Амидные производные карбоновой кислоты, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе

Амидные производные карбоновой кислоты, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к новым антагонистам NMDA-рецептора, представляющим собой амидные производные карбоновой кислоты формулы (I)

где

один из R¹ R², R³ и R⁴ представляет собой ОН или NH₂ группу, а другие являются атомами водорода или

две соседние R¹, R², R³ и R⁴ группы вместе с одним или более идентичными или различными дополнительными гетероатомами и -СН= и/или -СН₂- группами образуют 5-6-членное гомо- или гетероциклическое кольцо, предпочтительно пиррольное, пиразольное, имидазольное, оксазольное, оксо-оксазолидиновое или 3-оксо-1,4-оксазиновое кольцо, и две другие R¹, R², R³ и R⁴ группы являются атомами водорода, R⁵ и R⁶ вместе с атомом азота между ними образуют насыщенное или ненасыщенное 4-6-членное гетероциклическое кольцо, которое является замещенным гидроксильной группой, и/или в данном случае фенильной или группами фенокси, фенил-(C₁-C₄-алкил), фенил-(C₁-C₄-алкокси), фенокси-(C₁-C₄-алкил), анилино, фенил-(C₁-C₄-алкиламино), [фенил-(C₁-C₄-алкил)]-амино, бензоил, гидроксидифенилметил, C₁-C₄-алкоксикарбонилфеноксиметил или бензгидрилиденовой группой, необязательно замещенными на ароматическом кольце одним или более атомами галогена, циано или гидроксильной группой, C₁-C₄-алкильной или C₁-C₄-алкоксигруппой,

X и Y независимо представляют собой атом кислорода или атом азота или -СН= группу, и к их солям, образованным с кислотами и основаниями.

Поскольку настоящее изобретение относится также к солям соединений формулы (I), образованным с кислотами или основаниями, в особенности солям, образованным с фармацевтически приемлемыми кислотами или основаниями, приведенные значения для соединения формулы (I) относятся либо к свободному соединению, либо к соли, если не оговорено отдельно.

Особенно значительной группой соединений настоящего изобретения являются соединения формулы (Ia),

где значения R¹, R², R³, R⁴, R⁵ и R⁶ те же, что описаны для соединений формулы (I).

В особенности, важными амидными производными карбоновой кислоты формулы (I) являются следующие:

6-(4-бензилпиперидин-1-карбонил)]-1,5-дигидрооксазол[4,5-1]индол-2-он,

6-[4-(4-фторбензилпиперидин-1-карбонил)]-1,5-дигидрооксазол[4,5-f]индол-2-он,

(4-бензилпиперидин-1-ил)-(3,6-дигидропиррол[3,2-е]индазол-7-ил)метанон,

[4-(4-фторбензилпиперидин-1-ил)]-(3,6-дигидропиррол[3,2-е]индазол-7-ил)метанон,

(4-п-толилоксипиперидин-1-ил)]-(3,6-дигидропиррол[3,2-е]индазол-7-ил)метанон,

(4-бензилпиперидин-1-ил)-(3,6-дигидро-имидазо[4,5-е]индол-7-ил)метанон.

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим в качестве активного ингредиента соединения формулы (I).

Кроме того, объектами настоящего изобретения являются способ получения соединений формулы (I) и химическое и фармацевтическое производство лекарственных средств, содержащих указанные соединения, а также способ лечения с помощью указанных соединений, который заключается во введении млекопитающим, подлежащим лечению, включая человека - эффективного количества/количеств соединений формулы (I) настоящего изобретения как такового или в виде лекарственного средства.

