Молекулярный контроль сегрегации трансгенов и их утечки с использованием системы возмещаемого блокирования функции

Молекулярный контроль сегрегации трансгенов и их утечки с использованием системы возмещаемого блокирования функции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к усовершенствованному способу и комплексу ДНК-конструкций, называемых здесь системами возмещаемого блокирования функции (RBF), для получения увеличенного уровня безопасности в контроле сегрегации трансгенов и "утечки" трансгенов, в том числе интрогрессии. Эти способ и система позволяют также фермерам повторно использовать их трансгенную сельскохозяйственную культуру без риска утечки трансгенов в окружающую среду. Повышенный уровень надежности достигается с использованием систем возмещаемого блокирования функции (RBF), включающих в себя одну или более блокирующих нуклеотидных конструкций (ВС), тесно связанных с представляющим интерес геном (TGI), причем эту блокирующую конструкцию встраивают в интрон представляющего интерес гена (TGI), если используют одну блокирующую конструкцию (ВС), или она находится между двумя блокирующими конструкциями (ВС), если используют более чем одну блокирующую конструкцию, а также одну или более восстанавливающих конструкций (RC), т.е. нуклеотидных конструкций для восстановления блокированной функции при контролируемом пользователем химическом, физическом или механическом вмешательстве.

Данное изобретение относится не только к способу, но также к системам возмещаемого блокирования функции (RBF), a также к их применению в получении векторов, клеток, клеточных линий и/или трансгенных размножающихся половым путем многоклеточных организмов (SRMO), в частности растений и некоторых животных, таких как рыба, мелкие ракообразные, моллюски и т.д.

Уровень техники

На протяжении нескольких последних лет безопасность получения трансгенных сельскохозяйственных культур была причиной большой озабоченности среди общественности в целом и она привлекала большое внимание также и сообщества ученых. В нескольких публикациях сообщалось, что пыльца трансгеных растений распространяется с полевых участков. Наиболее проблематичными являются трансгеные сельскохозяйственные виды, которые имеют дикие родственные формы, с которыми они могут гибридизоваться в природе, если им удалось ускользнуть, но важно также предупреждать и контролировать скрещивание между различными, но родственными трансгенными или нетрансгенными сельскохозяйственными растениями или родственными дикими типами, т.е. сохранять чистоту зародышевых линий. Группы риска были найдены среди определенных сельскохозяйственных видов, например кукурузы, некоторых масличных растений, таких как Brassicae, но также среди деревьев, которые являются специфической проблемой вследствие их большой продолжительности жизни и большого продуцирования пыльцы. Даже если эта проблема ограничена в настоящее время растениями, существует вероятность, что подобные проблемы встретятся, когда животные станут более серьезными мишенями в трансгенных способах получения. Рыба, мелкие ракообразные, домашняя птица, овцы и т.д. являются уже возможными в качестве трансгенных животных. Вероятно также, что большой диапазон модификаций будет применен к трансгенным растениям в будущем, что усиливает потребность в предупреждении утечки трансгенов.

Хотя опасности для здоровья человека или животного конкретного трансгена и его продукта могут быть испытаны и измерены, влияние утечки генов оценить более сложно. С другой стороны, потенциальные возможности улучшения сельскохозяйственных культур с использованием способов рекомбинантных ДНК являются настолько огромными, что более продуктивно и выгодно с точки зрения расходов найти решения для предупреждения утечки или ускользания генов, чем запрещать применение трансгенеза.

Вследствие большого влияния трансгенеза и беспокойств, возникающих в отношении утечки трансгенов, несколько подходов для решения этой проблемы были представлены в предшествующей литературе. Эти первые подходы включали в себя растения со сконструированной стерильностью и контролем прорастания семян, называемых также «терминаторной технологией», предпринятой фирмой Monsanto (Патент США 5723765). Были опубликованы также несколько сообщений о применении условных летальных факторов, также называемых суицидными генами. Гены ослабления, т.е. гены, ослабляющие селективные преимущества трансгенов в сорняках, были предложены для использования в контроле утечки трансгенов (Gressel, J., (1999), Tibtech. 17: 361-366).

