Вакцина против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота эмульсионная инактивированная

Вакцина против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота эмульсионная инактивированная

Реферат

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении средств специфической профилактики инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота (КРС).

ИРТ - остро протекающая контагиозная болезнь КРС вирусной этиологии, наносящая значительный экономический ущерб скотоводству.

Вирус ИРТ вызывает заболевание КРС различных возрастных групп, проявляющееся пятью формами: поражением верхних дыхательных путей, вагинитами, энцефалитами, конъюнктивитами и артритами. Кроме того, у телят возможна пневмония.

Болезнь широко распространена во всем мире, В США в 1954-1956 гг. она протекала как эпизоотия с большим экономическим ущербом. Частые случаи ИРТ отмечены в Канаде, Южной Африке, Новой Зеландии, Австралии, Англии, Германии, Франции, Швеции, Швейцарии, Австрии, Италии, Румынии и других странах. В нашей стране ИРТ был впервые диагностирован в 1968 г. и подтвержден вирусологически в 1969 г. в связи с ввозом различных пород КРС из некоторых вышеуказанных стран, неблагополучных по данной инфекции.

Экономический ущерб, наносимый ИРТ, слагается из снижения удоев в период болезни (до 50-60%), значительного увеличения сервис-периода и яловости коров, болевших вагинальной формой, слабого развития больного молодняка и значительным процентом гибели и выбраковки телят. При хронической серозно-гнойной пневмонии погибает до 20% молодняка.

Вакцинопрофилактика ИРТ занимает ведущее место в комплексе противоэпизоотических мер, направленных на борьбу с этим заболеванием. Для профилактики ИРТ применяют как живые, так и инактивированные вакцины, полученные из вируса, репродуцированного в различных культурах клеток (1, 2, 3).

Использование живых вакцин во многих случаях приводит к развитию заболевания вследствие их повышенной реактивности или обострения латентной инфекции, может вызывать аборты, поражения яичников, иммуносупрессию, длительную персистенцию и выделение вакцинного вируса во внешнюю среду. По этой причине они не нашли широкого применения.

В настоящее время для специфической профилактики ИРТ КРС широко используют инактивированные вакцины как сорбированные, так и эмульсионные.

Известна вакцина против ИРТ КРС эмульсионная инактивированная, содержащая антигенный материал из штамма "Купер" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в культуре клеток легкого КРС, из инактивантов формальдегид и масляный адъювант в эффективном соотношении (4).

Известна вакцина против ИРТ КРС эмульсионная инактивированная, содержащая антигенный материал из штамма "ТК-А (ВИЭВ) В-2" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в первично-трипсинизированных культурах клеток почки теленка (ПТ) или тестикулов бычков (ТБ), из инактивантов формальдегид и масляный адъювант в эффективном соотношении (5).

Известна вакцина против ИРТ КРС эмульсионная инактивированная, содержащая антигенный материал из штамма "Щапово" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в первично-трипсинизированных культурах клеток ПТ или ТБ, из инактивантов формальдегид и масляный адъювант в эффективном соотношении (6).

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ИРТ КРС сорбированная инактивированная, содержащая антигенный материал из штамма "ТК-А" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток почки теленка MDBK, из инактивантов теотропин и масляный адъювант в эффективном соотношении (7).

Основные недостатки вышеуказанных вакцин, в том числе и вакцины-прототипа, состоят в их низкой антигенной и иммуногенной активности по причине нестабильности при инактивации используемых штаммов вируса ИРТ КРС и нередко высокой реактогенности за счет входящих в их состав адъювантов.

Сложившаяся в России система профилактики ИРТ КРС предусматривает двукратную иммунизацию после или во время перегруппировки животных, которую проводят в возрасте 30-40 дней, то есть в период, когда большинство животных уже инфицированы. Применению известных в настоящее время в России вакцин в более ранние сроки препятствует высокий уровень колостральных антител в крови телят.

В связи с этим актуальной остается проблема создания инактивированной эмульсионной вакцины против ИРТ КРС, обладающей высокой биологической, антигенной, иммуногенной активностью и безвредностью, пригодной для иммунизации животных всех половозрастных групп.