Термин "галоген" в качестве заместителя - как определено ранее - означает фтор, хлор, бром или иод, предпочтительно фтор и хлор. Термин C₁-C₄-алкильная группа, используемый в настоящем описании, означает метальную, этильную, линейную и изопропильную и различные бутильные группы. Указанные C₁-C₄-алкильные группы могут быть в составе C₁-C₄-алкоксигрупп. Термин C₁-C₄-алканоилоксигруппа означает одновалентную ацилоксигруппу, содержащую атом водорода, также как и C₁-C₆алкильную группу и карбонилоксигруппу (-СО-O-), присоединенную к ней, предпочтительно формилокси, ацетокси, пропионилокси, различные бутирилокси, валероилокси и капроилоксигруппы.

Изобретение относится также к солям соединений формулы (I), образованным с кислотами или основаниями.

Как органические, так и неорганические кислоты могут быть использованы для формирования кислотно-аддитивных солей. Подходящими неорганическими кислотами могут быть, например, соляная кислота, серная кислота и фосфорная кислота. Представителями одновалентных органических кислот могут быть, например, муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота и различные масляные кислоты, валериановые кислоты и каприновые кислоты. Представителями двухвалентных органических кислот могут быть, например, щавелевая кислота, малоновая кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота и янтарная кислота. Другие органические кислоты также могут быть использованы, такие как гидроксикислоты, например, лимонная кислота, винная кислота или ароматические карбоновые кислоты, например, бензойная кислота или салициловая кислота, также как алифатические и ароматические сульфоновые кислоты, например, метансульфоновая кислота и п-толуолсульфоновая кислота. Особенно ценной группой кислотно-аддитивных солей является та, в которой сам кислотный компонент не обладает терапевтическим эффектом в применяемой дозе, или она не оказывает неблагоприятного воздействия на эффективность активного компонента. Указанные кислотно-аддитивные соли являются фармацевтически приемлемыми кислотно-аддитивными солями. Причина, почему кислотно-аддитивные соли, которые не принадлежат к фармацевтически приемлемым кислотно-аддитивным солям, но относятся к настоящему изобретению, заключается в том, что при необходимости они могут быть полезными при очистке и выделении желаемого соединения.

Среди солей, образованных с основаниями, особенно важными являются соли, образованные со щелочными металлами, например, натрием, калием, щелочноземельными металлами, например, кальцием и магнием, а также с аммиаком или органическими аминами. Последние основания могут иметь дополнительные заместители, например, гидрокси- или аминогруппы, которые могут влиять, например, на растворимость и обработку продукта.

В соответствии с изобретением соединения формулы (I) получают образованием амидной связи между карбоновой кислотой формулы (II)

где значения R¹, R², R³, R⁴, Х и Y являются такими, как описано выше для соединения формулы (I) - и амина формулы (III)

где значения R⁵ и R⁶ являются такими, как описано выше для соединения формулы (I), и затем полученное амидное производное карбоновой кислоты формулы (I) - где значения R¹, R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, Х и Y являются такими, как описано выше для соединения формулы (I) - при необходимости переводят в другое соединение формулы (I) введением новых заместителей и/или модификацией или удалением существующих заместителей, и/или образованием соли и/или выделением соединения из солей, и/или полученные рацематы расщепляют на изомеры с помощью оптически активных кислот или оснований известными способами.

Образование амидной связи предпочтительно осуществляют путем получения активного производного карбоновой кислоты формулы (II), с последующим его взаимодействием с амином формулы (III), предпочтительно в присутствии основания.

В растворе карбоновую кислоту переводят в активное производное in situ во время образования амидной связи в подходящем растворителе (например, диметилформамиде, ацетонитриле, хлорированных углеводородах или углеводородах). Активными производными могут быть хлорангидриды кислот (например, полученные из карбоновой кислоты с тионилхлоридом), смешанные ангидриды (например, полученные из карбоновой кислоты с изобутилхлороформиатом в присутствии основания, например, триэтиламина), активные эфиры (например, полученные из карбоновой кислоты с гидроксибензотриазолом и дициклогексилкарбодиимидом или О-бензотриазол-1-ил-N,N,N',N'-тетраметилуронийгексафторфосфатом (HBTU) в присутствии основания, например, триэтиламина). Активные производные получают при температуре между комнатной и 0°С. К полученному раствору или суспензии добавляют соответствующий амин формулы (III) в виде основания или в виде соли, образованной с неорганической кислотой, так, что основание, например, триэтиламин, необходимый для выделения амина, добавляют в реакционную смесь отдельно. Реакции конденсации отслеживают тонкослойной хроматографией. Необходимое время реакции составляет 6-20 ч. Обработку реакционной смеси проводят различными способами.