Применение полученной генной инженерией мужской или женской стерильности исследовалось несколькими группами. В способе мужской стерильности (MS) предотвращалось опыление, например, остановкой синтеза мРНК. Опыление может быть восстановлено экспрессией ингибитора РНКазы. В указанном случае фактор восстановления (RF) переносится опыляющей линией. Эти два элемента, MS и RF, присутствуют в двух различных индивидуальных растениях. Только гибрид этих двух растений-индивидуумов несет как блокирующий, так и восстанавливающий факторы и посредством этого является фертильным. Таким образом, способ мужской стерильности направлен на поддержание образования гибридных семян. Однако мужская стерильность не предотвращает утечки трансгена в окружающую среду, так как опыленные женские (MS) растения все еще способны к продуцированию гибридных семян, которые при осыпании остаются в поле после сбора урожая.

Полученный генной инженерией контроль фертильности достигался также в трансгенном Brassica napus экспрессией гена РНКазы под контролем специфического для выстилающего слоя (тапетума) пыльника промотора табака (De Block and Debrouwer, (1993), Planta, 189: 218-225). Экспрессия гена РНКазы в клетках тапетума пыльника убивает пыльцу на ранних стадиях развития. Опыление цветков с мужской стерильностью пыльцой трансгенных растений В. napus, экспрессирующей ген РНКазы под контролем того же самого промотора, восстанавливает признак мужской стерильности (MS), и эти гибридные растения не могут продуцировать нормальную фертильную пыльцу с экспрессией этих двух генов. Патент США 5750867 описывает сохранение растений с мужской стерильностью. Патент США 5767374 описывает сходный способ для растений с женской стерильностью (FM), в котором ген рибонуклеазы экспрессируется в клетках тычинок женских родительских растений, и экспрессия этого гена-убийцы в гибридных растениях восстанавливается экспрессией гена-восстановителя, поступающего из опыляющей родительской линии. Этот блокирующий ген экспрессируется в женских органах родительского растения, тогда как пыльца остается фертильной. Предполагается, что растения с женской стерильностью (FS) должны опыляться растениями с мужской стерильностью (MS) для получения гибридных семян.

В патенте США 572892 описан способ на основе экспрессии антисмысловой мРНК гена, жизненно важного для развития пыльников. Эта антисмысловая молекула экспрессируется одновременно со смысловой молекулой, причем экспрессия обеих из них запускаются одним и тем же промотором. Одновременная экспрессия гена со смысловой и антисмысловой ориентацией обеспечивает механизм молчания, который предотвращает развитие пыльников. В патенте США 6013859 описан способ гибридизации. Блокирование обеспечивается двумя последовательными ферментативными реакциями в пыльниках или микроспорах. Опыляющая родительская линия сообщает устойчивость к селективному маркеру (гербициду). Патент США 6005167, в свою очередь, описывает способ, который использует антисмысловой способ для обеспечения мужской или женской стерильности на основе блокирования экспрессии халконсинтазы в развивающемся пыльнике или другой части цветка. Халконсинтаза является ключевым ферментом в синтезе флаваноидов. Блокирование экспрессии этого гена приводит к необратимому блокированию оплодотворения.

В патенте США 5723765 описан способ прекращения прорастания или функции семян. Этот способ предусматривает активацию функции ингибированного блокирующего гена посредством вырезания специфической последовательности ДНК между промотором и блокирующим или терминаторным геном специфическим ферментом Cre-рекомбиназой, кодируемым другим геном, помещенным под контроль Tet-репрессируемого промотора. Семена трансгенных растений, не обработанные тетрациклином, способны прорастать в природных условиях. Если эти трансгенные семена обрабатывают тетрациклином, ген, кодирующий Cre-рекомбиназу, активируется и вырезает ДНК-инсерт между промотором Lea и геном токсина. Посредством этого блок удаляется и токсин активируется. Этот токсин не убивает растение сразу же, так как экспрессия должна инициироваться только во время поздней стадии эмбриогенеза под действием промотора Lea.

