной генетики на основе плазмид для NDV-экспрессии чужеродного гена. Клетки инфицировали рекомбинантным вирусом коровьей оспы, экспрессирующим полимеразу Т7. Кроме того, клетки трансфицировали 1) плазмидной ДНК, кодирующей белки L, NP и Р NDV под транскрипционным контролем промотора Т7 (pTM1-L, pTM1-NP и pTM1-P, соответственно) и 2) плазмидной ДНК, кодирующей химерный минигеном NDV-CAT под транскрипционным контролем промотора Т7 (pT7-NDV-CAT-RB). Правильный 3'-конец минигенома NDV-CAT достигается в результате расщепления, стимулированного последовательностью рибозима (RB). Амплификация и транскрипция химерного минигенома NDV-CAT приводит к САТ-активности, обнаруживаемой в трансфицированных клетках. Некодирующие области у 3'- и 5'-концов минигенома NDV-CAT показаны черными квадратами.

Фиг.7. Сохранение NDV с помощью синтетической ДНК. Клетки инфицировали рекомбинантным вирусом коровьей оспы, экспрессирующим полимеразу Т7. Кроме того, клетки трансфицировали 1) плазмидными ДНК, кодирующими белки L, NP и Р NDV под транскрипционным контролем промотора Т7 (pTM1-L, pTM1-NP и pTM1-P, соответственно) и 2) плазмидной ДНК, кодирующей антигеном NDV под транскрипционным контролем промотора Т7 (pT7-NDV±RB). Правильный 3'-конец антигенома NDV-CAT получают в результате расщепления, стимулированного последовательностью рибозима (RB). Амплификация и транскрипция антигенома NDV приводит к сохранению инфекционных вирусов NDV. Некодирующие области у 3'- и 5'-концов антигенома NDV показаны черными квадратами.

Фиг.8. NDV-экспрессия чужеродного гена, встроенного в виде внутренней транскрипционной единицы в антигеном NDV. Клетки инфицировали рекомбинантным вирусом коровьей оспы, экспрессирующим полимеразу Т7. Кроме того, клетки трансфицировали 1) плазмидной ДНК, кодирующей белки L, NP и Р NDV под транскрипционным контролем промотора Т7 (pTM1-L, pTM1-NP и pTM1-P, соответственно) и 2) плазмидной ДНК, кодирующей химерный антигеном NDV-CAT под транскрипционным контролем промотора Т7 (pT7-NDV-CAT-RB). В химерном антигеноме NDV-CAT открытая рамка считывания CAT заменяет природную открытую рамку считывания HN антигенома дикого типа NDV. Правильный 3'-конец химерного антигенома NDV-CAT достигается в результате расщепления, стимулированного последовательностью рибозима (RB). Амплификация и транскрипция химерного антигенома NDV-CAT приводит к САТ-активности, обнаруживаемой в трансфицированных клетках. Некодирующие области у 3'- и 5'-концов химерного антигенома NDV-CAT показаны черными рамками.

5. Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к рекомбинантно сконструированным вирусам и вирусным векторам ньюкаслской болезни, экспрессирующим гетерологичные гены или мутированные гены вируса ньюкаслской болезни, или к комбинации вирусных генов, происходящих от различных штаммов вируса ньюкаслской болезни. Настоящее изобретение относится к конструированию и использованию матриц рекомбинантных РНК вируса NDV с негативной цепью, которые могут быть использованы с РНК-зависимой РНК-полимеразой для экспрессии гетерологичных генных продуктов в соответствующих клетках-хозяевах и/или для спасения гетерологичного гена в вирусных частицах. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения гетерологичным генным продуктом является пептид или белок, происходящий из генома вируса иммунодефицита человека. РНК-матрицы настоящего изобретения могут быть получены либо in vitro, либо in vivo посредством транскрипции ДНК-последовательностей с использованием ДНК-зависимой РНК-полимеразы, такой как полимераза бактериофагов Т7, Т3, SP6 или эукариотическая полимераза, такая как полимераза I.

Рекомбинантные РНК-матрицы могут быть использованы для трансфикции стабильных/трансфицированных клеточных линий, которые экспрессируют белки, РНК-зависимые РНК-полимеразы, обеспечивая комплементацию, как показано в рабочих примерах, где РНК-транскрипты клонированной ДНК, содержащие кодирующую область, в антисмысловой ориентации, гена хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (CAT), фланкированного 5'-концевыми и 3'-концевыми нуклеотидами РНК NDV-CL (штамма Калифорния/11914/1944-подобного штамма) (Meindl et al., 1974 Virology 58:457-463), были трансфицированы в клетки, экспрессирующие полимеразные белки NDV. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения для регенерации химерной NDV используют вирус-независимую систему репликации, в которой плазмидная ДНК, кодирующая геном или антигеном NDV, ко-экспрессируется с плазмидной ДНК, кодирующей минимальную подгруппу белков вируса ньюкаслской болезни для специфической репликации и экспрессии вируса, как было продемонстрировано в рабочем примере, описанном ниже.