Когда реакционная смесь представляет собой суспензию, осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из подходящего растворителя с получением чистого продукта. Если кристаллизация не приводит к чистому продукту, то для его очистки можно затем применить колоночную хроматографию. Колоночную хроматографию проводят либо в нормальной фазе с помощью кизельгеля 60 в качестве адсорбента и в различных системах растворителей, например, толуол/метанол, хлороформ/метанол или толуол/ацетон, в качестве элюентов, либо на обращенной фазе с помощью наполнителей типа Prep-Pak-500/С18 (выпускаемых Waters Associates) и смеси ацетонитрил/вода/трифторуксусная кислота в качестве элюента. Если реакционная смесь в конце реакции ацилирования представляет собой раствор, его концентрируют и остаток кристаллизуют или очищают с помощью хроматографии на колонке, как описано выше. Структуры продуктов определяют с помощью ИК, ЯМР и масс-спектрометрии.

Альтернативно, реакционная смесь может быть очищена с помощью колоночной хроматографии без концентрирования в конце реакции. Фракции, содержащие желаемое соединение, концентрируют, остатки растворяют в диметилсульфоксиде и структуру, чистоту, так же как и концентрацию продукта определяют с помощью ВЭЖХ/МС (колоночной хроматографии высокого давления, с последующей масс-спектрометрией).

Полученные амидные производные карбоновой кислоты формулы (I) - независимо от способа получения - при необходимости могут быть превращены в другое соединение формулы (I) введением других заместителей и/или модификацией и/или удалением существующих заместителей и/или образованием солей с кислотами и/или выделением амидного производного карбоновой кислоты формулы (I) из полученных кислотно-аддитивных солей обработкой основанием, и/или свободное амидное производное карбоновой кислоты формулы (I) может быть превращено в соль обработкой основанием.

Карбоновые кислоты формулы (II) и первичные или вторичные амины формулы (III) являются либо коммерчески доступными, либо могут быть получены различными известными способами. Синтезы некоторых коммерчески недоступных карбоновых кислот формулы (II) описаны в примерах. Следуя указанным способам, могут быть также получены другие коммерчески недоступные карбоновые кислоты формулы (II).

Соединения по изобретению, так же как и их фармацевтически приемлемые соли могут использоваться отдельно или соответственно в форме фармацевтических композиций. Указанные композиции (лекарственные средства) могут находиться в твердой, жидкой или полужидкой форме и могут добавляться фармацевтический адьювант и вспомогательные вещества, которые широко известны в практике, такие как носители, наполнители, разбавители, стабилизаторы, увлажнители или эмульгирующие агенты, вещества, влияющие на значение рН и осмотическое давление, отдушки или ароматизаторы, а также добавки, такие как разрыхлители или наполнители.

Доза, необходимая для терапевтического действия, может варьироваться в широких пределах и соответствует индивидуальным требованиям в каждом конкретном случае, в зависимости от стадии болезни, состояния и веса тела находящегося на излечении пациента, а также от чувствительности пациента к активному ингредиенту, способа введения и числа обработок в день. Точная используемая доза активного ингредиента может быть благополучно определена лечащим врачом на основании знаний уровня техники, а также - находящегося на излечении пациента.