Идея, описанная в патенте США 5723765, предполагает ингибирование развития семян во втором поколении. Без механизма супрессии ген-«убийца» активируется во время поздних стадий развития зародыша потомства, и, следовательно, семена следующего поколения не прорастают. Фундаментальной проблемой указанного способа является то, что как только эти растения обрабатывали тетрациклином, т.е. ген-убийца активировался, они не могли быть спасены. Кроме того, если указанное трансгенное растение, несущее восстанавливаемую тетрациклином конструкцию, ускользает в окружающую среду, оно способно прорастать, вырастать до зрелого состояния, цвести и размножаться половым путем. Другими словами, не предупреждается утечка трансгена из трансгенных растений. Указанная так называемая «терминаторная технология» встретила негативное внимание общественности, так как она дает производящим эти семена компаниям возможность контролировать рынок производства трансгенных семян.

Международная патентная заявка WO 94/03619 описывает контроль роста трансгенного растения посредством химической активации или «генного переключения». Переключенный ген продуцирует репрессор, который может инактивировать экспрессию «гена-разрушителя». При применении химической индукции гена-репрессора ген-разрушитель репрессируется. Если ген репрессора не активируется, ген-разрушитель разрушает данную клетку и функции данного растения. Механизм репрессии может включать в себя репрессорный белок, в том числе систему промотора и оператора. Альтернативно, репрессор может присутствовать в виде гена, кодирующего ингибитор гена, кодирующего белок-разрушитель. «Химический переключатель», описанный в WO 94/03619, может быть также использован для контроля активности гена рекомбиназы, который может удалять последовательность ДНК, фланкированную свитами узнавания рекомбиназы. Фермент рекомбиназа удаляет часть гена данного признака и блокирует функцию ценного добавленного признака.

Международная патентная заявка WO 00/37660 описывает способы и генетические композиции для ограничения ауткроссинга и перетекания нежелательного гена в сельскохозяйственные растения. WO 00/37660 описывает генетическую систему, содержащую две ДНК-конструкции, репрессируемый доминантный летальный ген и репрессорный ген, который локализован в локусе, сегрегирующемся независимо от репрессируемого доминантного летального гена. Описана также сложная система клонирования и селекции для сконструированных растений, содержащих репрессируемый летальный ген и репрессорный ген в различных сестринских хромосомах.

Патент США 5498533 описывает регуляцию развития картофеля экспрессией смысловых и антисмысловых конструкций гена кальмодулина. Экспрессия гена кальмодулина в смысловой ориентации увеличивает рост побегов и клубней, тогда как растения, несущие антисмысловые конструкции, проявляют уменьшенный рост побегов и клубней, в то время как экспрессия антисмыслового гена кальмодулина может быть использована в качестве фактора, блокирующего физиологическую функцию.

Gressel (1999) в его обзоре (Tibtech, 17: 361-366) описывает несколько применений существующих и гипотетических систем на основе способа тандемного трансгенетического ослабления (ТМ), который может быть использован для предупреждения появления суперсорняков. ТМ-гены являются позитивными или нейтральными в отношении сельскохозяйственной культуры, но вредными для сорняка. ТМ-гены могут изменять морфологию или физиологию сорняка обеспечением покоя семян, раннего или позднего созревания семян, карликовости растений, а также других признаков, которые ослабляют эволюционную адаптированность произвольных сорняков в сравнении с родительским штаммом. Однако гены ослабления не могут полностью предотвращать утечку трансгенов, так как они не являются летальными и даже не являются вредными для сельскохозяйственных растений. Таким образом, технология трангенетического ослабления не предотвращает скрещивания между различными линиями одних и тех же сельскохозяйственных культур.

Эффект ослабления генов обычно достигается только после пролонгированных периодов негативного отбора, во время которых возможные образования молчащих генов или мутации в ослабляющих генах уменьшают их действие и вследствие этого действуют против предотвращения утечки трансгенов. В обзорной статье Gressel (1999) предлагает применение тандемных конструкций, содержащих два гена ослабления, для уменьшения возможности утечки трансгенов. Тандемы генов ослабления не решают проблемы скрещивания между различными линиями родственных сельскохозяйственных растений. Молчание или мутации в одном гене ослабления уменьшают действие давления негативного отбора.

Большинство систем, предназначенных для обеспечения контроля утечки трансгенных растений, были описаны как невозмещаемые. Другими словами, они не могут быть повторно использованы после применения системы восстановления. Дополнительным недостатком в некоторых из вышеописанных систем является то, что они требуют вегетативного размножения, поскольку прекращается оплодотворение или развитие зародыша.