Способность NDV к восстановлению in vivo позволяет сконструировать новые химерные вирусы NDV, которые экспрессируют чужеродные гены или которые экспрессируют мутантные гены NDV. Способность NDV к восстановлению in vivo также позволяет сконструировать новые химерные вирусы NDV, которые экспрессируют гены от различных штаммов NDV. Один из способов достижения этой цели заключается в модификации существующих генов NDV. Так, например, ген HN может быть модифицирован так, чтобы он содержал чужеродные последовательности в своих внешних доменах. Если эта гетерологичная последовательность имеет эпитопы или антигены патогенов, то эти химерные вирусы могут быть использованы для индуцирования протективного иммунного ответа против этого патологического агента, от которого произошли эти детерминанты.

В соответствии с настоящим изобретением конструируют химерную РНК, в которой кодирующую последовательность, происходящую от кодирующей области gp160 вируса иммунодефицита человека, встраивают в кодирующую последовательность NDV, и в результате трансфикции этого химерного РНК-сегмента в клетке-хозяине, инфицированной вирусом NDV дикого типа, продуцируется химерный вирус. Кроме того, такой химерный вирус должен обладать способностью вырабатывать гуморальный и клеточно-опосредованный иммунный ответ у позвоночных. Настоящее изобретение также относится к индуцированию интерферонового и связанного с ним пути метаболизма рекомбинантными или химерными вирусами NDV.

Настоящее изобретение относится к использованию вирусных векторов и химерных вирусов данного изобретения для получения вакцин против вирусов и/или антигенов широкого ряда, включая опухолевые антигены. Вирусные векторы и химерные вирусы настоящего изобретения могут быть использованы для модуляции иммунной системы у субъекта путем стимуляции гуморального иммунного ответа, клеточного иммунного ответа или путем стимуляции толерантности к антигену. Используемый здесь термин "субъект" означает человек, приматы, лошади, коровы, овцы, свиньи, козы, собаки, кошки, птицы и грызуны. В случае доставки опухолевых антигенов настоящее изобретение может быть использовано для лечения субъектов с заболеваниями, склонными к иммуно-опосредованному отторжению, такими как несолидные опухоли или солидные опухоли небольшого размера. При этом, также считается, что описанная здесь доставка опухолевых антигенов вирусными векторами и химерными вирусами может быть использована для лечения после удаления солидных опухолей большого размера. Настоящее изобретение может быть также использовано для лечения субъектов с подозрением на злокачественную опухоль.

В целях неограничивающего описания настоящего изобретения оно может быть разделено на следующие стадии: (а) конструирование рекомбинантных РНК-матриц; (b) экспрессия гетерологичных генных продуктов с использованием рекомбинантных РНК-матриц; и (с) сохранение гетерологичного гена в рекомбинантных вирусных частицах. Для лучшего понимания предмета обсуждения настоящее изобретение описано в рабочих примерах с использованием NDV-CL (штамма Калифорния/11914/1944-подобного штамма), однако может быть использован и любой другой штамм NDV.

5.1. Конструирование рекомбинантных РНК-матриц

Конкретный вариант осуществления настоящего изобретения заключается в идентификации заявителями правильной нуклеотидной последовательности 5'- и 3'-концов антисмысловых геномов РНК NDV. Нуклеотидная последовательность 5'- и 3'-концов антисмысловых геномов РНК NDV настоящего изобретения значительно отличается от ранее описанной последовательности 3'-конца NDV, показанной на Фиг.5. Идентификация правильной нуклеотидной последовательности 5'- и 3'-концов NDV позволила сначала сконструировать рекомбинантные NDV-РНК-матрицы с последующей экспрессией рекомбинантных РНК-матриц и сохранением рекомбинантных NDV-частиц. Настоящее изобретение охватывает не только 5'- и 3'-концы, имеющие нуклеотидную последовательность, показанную на Фиг.5, но оно также охватывает любые модификации или мутации, вносимые в эти концы или любые его фрагменты, которые еще сохраняют функцию концов вируса дикого типа, т.е. сигналы, необходимые для аппарата синтеза вирусной РНК для распознавания этой матрицы.

Последовательности, кодирующие гетерологичные гены и фланкированные комплементарной последовательностью сайта связывания с вирусной полимеразой/промотора, например последовательностью, комплементарной обоим 5'- и 3'-концам вируса NDV, могут быть сконструированы известными методами. Полученные РНК-матрицы могут обе иметь негативную полярность и содержать соответствующие концевые последовательности, способные синтезировать вирусный аппарат РНК для распознавания матрицы. Альтернативно, могут быть также использованы РНК-матрицы с позитивной полярностью, содержащие соответствующие концевые последовательности, способные синтезировать вирусный аппарат РНК для распознавания матрицы. Рекомбинантные ДНК-молекулы, содержащие гибридные последовательности, могут быть клонированы и транскрибированы ДНК-зависимой РНК-полимеразой, такой как полимераза бактериофагов Т7, Т3, SP6 или эукариотическая полимераза, такая как полимераза I и т.п., для продуцирования in vitro или in vivo рекомбинантных РНК-матриц, которые имеют соответствующие вирусные последовательности, способствующие распознаванию вирусной полимеразой и ее активности.