В задачу создания настоящего изобретения входили поиск, отбор и изучение эпизоотических изолятов вируса ИРТ КРС в целях получения новых производственных штаммов вируса ИРТ КРС, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью и сохраняющих свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации, и разработка на их основе высокоиммуногеннных, безвредных, инактивированных, эмульсионных вакцинных препаратов, способных защитить поголовье КРС от эпизоотического возбудителя ИРТ КРС, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении антигенной и иммуногенной активности вакцины и ее безвредности, а также в расширении арсенала средств специфической профилактики ИРТ КРС.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ИРТ КРС эмульсионной инактивированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков:

1. Вакцина против ИРТ КРС эмульсионная инактивированная.

2. Антигенный материал из возбудителя ИРТ КРС, репродуцированного в чувствительной биологической системе и подвергнутого инактивации, в эффективном количестве.

2.1. В качестве антигенного материала из возбудителя ИРТ КРС антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС.

2.2. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток и подвергнутого инактивации.

2.3. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и инактивированного аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ).

2.4. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

2.5. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 30,0 мас.%.

2.6. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK и инактивированного АЭЭИ.

2.7. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

2.8. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 30,0 мас.%.

2.9. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ (перевиваемая культура клеток гонад 3-дневной козы, ВСКК(СХЖ) РАСХН №45; пат. РФ №2061753, МПК 6 С 12 N 5/06, 7/00; 10.06.96 г.) и инактивированного АЭЭИ.

2.10. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

2.11. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 30,0 мас.%.

3. Масляный адъювант.

3.1. Из масляных адъювантов масляный адъювант Montanide ISA-70.

3.2. Масляный адъювант Montanide ISA-70 в эффективном количестве.

3.3. Масляный адъювант Montanide ISA-70 в количестве 70,0 мас.%.

4. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток, взятой из группы, состоящей из перевиваемой культуры клеток ВНК-21, перевиваемой культуры клеток MDBK и перевиваемой культуры клеток 3КГ, с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, и масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	30,0
Масляный адъювант	До 100,0

Предлагаемое изобретение включает совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ИРТ КРС эмульсионная инактивированная.

2. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в чувствительной биологической системе и подвергнутого инактивации, в эффективном количестве.

3. Масляный адъювант.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток и подвергнутого инактивации.

2. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и инактивированного АЭЭИ.

3. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

4. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 30,0 мас.%.

5. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK и инактивированного АЭЭИ.

6. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

7. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 30,0 мас.%.

8. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ и инактивированного АЭЭИ.

9. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

10. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 30,0 мас.%.

11. Из масляных адъювантов масляный адъювант Montanide ISA-70.

12. Масляный адъювант Montanide ISA-70 в эффективном количестве.

13. Масляный адъювант Montanide ISA-70 в количестве 70,0 мас.%.

14. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток, взятой из группы, состоящей из перевиваемой культуры клеток ВНК-21, перевиваемой культуры клеток MDBK и перевиваемой культуры клеток 3КГ, с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, и масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	30,0
Масляный адъювант	До 100,0

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:

1. Вакцина против ИРТ КРС эмульсионная инактивированная.

2. Антигенный материал из возбудителя ИРТ КРС, репродуцированного в чувствительной биологической системе и подвергнутого инактивации.

3. Масляный адъювант.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины является то, что в качестве антигенного материала из возбудителя ИРТ КРС она содержит антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток и подвергнуюю инактивации.

2. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 и инактивированного АЭЭИ.

3. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

4. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21 с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 30,0 мас.%.

5. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK и инактивированного АЭЭИ.

6. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

7. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток MDBK с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 30,0 мас.%.

8. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ и инактивированного АЭЭИ.

9. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ.

10. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток 3КГ с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, в количестве 30,0 мас.%.

11. Из масляных адъювантов масляный адъювант Montanide ISA-70.

12. Масляный адъювант Montanide ISA-70 в эффективном количестве.

13. Масляный адъювант Montanide ISA-70 в количестве 70,0 мас.%.

14. Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток, взятой из группы, состоящей из перевиваемой культуры клеток ВНК-21, перевиваемой культуры клеток MDBK и перевиваемой культуры клеток 3КГ, с биологической активностью, по меньшей мере, 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³ и инактивированного АЭЭИ, и масляный адъювант в соотношении, мас.%:

Антигенный материал	30,0
Масляный адъювант	До 100,0

По сравнению с вакциной-прототипом предлагаемая вакцина обладает более высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью и расширяет арсенал средств специфической профилактики ИРТ КРС.

Достижение технического результата от использования предлагаемого изобретения объясняется тем, что в состав предлагаемой вакцины введен антигенный материал из нового штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" ИРТ КРС, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего получение вакцины, создающей напряженный и длительный иммунитет у привитых животных.