Таким образом, ситуация контроля далека от идеальной, несмотря на множество различных подходов, предложенных в предшествующем уровне знаний. Требуются другие и более эффективные способы и системы для решения данной проблемы. При использовании ослабляющих генов можно сделать вывод, что с ослабляющими генами не достигается достаточная безопасность. Требуются летальные или вызывающие стерильность гены. Прежние системы, применяющие летальные или вызывающие стерильность гены, были описаны и использованы, но они не могут гарантировать достаточные уровни надежности, в частности, при необходимости более продолжительных периодов селекции. Например, предыдущие способы и системы не отвечают на следующий вопрос: Что происходит в часто встречающихся случаях, когда инактивированы летальные гены, гены-разрушители или блокирующие гены? Можно ожидать, что летальные или вызывающие стерильность гены становятся молчащими или мутированными с частотой около 10^-6, что делает возможной небольшую, но допускаемую утечку трансгенов. Кроме того, некоторые из прежних систем, использующих летальные или вызывающие стерильность гены, требуют нежелательных стадий, таких как распространение химикалиев в окружающую среду. Это не очень хорошо воспринимается пользователями или общественностью в целом. Можно упомянуть также отсутствие возможности повторного использования сельскохозяйственной культуры.

Основной целью данного изобретения является обеспечение повышенного уровня безопасности для контроля интрогрессии или сегрегации (расщепления) и утечки трансгенов в окружающую среду.

Дополнительной целью данного изобретения является предоставление фермеру точных инструкций по повторному использованию его сельскохозяйственной культуры.

Следующей целью данного изобретения является обеспечение системы, в которой действия генов, имеющих блокирующий эффект, могут быть восстановлены без применения химикалиев, и, если химикалии должны быть использованы, это восстановление может быть проведено в ограниченных условиях (в закрытом помещении).

Сущность изобретения

Повышенный уровень безопасности для контроля сегрегации трансгенов и утечки в окружающую среду достигается посредством способа и/или системы, включающих комплекс конструкций ДНК, содержащих одну или несколько блокирующих конструкций (ВС), содержащих гены, способные блокировать одну или несколько функций, которые являются существенными для выживания и полового размножения трансгенного организма. Повышенный уровень безопасности достигается включением в реципиентный организм или размножающийся половым способом многоклеточный организм (SRMO) в форме одного или нескольких трансгенных инсертов (TI) или ДНК-кассет, одной или нескольких блокирующих конструкций (ВС), которые могут быть помещены в интрон представляющего интерес гена (TGI) или могут быть помещены в тесной близости с трансгенным инсертом (TI), содержащим один или несколько представляющих интерес трансгенов (TGI).

Функция, блокированная этой блокирующей конструкцией (ВС), предпочтительно восстанавливается контролируемым пользователем вмешательством, которое не присутствует в природных условиях. Если происходит ауткроссинг трансгенного организма, функция, которая является существенной для выживания или полового размножения, блокируется. Контролируемое пользователем вмешательство является таким, что оно может быть повторено не только один раз, но и несколько раз, и предпочтительно это вмешательство не требует химических вмешательств, которые должны проводиться в окружающей среде.

Повышенный уровень безопасности, в сравнении с предыдущими способами и системами, достигается конкретно с использованием двух или нескольких блокирующих конструкций (ВС), помещенных на каждой стороне трансгенного инсерта (TI), содержащего один или несколько представляющих интерес трансгенов (TGI), или помещением блокирующей конструкции (ВС) в интроне представляющего интерес трансгена (TGI).

Таким образом, данное изобретение относится к способу увеличения уровня надежности для контроля сегрегации трансгенов и предупреждения утечки трансгенов в окружающую среду с использованием молекулярного механизма контроля, предусматривающего стадии конструирования одного или нескольких комплексов ДНК-конструкций, называемых здесь системами возмещаемого блокирования функции (RBF), содержащих, кроме одного или нескольких представляющих интерес трансгенов (TGI), одну или несколько блокирующих конструкций (ВС), расположенных в тесной близости с представляющим интерес трансгеном (TGI), предпочтительно в интроне представляющего интерес трансгена (TGI), или при использовании более чем одной блокирующей конструкции (ВС), между указанными блокирующими конструкциями (ВС), и по меньшей мере одно средство для восстановления, или восстанавливающий инструмент, т.е. контролируемое пользователем средство или вмешательство для восстановления блокированных функций. Указанная блокирующая конструкция (ВС) обладает способностью блокировать по меньшей мере одну функцию, существенную для выживания и/или полового размножения размножающегося половым способом многоклеточного организма (SRMO).