Фармацевтические композиции, содержащие активный ингредиент в соответствии с настоящим изобретением, обычно содержат от 0.01 до 100 мг активного ингредиента в одной дозированной единице. Конечно, возможно, что количество активного ингредиента в некоторых композициях является большим или меньшим границ, определенных выше.

Твердыми формами фармацевтических композиций могут являться, например, таблетки, драже, капсулы, пилюли или лиофилизованные порошки в ампулах, пригодные для получения инъекций. Жидкими композициями являются инъекционные и инфузионные композиции, жидкие лекарственные средства, запаянные жидкости и капли. Полужидкими композициями могут быть мази, бальзамы, кремы, встряхиваемые микстуры и суппозитории.

Для простого введения желательно, чтобы фармацевтические композиции включали дозированные единицы, содержащие количество активного ингредиента, которое следует ввести однократно или за несколько раз или половину, третью или четвертую часть от них. Такими дозированными единицами являются, например, таблетки, которые можно разделить с помощью канавок, отделяя половину или четверть таблетки для точного введения необходимого количества активного ингредиента.

Таблетки могут быть покрыты оболочкой, растворимой в кислоте, для обеспечения высвобождения содержания активного ингредиента после прохождения желудка. Такие таблетки являются покрытыми энтеросолюбильной оболочкой. Подобное действие может также достигаться инкапсулированием активного ингредиента.

Фармацевтические композиции для орального введения могут содержать, например, лактозу или крахмал в качестве наполнителей, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, поливинилпирролидин или крахмальную пасту в качестве связующих веществ или гранулирующих агентов. Добавляют картофельный крахмал или микрокристаллическую целлюлозу в качестве разрыхляющих агентов, а также могут использоваться ультраамилопектин или формальдегидный казеин. В качестве антиадгезивных средств и лубрикантов могут использоваться тальк, коллоидная кремниевая кислота, стеарин, стеарат кальция или магния.

Таблетка может быть получена, например, влажным гранулированием с последующим прессованием. Смешанные активные ингредиенты и наполнители, а также при необходимости часть разрыхляющих агентов гранулируют в водном, спиртовом или водно-спиртовом растворе связующего вещества с использованием подходящего оборудования, затем гранулят высушивают. К сухому грануляту добавляют другие разрыхляющие агенты, лубриканты и антиадгезионные агенты и смесь прессуют в таблетку. В данном случае таблетки изготовляют с канавками, делящими таблетку напополам, для каждого введения.

Таблетки могут быть изготовлены прессованием прямо из смеси активного ингредиента и нужных вспомогательных веществ. При необходимости таблетки могут быть покрыты с помощью слоя из добавок, широко известных в фармацевтической практике, например, таких как стабилизаторы, отдушки, красители, такие как сахар, производные целлюлозы (метил- или этилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия и т.д.), поливинилпирролидон, фосфат кальция, карбонат кальция, пищевые красители, пищевые настойки, ароматизаторы, пигменты на основе оксида железа и т.д. В случае капсул смесь активного ингредиента и вспомогательных веществ помещают в капсулы.

Жидкие оральные композиции, например суспензии, сиропы, эликсиры, могут быть изготовлены с помощью воды, гликолей, масел, спиртов, красителей и отдушек.

Для ректального введения композиция заключается в суппозитории или клизмы. Суппозитории кроме активного ингредиента могут содержать носитель, так называемые просуппозитории на основе свиного жира. Носителями могут быть овощные масла, такие как гидрированные овощные масла, триглицериды C₁₂-C₁₈ жирных кислот (предпочтительно носители, имеющие товарное наименование Witepsol). Активный ингредиент гомогенно смешивают с расплавленными просуппозиториями на основе свиного жира и формируют суппозитории.