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" является новым, ранее не известным.

Исходный вирус для получения штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" выделен из патологического материала телят, павших с клиникой ИРТ КРС во время вспышки заболевания в СПК "Миневское" Нижегородской области в 1998 году.

Производственный штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС получен путем многократных последовательных пассажей в чувствительных биологических системах.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) МСХ РФ 12 марта 2001 года под регистрационным шифром "ВНИИЗЖ-ДЕП".

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.

Экспериментально подтверждена его возможность использования для приготовления инактивированной эмульсионной вакцины против ИРТ КРС. Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" обеспечивает получение инактивированной вакцины против ИРТ КРС, создающей эффективную защиту КРС против указанного возбудителя заболевания.

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesviridae, роду Varicellavirus, группе HPV-1, обладает морфологическими признаками, характерными для данного семейства.

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" состоит из линейной 2-нитчатой ДНК с молекулярной массой 92-102 кД, вирионы - частицы округлой формы состоят из 4-х структурных компонентов: нуклеотида, капсида диаметром 120-150 нм, окруженного содержащей липиды оболочкой, мембраны (тегумента) и наружной оболочки.

Плавучая плотность вирионов в градиенте CsCl 1,27-1,29 г/см³. Нуклеотид тороидальной формы содержит ДНК и окружен икосаэдрическим капсидом диаметром 100-110 нм, содержащим 162 частично полых капсомера. Капсид окружает ядро вириона, состоящее из ДНК, покрытой белком. Мембрана из глобулярного материала окружает капсид. В составе вириона определено до 32 белков с молекулярной массой до 290 кД. Вирионы имеют сложную организацию, включая не менее 4 компонентов: core, капсид, суперкапсидную структуру и оболочку. Наружная оболочка вирионов имеет типичное строение и содержит многочисленные выступы (шипы) длиной около 8 нм. Вирусы формируют характерные внутриядерные включения. Вирионы при прохождении через внутренний листок ядерной мембраны в эндоплазматический ретикулум покрываются дополнительной оболочкой, содержащей гликопротеины и липиды.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" относится к группе 1 герпесвирусов КРС. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус обладает гемагглютинирующей активностью (ГА-активностью), реагируя с антителами переболевших или иммунизированных животных в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). При вакцинации лабораторных и естественно-восприимчивых животных вирусный антиген индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РНГА в разведении 1:16-1:256.

Биотехнологические характеристики

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" является вирулентным и обладает высокой биологической активностью в нативном виде, а также проявляет высокие антигенные и иммуногенные свойства после инактивации.

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" предназначен для изготовления инактивированной вакцины против ИРТ КРС. Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" репродуцируется в перевиваемых культурах клеток ВНК-21, MDBK и 3КГ, вызывая цитопатическое действие (ЦПД), и в течение 48-96 часов инкубирования накапливается в титре 6,5-8,0 Ig ТЦД₅₀/см³. Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" является стабильным и сохраняет свои свойства на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Выделено и охарактеризовано 9 структурных белков вируса ИРТ: VP 105, VP 90 (гемагглютинин), VP74, VP64, VP54, VP50, VP47, VP40, VP31.

Гликопротеины g¹, g^III, g^IV участвуют в формировании гуморального и клеточного иммунитета. Наиболее эффективным в этом отношении является g^IV.

По данным реакции нейтрализации наибольшей иммуногенностью обладают VP90 и VP74. Белок, маркированный как VP8, с мол. массой 96 кД, является одним из главных белков герпесвируса-1 КРС. Он участвует в модуляции экспрессии генов класса А. У телят он стимулирует пролиферацию Т-клеток и образование антител как после заражения, так и после иммунизации очищенным белком. За индукцию вируснейтрализующих антител герпесвируса-1 КРС ответственны 4-оболочечные гликопротеины, главными из них являются g⁷⁰ и g⁹⁷. ГА-активность вируса связана с мажорным g⁹⁷, расположенным в шипиках вириона. В структуре g^IV вируса ИРТ идентифицированы 3 нейтрализующих домена.

Домен 1 содержит 2 перекрывающих эпитопа, домен 2 - один эпитоп. Домен 1 имеет отношение к проникновению вируса в клетки-мишени.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" устойчив к воздействию низких температур. При минус 60-70°С вирус выживает в течение 7-9 месяцев, при 56°С инактивируется через 20 минут, при 37°С - через 4-10 суток, при 22°С - через 50 суток. При 4°С активность вируса снижается через 30-40 суток лишь на 1 Ig.