Нуклеотидная последовательность или ген, обеспечивающие блокирующий эффект в блокирующей конструкции (ВС), либо является представляющим интерес трансгеном (TGI), либо является тесно связанным с по меньшей мере одним представляющим интерес трансгеном (TGI), кодирующим желаемый трансгеный продукт. Восстановление блокированных функций предусматривает по меньшей мере одно контролируемое пользователем вмешательство, необязательно объединенное с одной или несколькими восстанавливающими конструкциями (RC). Этот контроль имеет место автоматически посредством негативного отбора в поколениях после первого ускользнувшего гибридного поколения, содержащего представляющий интерес ген (TGI).

Присутствие восстанавливающей конструкции (RC) в технологии возмещаемого блокирования функции (RBF) данного изобретения позволяет использовать в блокирующей конструкции (ВС) трансгены, которые могут быть летальными или вызывать стерильность в растении-хозяине. Применение таких генов делает негативный отбор, требуемый для того, чтобы этот эффект имел место, абсолютным и укорачивает необходимое время для негативного отбора в сравнении с негативным отбором в технологии ослабления генов. Уровень безопасности систем возмещаемого блокирования функции (RBF) с использованием двойных блокирующих конструкций (ВС) увеличивается, так как молчание или мутация в одной из блокирующих конструкций (ВС) не уменьшает действие второй блокирующей конструкции (ВС). Альтернативно, уровень безопасности систем возмещаемого блокирования функции (RBF) данного изобретения может быть увеличен введением блокирующей конструкции (ВС) в интрон представляющего интерес трансгена (TGI). Это уменьшает возможности того, что блокирующая конструкция (ВС) также инактивируется посредством кроссинговера или мутирует, без вредных эффектов в отношении представляющего интерес трансгена. Таким образом, комбинирование концепции систем возмещаемого блокирования функции (RBF) с системой множественной, т.е. двойной или тройной и/или введенной в интрон, блокирующей конструкции (ВС) обеспечивает существенно увеличенный уровень надежности в контроле сегрегации (расщепления) трансгенов и утечки трансгенов, чтобы сделать эту систему выполнимой в ДНК-технологии трансгенных растений и животных на практике.

Трансгенный размножающийся половым способом многоклеточный организм (SRMO) в конечном счете предохраняется от полового размножения или продуцирования жизнеспособного потомства блокирующей конструкцией (ВС), которая в природных, неконтролируемых условиях прекращает функцию, которая является существенной для выживания или размножения указанного размножающегося половым способом многоклеточного организма (SRMO). Эта блокированная функция может быть восстановлена для того, чтобы сделать возможными нормальное развитие, пролиферацию, рост и половое размножение для целей сельского хозяйства, садоводства, лесоводства или любых других возможных целей с использованием по меньшей мере одного контролируемого пользователем вмешательства, которое в чувствительный для этого момент в цикле развития размножающегося половым способом многоклеточного организма (SRMO) восстанавливает блокированную функцию. Указанное средство для восстановления функции предусматривает внешнюю, контролируемую пользователем стадию обработки или манипуляции, в том числе химическое, физическое или механическое вмешательство, которое восстанавливает или разблокирует блокированную функцию.

Трансген предохраняется от утечки в окружающую среду посредством гибридизации или ауткроссинга родительского трансгенного размножающегося половым способом многоклеточного организма (SRMO) с его родственными формами дикого типа или другими культивируемыми нетрансгенными или трансгенными родственными формами с использованием функции комплекса блокирующих конструкций (ВС), которая в природных условиях прекращает существенную функцию трансгенного размножающегося половым способом многоклеточного организма (SRMO) или любых гибридов, несущих указанную блокирующую конструкцию (ВС) до тех пор, пока не будет обеспечено контролируемое пользователем вмешательство извне. Этот контроль сегрегации быстро приводит к исчезновению трансгена в природе.