В другом варианте настоящего изобретения в химерном вирусе настоящего изобретения может быть сконструирована фактически любая гетерологичная последовательность, включая, но не ограничиваясь ими, антигены, такие как 1) антигены, которые характеризуют патоген; 2) антигены, которые характеризуют аутоиммунное заболевание; 3) антигены, которые характеризуют аллерген; и 4) антигены, которые характеризуют опухоль. Так, например, последовательностями гетерологичных генов, которые могут быть сконструированы в химерных вирусах настоящего изобретения, являются, но не ограничиваются ими, эпитопы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), такие как gp160; поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg); гликопротеины вируса герпеса (например, gD, gE); VP1 полиовируса; и антигенные детерминанты невирусных патогенов, таких как бактерии и паразиты и др.

Антигены, которые характеризуют аутоиммунное заболевание, обычно происходят из клеточной поверхности, цитоплазмы, ядра, митохондрий и подобных элементов тканей человека, включая антигены, характерные для сахарного диабета, рассеянного склероза, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, пернициозной анемии, болезни Аддисона, склеродермии, аутоиммунного атрофического гастрита, юношеского диабета и дискоидной красной волчанки.

Антигены, которые являются аллергенами, обычно представляют собой белки или гликопротеины, включая антигены, происходящие из пыльцы, пыли, плесени, спор, перхоти, насекомых и пищи.

Антигены, которые характеризуют опухолевые антигены, обычно происходят от клеточной поверхности, цитоплазмы, ядра, органелл и подобных элементов клеток опухолевой ткани. В качестве примеров могут служить антигены, характеризующие опухолевые белки, включая белки, кодированные мутированными онкогенами; вирусные белки, ассоциированные с опухолями; и гликопротеины. Опухоли включают, но не ограничиваются, злокачественные опухоли разных типов; злокачественных опухолей губы, носоглотки, глотки и ротовой полости, пищевода, желудка, толстой кишки, прямой кишки, печени, желчного пузыря, поджелудочной железы, гортани, легких и бронхов; меланомы кожи, злокачественных опухолей молочной железы, шейки матки, матки, яичника, мочевого пузыря, почек, головного мозга и другие отделов нервной системы, щитовидной железы, предстательной железы и яичек; лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, множественной миеломы и лейкоза.

В одном из вариантов осуществления изобретения гетерологичные последовательности происходят от генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), предпочтительно вируса иммунодефицита человека-1 или вируса иммунодефицита человека-2. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения гетерологичные кодирующие последовательности могут быть встроены в кодирующую последовательность гена NDV, так, чтобы экспрессировался продукт химерного гена, который содержит гетерологичную пептидную последовательность в вирусном белке NDV. В этом варианте осуществления изобретения гетерологичные последовательности могут также происходить от генома вируса иммунодефицита человека, предпочтительно вируса иммунодефицита человека-1 или вируса иммунодефицита человека-2.

В случае, если указанные гетерологичные последовательности происходят от ВИЧ, то такими последовательностями могут быть, но не ограничиваются ими, последовательности, происходящие от гена env (то есть, последовательности, кодирующие все или часть gp160, gp120 и/или gp41), гена pol (то есть, последовательности, кодирующие все или некоторые из ферментов, таких как обратная транскриптаза, эндонуклеаза, протеаза и/или интеграза), гена gag (то есть, последовательности, кодирующие все или часть р7, р6, р55, р17/18, р24/25), tat, rev, nef, vif, vpu, vpr и/или vpx.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения гетерологичными генными последовательностями, которые могут быть сконструированы в химерных вирусах, являются последовательности, кодирующие белки с иммунопотенцирующей активностью. Примерами иммунопотенцирующих белков являются, но не ограничиваются ими, цитокины, интерферон типа 1, гамма-интерферон, колониестимулирующие факторы, интерлейкин-1, -2, -4, -5, -6, -12.

Одним из методов конструирования этих гибридных молекул является встраивание гетерологичной кодирующей последовательности в ДНК-комплемент гена NDV так, чтобы эта гетерологичная последовательность была фланкирована вирусными последовательностями, необходимыми для вирусной полимеразной активности; т.е. сайтом связывания с вирусной полимеразой/промотором, далее называемым сайтом связывания с вирусной полимеразой, и сайтом полиаденилирования. В предпочтительном варианте осуществления изобретения гетерологичная кодирующая последовательность фланкируется вирусными последовательностями, которые включают промоторы репликации у 5'- и 3'-концов, последовательности начала и конца гена и сигналы упаковки, которые н