Растворы формалина 1:500 инактивируют вирус через 24 часа. Ацетон, эфир, хлороформ и этиловый спирт инактивируют его немедленно. В кислой среде вирус быстро теряет свою активность, но длительно (до 9 мес.) сохраняется при рН 6-9 и в условиях 4°С.

Лиофилизация почти не влияет на его активность, однако многократное замораживание и оттаивание снижает вирулентность и иммуногенность вируса.

Дополнительные признаки и свойства

Иммуногенная активность - 100%.

Патогенность - выражена.

Вирулентность - выражена.

Контагиозность - выражена.

Онкогенность - отсутствует.

Свободен от контаминации бактериями, микоплазмами и другими гемагглютинирующими вирусами.

На основании полученных данных можно утверждать, что штамм "ВНИИЗЖ-ДЕП" по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее не известным изолятом вируса ИРТ КРС. Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная профилактики вновь возникающих очагов болезни, а для этого необходима высокоактивная и безвредная вакцина.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения.

Определение из перечня выявленных аналогов прототипа как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое решение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемая вакцина соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Исходный вирус для получения штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" выделен из патологического материала (трахея, легкое, лимфатические узлы, селезенка) от телят, павших с клиникой ИРТ, КРС во время вспышки заболевания в СПК "Миневское" Нижегородской области в 1998 году. Вакцинный штамм получен во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных путем культивирования в перевиваемых культурах клеток ВНК-21, MDBK и 3КГ.

Из патологического материала готовили 20% суспензию в буферном растворе (50 мМ HCl, рН 8,0; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА), которую осветляли низкоскоростным центрифугированием, надосадок концентрировали 7% ПЭГ, экстрагировали равным объемом буферного раствора и очищали ультрацентрифугированием в перформированном градиенте плотности CsCl-сахароза. Полученный вирус использовали для последующего пассирования.

Результаты исследований по адаптации вируса ИРТ КРС штамма "ВНИИЗЖ" к перевиваемым культурам клеток ВНК-21, MDBK и 3КГ представлены в таблицах 1, 2 и 3.

Полученный вирус был подвергнут всестороннему контролю в соответствии с руководством МЭБ по стандартным диагностическим методам и вакцинам (1996) и на уровне третьего пассажа заложен на хранение в качестве матровой расплодки. Вирус матровой расплодки с титром инфекционной активности 6,5-7,0 Ig ТЦД₅₀/см³ представлен в виде нативной суспензии культуральной жидкости и пораженного монослоя, хранится при температуре - 40°С.

Полученному штамму вируса ИРТ КРС присвоено авторское наименование "ВНИИЗЖ".

Пример 2.

С целью определения биологической, антигенной и иммунологической активности вируса ИРТ КРС штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" осуществляли гипериммунизацию кроликов живой массой 2,5-3,0 кг.

Для получения антигена исходную вируссодержащую суспензию в виде 3-5 пассажа в культуре клеток MDBK троекратно замораживали-оттаивали. После этого вирусную жидкость осветляли низкоскоростным центрифугированием (2500-3000 об/мин) в течение 30 мин.

Инактивацию вирусной суспензии проводили рабочим раствором АЭЭИ. Во избежание изменения рН вирусной суспензии рабочий раствор АЭЭИ предварительно доводили 5М раствором уксусной кислоты до рН 7,8-8,2. Конечная концентрация инактиванта составила 0,1-0,15%. Смесь тщательно встряхивали и выдерживали при 37°С в течение 24 часов.

Концентрирование антигена проводили добавлением в суспензию инактивированного вируса 50% раствора ПЭГ м.м. 6000 до конечной концентрации 8-10% по сухому веществу. Смесь выдерживали в течение 16-18 часов при 4°С до формирования осадка. Осадок отделяли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30-40 мин и ресуспендировали в минимальном объеме раствора Хенкса (рН 7,2-7,4).

Для гипериммунизации кроликов использовали эмульсию инактивированного и концентрированного вируса ИРТ КРС штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП". Для изготовления эмульсии использовали минеральные или синтетические масла с соответствующими эмульгаторами. Стерильный адъювант в равных объемах смешивали с антигеном и гомогенизировали до получения стойкой водно-масляной эмульсии.