Данное изобретение обеспечивает комплекс ДНК-конструкций для предотвращения сегрегации и утечки трансгенов в размножающемся половым способом многоклеточном организме (SRMO) в окружающую среду. Указанный комплекс ДНК-конструкций, называемый здесь системой возмещаемого блокирования функции (RBF), содержит одну или несколько единиц блокирующих конструкций (ВС), содержащих по меньшей мере одну нуклеотидную последовательность, способную блокировать молекулярную или физиологическую функцию, которая является существенной для выживания и/или размножения трансгенного размножающегося половым способом многоклеточного организма (SRMO).

Ген указанной нуклеотидной последовательности в блокирующей конструкции (ВС) может быть альтернативно представляющим интерес трансгеном (TGI), т.е. он может быть нуклеотидной последовательностью, образующей самоконтролирующее образование. Предпочтительно он может быть помещен в тесно связанном виде в непосредственной близости или в соседстве с представляющим интерес трансгеном (TGI), либо в интроне, либо между двумя блокирующими конструкциями (ВС). Система возмещаемого блокирования функции (RBF) может также содержать одну или несколько необязательных восстанавливающих конструкций (RC), которые помещены вблизи от блокирующих конструкций (ВС) или в неаллельных хромосомах. Восстанавливающие конструкции (RC) не должны помещаться в сестринской хромосоме хромосомы, содержащей представляющий интерес трансген (TGI), фланкированный блокирующими конструкциями (ВС), или с блокирующими конструкциями (ВС), встроенными в интрон представляющего интерес трансгена (TGI). Восстанавливающие конструкции (RC) являются регулируемыми внешним, контролируемым пользователем, искусственным вмешательством. Другими словами, система возмещаемого блокирования функции (RBF) может функционировать с восстанавливающей конструкцией (RC) или без восстанавливающей конструкции до тех пор, пока некоторые внешние средства или вмешательства, контролируемая пользователем обработка для восстановления не станут доступными и не смогут быть применены.

Трансгенный размножающийся половым способом многоклеточный организм (SRMO) предохраняется от размножения прекращением прилагаемого пользователем вмешательства, которое предотвращает действие блокирующей конструкции (ВС). Это действие, например ауткроссинг, прекращает и/или изменяет существенную функцию, действуя на выживание, развитие и/или половое размножение трансгенного размножающегося половым способом многоклеточного организма (SRMO).

Блокированная функция восстанавливается в чувствительный для этого момент роста или цикла развития размножающегося половым способом многоклеточного организма (SRMO), чтобы позволить нормальный рост и размножение указанного организма для целей продуцирования, в том числе для применений в сельском хозяйстве, плодоовощном хозяйстве, лесоводстве и/или промышленности, путем применения по меньшей мере одного применимого извне искусственного и контролируемого пользователем вмешательства.

Если трансгенный размножающийся половым способом многоклеточный организм (SRMO) склонен к интербридингу или ауткроссингу с его культивируемыми родственными формами дикого типа, сегрегация трансгена контролируется и/или утечка указанного трансгена в природу предотвращается тем фактом, что в природе не обеспечивается вмешательство или обработка, которая устраняла бы негативные эффекты блокирующей конструкции (ВС). Таким образом, в природных условиях прекращается по меньшей мере одна существенная молекулярная или физиологическая функция трансгенного размножающегося половым способом многоклеточного организма (SRMO), которая предотвращает половое размножение.

В способе данного изобретения функция, влияющая на выживание размножающегося половым способом многоклеточного организма-хозяина (SRMO) или его цикл развития или репродуктивный цикл, характеризуется прекращением развития, изменением фенотипа или морфологии трансгенного размножающегося половым способом многоклеточного организма (SRMO) органоспецифическим, пространственно-временным или конститутивным образом так, что предотвращается выживание или половое размножение.