Для парентерального введения композицию составляют в виде инъекционного раствора. Для получения инъекции раствор активных ингредиентов растворяют в дистиллированной воде и/или в различных органических растворителях, таких как гликолевые эфиры, в данном случае в присутствии растворителей, например, полиоксиэтиленсорбитан-монолаурата, -моноолеата или моностеарата (Tween 20, Tween 60, Tween 80). Инъекционный раствор может также содержать различные вспомогательные вещества, такие как консерванты, например, тетраацетатэтилендиамин, а также агенты, поддерживающие значение рН, и буферы, и в данном случае местное анестезирующее вещество, например лидокаин. Инъекционный раствор, содержащий активный ингредиент по изобретению, фильтруют до его внесения в ампулы и стерилизуют после внесения.

Если активный ингредиент гигроскопичен, он может быть затем стабилизирован лиофилизацией.

Близкие структурные аналоги амидных производных карбоновой кислоты формулы (I) известны из уровня техники.

Замещенные производные индол-2-илкарбонилпиперидина, аналогичные соединениям по изобретению, описаны в WO 9618628 и двух публикациях [J. Med. Chem., 39, 3769 (1996), и J. Med. Chem., 42, 4140 (1999)]. Указанные соединения, обладающие ингибирующей активностью обратной транскриптазы, могут использоваться для лечения пациентов со СПИДом.

Амиды индол-2-карбоновой кислоты являются также известными [Bioorg. Med. Chem. Letters, 10, 483. (2000)], ингибируют рр60^c-src тирозинкиназу, и, следовательно, они могут использоваться для лечения пациентов, страдающих онкологическими заболеваниями. Указанные публикации не описывают антагонистического действия на NMDA-рецептор.

Производные бензофуран-2-ил-пиперидина описаны в WO 2000012074. Указанные соединения обладают ингибирующим действием на р38-а киназу и, следовательно, могут использоваться для лечения инфекционных болезней, вызванных грамм-отрицательными бактериями, а также - пациентов с респираторным болезненным синдромом.

Производное метанона, описанное в Protein Sci, 6 (7), 1412 (1997), является ингибитором тромбина. Эти публикации не описывают антагонистического действия на NMDA-рецептор.

Неожиданно было обнаружено, что в противоположность известным соединениям структурно аналогичные соединения - которые, как известно, обладают только различными ингибирующими действиями на фермент - новые амидные производные карбоновой кислоты формулы (I) настоящего изобретения являются высоко эффективными и селективными антагонистами NMDA (N-метил-D-аспартат) рецепторов, и более того, большинство соединений являются селективными антагонистами NR2B подтипа NMDA-рецептора. Эта селективность является особенно важной для снижения нежелательных побочных эффектов соединений.

Антагонисты NMDA-рецепторов могут использоваться во многих заболеваниях, которые сопровождаются избытком высвобождения глутамата, главного возбудительного нейропереносчика в центральной нервной системе. Сверхактивация NMDA-рецепторов глутаматом может приводить к накоплению кальция в клетках. Это может запускать каскад внутриклеточных процессов, которые могут изменять клеточную функцию и даже приводить к гибели нейронов [TINS, 10, 299-302 (1987)].

Распознавание структуры NMDA-рецептора, функции и фармакологии обуславливают последние достижения молекулярной биологии. NMDA-рецепторы представляют собой гетеромерные комплексы, построенные, по крайней мере, из одной NR1-субъединицы и по крайней мере одной из четырех NR2-субъединиц (NR2A-D). Как пространственные конструкции CNS, так и фармакологическая чувствительность NMDA-рецепторов, построенных из различных NR2-субъединиц, являются различными. Особый интерес представляет NR2B-субъединица из-за ее ограниченной конструкции (самая высокая плотность наблюдается в предмозговом и основном желатинообразном веществе спинной связки). Соединения, селективные для этого подтипа, известны [Curr. Pharm. Des. 5, 381-404 (1999)] и, как доказано, являются эффективными на животных моделях с параличом [Stroke 28, 2244-2251 (1997)], травматическим ушибом мозга [Brain Res. 792, 291-298 (1998)], болезнью Паркинсона [Ехр. Neurol. 163, 239-243 (2000)], нейропатической и воспалительной болью [Neuropharmacology 38, 611-623 (1999)]. Подтип селективных антагонистов NMDA-рецепторов, как ожидается, проявляет небольшие или неблагоприятные побочные эффекты, вызываемые действием неселективных антагонистов NMDA-рецепторов на сайт связывания глутамата или в проходе тоннеля.