Животным вводили эмульсию инактивированного вируса ИРТ КРС штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" в объемной дозе 2 см³ с титром возбудителя до инактивации не ниже 6,5-7,0 lg ТЦД₅₀/см³ в мякиши подушечек задних лапок. На 7 день инъекцию проводили в подколенные лимфоузлы, на 21 день - внутримышечно по 2 см³ эмульсии.

Через 10-15 дней после окончания гипериммунизации кроликов обескровливали, получали сыворотки крови индивидуально от каждого животного. Каждую сыворотку проверяли на активность и специфичность в РНГА. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Приведенные в таблице 4 данные характеризуют высокую биологическую антигенную и иммунологическую активность штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС при введении в организм лабораторных животных.

Пример 3.

Для получения эмульсионной инактивированной вакцины против ИРТ КРС матровый вирус штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" репродуцируют заражением монослоя перевиваемой культуры клеток 3КГ или MDBK, или ВНК-21, выращенных в 1,5 дм³ матрасах или вращающихся сосудах объемом 3 дм³. Охлажденную при 4°С вируссодержащую суспензию, соблюдая стерильные условия, освобождают от клеточного детрита известным способом, используя низкоскоростное центрифугирование, и сливают в емкость. Освобожденная от детрита суспензия должна иметь вид прозрачной жидкости розового или вишневого цвета. Затем из емкости отбирают пробу для производственного контроля вирусного сырья. Производственная серия вируса ИРТ КРС должна иметь инфекционную активность не меньше 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³, активность в РДП не меньше 4,0 log₂.

Инактивацию вирусного сырья осуществляют с помощью 6% водного раствора АЭЭИ, вносимого в суспензию вируса ИРТ до конечной концентрации 0,1-0,2%. Для этого в суспензию, подогретую до 26-28°С, вносят при постоянном перемешивании раствор АЭЭИ и устанавливают рН суспензии в пределах 7,6-7,8 5М раствором уксусной кислоты или аммиака. Инактивацию вируса проводят при температуре 36-37°С в течение 24 часов с периодическим перемешиванием суспензии (по 3-5 мин через каждые 5-6 часов).

По окончании инактивации антигенный материал охлаждают до 2-8°С и отбирают пробы для проверки на остаточную инфекционность в культуре клеток MDBK.

Для нейтрализации АЭЭИ в суспензию антигенного материала добавляют 1М раствор тиосульфата натрия из расчета 10% к объему использованного АЭЭИ.

Полученный антигенный материал используют для изготовления эмульсионной формы вакцины против ИРТ КРС.

Для этого антигеный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС тщательно эмульгируют с масляным адъювантом в гомогенизаторе в соотношении 3:7. Из масляных адъювантов используют масляный адъювант Montanide ISA-70 (производство фирмы "Seppic", Франция; стандарт ИСО 9001).

Содержание антигена в предлагаемой вакцине в указанном выше соотношении является его эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого или бело-розового цвета слегка вязкой консистенции. При хранении вакцины допускается незначительное отслоение минерального масла на верхней поверхности эмульсии и водной фазы на дне флакона толщиной не более 1 см.

Вакцину контролируют на авирулентность и стерильность, а затем фасуют в стерильные флаконы.

Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 28085-89. Авирулентность препарата определяют методом трехкратных последовательных пассажей инактивированного антигена в перевиваемой культуре клеток MDBK по отсутствию ЦПД.

Для проверки безвредности вакцину вводят внутримышечно в область бедра 10 белым мышам в дозе 0,1 см³. Вакцина считается безвредной, если белые мыши в течение 10 суток остаются клинически здоровыми, без каких-либо патологических изменений. На месте введения препарата допускается местная тканевая реакция.

Вязкость вакцины определяют на вискозиметре ВПЖ-2 и выражают в мм²/с. Предлагаемая вакцина, содержащая в своем составе масляный адъювант Montanide ISA-70, дающего тип эмульсии "вода-масло", имеет вязкость 38,3±0,5 мм²/с.

Контроль вакцины на стабильность эмульсии осуществляют посредством центрифугирования при 3000 об/мин, в течение 30 минут, а также в процессе хранения при 2-8°С и 37°С с последующей визуальной оценкой однородности эмульсии. Вакцина с масляным адъювантом Montanide ISA-70 обладает высокой стабильностью эмульсии при хранении в различных температурных режимах и при центрифугировании.

Для проверки реактогенности препарата предлагаемую вакцину вводят внутримышечно в область бедра 3 кроликам и 5 морским свинкам в дозе 2 см³ и 1 см³ соответственно. За клиническим состоянием животных ведут наблюдение в течение 14 суток.