Подходящим моментом для удаления блокирующего эффекта или восстановления от блокирующего эффекта посредством стадии внешнего, искусственного и контролируемого пользователем вмешательства или обработки является чувствительные для этого момент или стадия в цикле развития размножающегося половым способом многоклеточного организма (SRMO), причем в этот момент органоспецифическое, пространственно-временное или конститутивное морфологическое изменение предохраняет размножающийся половым способом многоклеточный организм (SRMO) от свободной гибридизации или скрещивания и тем самым от полового размножения в природных условиях. Такими чувствительными моментами являются, например, раннее или позднее прорастание семян, цветение, неспособность образования соцветия, цветков или плодов и/или образование карликового фенотипа, в частности, когда блокирующая конструкция (ВС) содержит нуклеотидную последовательность, экспрессия которой блокирует существенную молекулярную или физиологическую функцию или вызывает морфологическое изменение, предотвращающее свободную гибридизацию и/или размножение. Блокирование имеет место на уровне ДНК, мРНК, белка или метаболита и приводит к некрозу, фенотипическому или физиологическому изменению, такому как раннее или позднее прорастание семян, отсутствие роста и/или вегетации, неспособность образования цветков, соцветий, цветков или плодов, образование карликового фенотипа и т.д.

Блокирующая конструкция (ВС) может быть помещена в интроне нуклеотидной последовательности представляющего интерес трансгена (TGI) или две или несколько блокирующих конструкций (ВС) помещают на каждой стороне трансгенного инсерта (TI), содержащего один или несколько представляющих интерес трансгенов (TGI). Если две блокирующие конструкции (ВС) являются одинаковыми или различными и восстанавливаемыми одинаковыми или различными механизмами восстановления, их помещают на обеих сторонах представляющей интерес нуклеотидной последовательности (TGI) в системе множественного, т.е. двойного или тройного возмещаемого блокирования функции (M-RBF, D-RBF или T-RBF). В противоположность этому, восстанавливающая конструкция (RC) должна быть помещена в один и тот же SRMO, но предпочтительно в различных неаллельных хромосомах, что приводит к системе сегрегирующего возмещаемого блокирования функции (S-RBF).

В системах множественного возмещаемого блокирования функции (M-RBF) первую восстанавливающую конструкцию (RC₁) помещают вблизи от второй блокирующей конструкции (BC₂) в первом трансгенном инсерте (TI). Помещенный во второй неаллельной хромосоме комплекс вторая восстанавливающая конструкция - первая блокирующая конструкция (RC₂-BC₁) контролирует данный трансгенный инсерт (TI) и этот первый трансгенный инсерт (TI) контролирует второй трансгенный инсерт (TI), соответственно. Комплекс представляющий интерес трансген-блокирующие конструкции (BC₁-TGI-BC₂) контролирует другой комплекс представляющий интерес трансген-блокирующая конструкция (TGI-BC) с увеличенной надежностью и негативным отбором представляющего интерес трансгена (TGI).

В данном изобретении рассматриваются также клонирующие векторы, т.е. ДНК-кассеты, и клетки или клеточные линии для удобного получения трансгенных растений или трансгенных животных (за исключением человека), несущих один или несколько трансгенных инсертов (TI), контролируемых системами возмещаемого блокирования функции (RBF) данного изобретения. Также представлен новый сайт поликлонирования, показанный в SEQ ID NO:4, для удобного инсертирования представляющих интерес трансгенов (TGI) и других блокирующих и восстанавливающих конструкций (ВС и RC). Описаны также синтетические нуклеотидные последовательности, которые адаптированы либо для инсертирования в интроны представляющих интерес трансгенов (TGI), либо для фланкирования представляющих интерес трансгенов (TGI) и для инсертирования в модельные растения и/или в модельных животных.

Характерные признаки данного изобретения определены более подробно в формуле изобретения.

Подробное описание чертежей

Фиг.1 является схематическим представлением молекулярных конструкций, используемых в системах простого возмещаемого блокирования функции (RBF). Эти конструкции представлены в деталях (верхний ряд) для демонстрации принципов помещения генов и на более общем уровне (средний и нижний ряды). Блоки промоторов, представленные остриями стрелок, показывают направление этих генных последовательностей. Аббревиатуры: р - промотор, 3'-конец - 3'-конец гена или сайта сигнала полиаденилирования; as - антисмысловая.

Фиг.1а представляет конструкцию, описанную в примере 1.

Фиг.1b представляет конструкцию, описанную в примере 2.