После иммунизации у кроликов и морских свинок отмечено незначительное местное повышение температуры тела и образование припухлости диаметром около 1 см в месте введения. Эти признаки полностью исчезли к концу срока наблюдения.

Таким образом, предлагаемая вакцина относится к типу слабореактогенных препаратов.

Антигенную активность вакцины проверяют на кроликах. Для этого берут 6 кроликов массой 2,0-2,5 кг. Вакцину вводят четырем кроликам подкожно в область спины по 1 см³. Через 14 сут после двукратного введения вакцины с интервалом 20-25 сут у кроликов из ушной вены берут по 2-3 см³ крови, выдерживают при температуре 37°С, отделяют сыворотку и исследуют на наличие антител к вирусу ИРТ КРС в реакции нейтрализации (РН) или в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Невакцинированных животных (2 головы) обескровливают одновременно с вакцинированными, отделяют сыворотку и используют для контроля.

Серию вакцины считают прошедшей контроль на антигенность, если титр вирусспецифических антител к вирусу инфекционного ринотрахеита в РН не ниже 3,0 log₂ или не ниже 4,0 log₂ в РНГА.

Известно, что эффективность инактивированных вакцин в значительной степени зависит от дозы вводимого препарата.

Для определения минимальной антигенной дозы (ИМД₅₀) предлагаемой вакцины используют кроликов и морских свинок.

Из животных каждого вида были сформированы по 2 группы животных для раститровки образцов вакцины. Каждая группа состояла из 4 животных. Кроликам и морским свинкам каждой группы внутримышечно в область бедра вводили образцы испытуемой вакцины в разных дозах, возрастающих в логарифмической кратности, равной 2.

До вакцинации и через 21 день после вакцинации у животных брали пробы крови, сыворотки исследовали в РНГА для определения титров специфических к вирусу ИРТ КРС антител, которые выражали в виде log₂.

Минимальной считали антигенную дозу вакцины, которая индуцировала у 50% привитых лабораторных животных уровень вирусспецифических антител от 4 log₂ и выше. ИМД₅₀ рассчитывали по формуле Кербера-Ашмарина.

Прививная доза предлагаемой вакцины для кроликов составила 0,17 ИМД₅₀/см³, а для морских свинок - 0,25 ИМД₅₀/см³, т.е. одна прививная доза содержала 4,0-5,8 антигенных доз.

Пример 4.

Вакцину против ИРТ КРС эмульсионную инактивированную, изготовленную так, как описано в примере 3, и содержащую, мас.%:

Антигенный материал из штамма "ВНИИЗЖ-ДЕП" вируса ИРТ КРС,
репродуцированного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21
с биологической активностью 6,5 Ig ТЦД50/см3
и инактивированного АЭЭИ	30,0
Масляный адъювант	До 100,0

подвергли контролю на антигенную и протективную активность на КРС.

Для этого было сформировано 2 группы телят 30-дневного возраста швицкой породы. Телята получены от коров, привитых инактивированной вакциной "Комбовак".

Три теленка первой группы были привиты полученной вакциной в дозе 1 см³. Вторая группа, состоящая из 2 телят, являлась контрольной. Через 21 день животных первой группы ревакцинировали в той же дозе. За телятами вели наблюдение в течение 175 дней.

Периодически у них брали пробы крови. В сыворотках крови определяли уровень вируснейтрализующих антител к вирусу ИТР КРС в РНГА. Уровни антител выражали в виде log₂.

Параллельно проводили исследования цитратных проб крови для определения уровня клеточнообусловленного иммунитета (КОИ) в реакции ингибиции миграции лейкоцитов (ИМЛ). Результаты исследований представляли в виде индекса миграции (IM), который находится в обратно пропорциональной зависимости от уровня сенсибилизации организма вирусом ИРТ.

Через 157 дней все телята были подвергнуты контрольному заражению вирулентным вирусом ИРТ с титром инфекционности 6,0 lg ТЦД₅₀/см₃. Вирусная суспензия вводилась интраназально по 4 см³ в каждую ноздрю. После этого ежедневно проводилось их клиническое обследование. На 175 день телята были забиты с целью проведения патологоанатомического вскрытия. Результаты исследований представлены в таблице 5.

Согласно данным таблицы 5 следует, что у телят, привитых эмульсионной вакциной, уровень антител начал повышаться уже после первой вакцинации и стабильно удерживался в пределах 7,0-7,1 log₂.

В