Фиг.2 представляет молекулярные конструкции, используемые в системе возмещаемого блокирования функции (RBF) и описанные в примере 3. Эти конструкции представлены в деталях (верхний ряд) для демонстрации принципов помещения генов и на более общем уровне (средний и нижний ряды). Блоки промоторов, представленные остриями стрелок, показывают направление этих генных последовательностей. Аббревиатуры: р - промотор, 3'-конец - 3'-конец гена или сайта сигнала полиаденилирования.

Фиг.3. Нозерн-блот-анализ экспрессии барназы (бактериальной рибонуклеазы) и barstar (ингибитора барназы) в трансгенном табаке во время созревания зародыша, прорастания семян и с обработкой тепловым шоком и без обработки тепловым шоком. Гены барназы и barstar используются в качестве блокирущего и восстанавливающего генов, соответственно, в системе возмещаемого блокирования функции (RBF).

Фиг.3а показывает экспрессию мРНК барназы в зародышах табака на средней стадии (беловатые зародыши) и поздней стадии (желтоватые зародыши) эмбриогенеза. 10 мг тотальной РНК наносили на каждую дорожку. Тотальную РНК из нетрансгенных зародышей и 0,1, 0,3 и 1,0 пг синтезированной РНК барназы, смешанной с 10 мг тотальной РНК из нетрансформированных зародышей табака, использовали в качестве контролей. Экспрессия мРНК барназы составляла на средней стадии эмбриогенеза 0,1 пг/мг тотальной РНК, а на поздней стадии эмбриогенеза 0,03 пг/мг тотальной РНК.

Фиг.3b показывает экспрессию мРНК барназы в проростках табака. 10 мг тотальной РНК наносили на каждую дорожку. Тотальную РНК из нетрансгенных зародышей и 0,2, 0,5 и 1,0 пг синтезированной РНК барназы, смешанной с 10 мг тотальной РНК из нетрансформированных зародышей табака, использовали в качестве контролей. Экспрессия мРНК барназы начиналась на третий день прорастания, достигала максимума 0,04 пг/мг тотальной РНК на четвертый день и угасала на пятый день прорастания. На блоте были обнаружены также две неспецифические полосы хлоропластной рибосомной РНК.

Фиг.3с показывает экспрессию мРНК barstar после теплового шока (h.s.) и без теплового шока. 10 мг тотальной РНК наносили на каждую дорожку. 0,5, 2,0 и 10,0 пг синтезированной РНК barstar, смешанной с 10 мг тотальной РНК из нетрансгенных контрольных зародышей табака, использовали в качестве положительного контроля. Обработка тепловым шоком активировала экспрессию мРНК барназы до 1-3 пг/мг тотальной РНК как в стадии эмбриогенеза, так и в стадии прорастания во время развития. Экспрессия мРНК barstar под контролем промотора теплового шока HSp была растекающейся без температурной обработки, на уровне 0,05-0,2 пг/мг тотальной РНК.

Фиг.4 представляет молекулярные конструкции, используемые в системе возмещаемого блокирования функции (RBF) и описанные в примере 4. Эти конструкции представлены в деталях (верхний ряд) для демонстрации принципов помещения генов и на более общем уровне (средний и нижний ряды). Блоки промоторов, представленные остриями стрелок, показывают направление этих генных последовательностей. Аббревиатуры: р - промотор, 3'-конец - 3'-конец гена или сайта сигнала полиаденилирования. Конструкции I и II являются инсертами в различных неаллельных хромосомах и показаны раздельно.

Фиг.5 представляет молекулярные конструкции, используемые в системе возмещаемого блокирования функции (RBF) и описанные в примере 5. Эти конструкции представлены в деталях (верхний ряд) для демонстрации принципов помещения генов и на более общем уровне (средний и нижний ряды). Блоки промоторов, представленные остриями стрелок, показывают направление этих генных последовательностей. Конструкции I и II являются инсертами в различных неаллельных хромосомах и показаны раздельно. Аббревиатуры: р - промотор, 3'-конец - 3'-конец гена или сайта сигнала полиаденилирования.

Фиг.5а показывает конструкцию в хромосоме I в деталях и на более общем уровне.

Фиг.5b показывает конструкцию в хромосоме II в деталях и на более общем уровне.

Фиг.6 представляет последовательность гена барназы, помещенную