Заболеваниями, которые, как известно, связаны с NMDA-антагонистами [Drug News Perspect 11, 523-569 (1998) и WO 00/00197], являются церебральная ишемия любого происхождения (например, удар, тепловое воздействие), хронические нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амиотрофический латеральный склероз (ALS), болезнь Хантингтона, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), связанный с повреждением нейрона, травматический ушиб мозга или спинной связки, боль (например, посттравматическая или послеоперационная) и хронические боли, такие как нейропатическая боль или боль, связанная с раком. Антагонисты NMDA-рецептора могут также использоваться для лечения эпилепсии, беспокойств, депрессии, мигрени, психоза, мышечных спазм, мультиинфарктного слабоумия и слабоумия другого происхождения, гипогликемии, дегенеративных заболеваний сетчатки (например, CMV ретинит), астмы, звона в ушах, потери слуха, вызванной аминогликозидным антибиотиком. NMDA-антагонист может использоваться для снижения толерантности и/или зависимости от опиоидного лечения боли и для лечения синдрома зависимости, например, от алкоголя, опиоидов и кокаина.

Так как заявляемые соединения имеют вышеуказанные биологические активности, объектами настоящего изобретения также являются способ лечения амидными производными карбоновой кислоты формулы (I) или их солями, который предполагает введение млекопитающему, находящемуся на излечении - включая человека - эффективного количества/количеств соединений формулы (I) настоящего изобретения отдельно или в виде лекарственного средства.

Известно, что в течение постнатального развития субъединичная композиция нейронных NMDA-рецепторов изменяется. Подобные изменения обнаружены в клеточных культурах нейронов [Eur. J. Neurosci. 10, 1704-1715 (1998)]. В соответствии с литературными данными и с собственными иммуно-цитохимическими исследованиями нейронных клеток, культурируемых в течение 4-7 дней in vitro, авторами настоящего изобретения, преимущественно экспрессируется NR2B-субъединица вместе с NR1-субъединицей. Такой функциональный тест на NMDA-антагонизм в указанных клетках главным образом отражает действие NR2B-субъединицы, содержащей рецепторы. Так как NMDA-рецепторы, как известно, являются проницаемыми для ионов кальция в процессе возбуждения, авторы охарактеризовали активацию NMDA-рецептора с помощью измерения увеличения концентрации кальция внутри клетки после добавления к клеткам агониста (NMDA).

Определение активности NMDA-антагониста in vitro с помощью измерения концентрации кальция внутри клетки ячеечным флуориметрическим счетчиком

Измерения кальция внутри клетки проводят на первичных неокортикальных культурах клетки, полученных от эмбрионов Charles River крысы в возрасте 17 дней (для более подробного описания получения неокортикальной культуры клетки смотри Johnson, M.I.; Bunge, R.P. (1992): Primary cell cultures of peripheral and central neurons and glia. In: Protocols for Neural Cell Culture, eds: Fedoroff, S.; Richardson A., The Humana Press Inc., 13-38.) После выделения клетки помещают в стандартные 96-ячеечные микропланшеты и культуры поддерживают в атмосфере 95% воздуха-5% СО₂ при 37°С до измерений кальция.

Культуры используют для измерений кальция внутри клетки через 4-7 дней in vitro. До измерения в клетки вводят флуоресцентный Са²⁺ - чувствительный краситель, Fluo-4/AM (2-2.5 мкМ). Для прекращения введения клетки промывают дважды раствором, использующимся для измерения (140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl₂, 5 мМ HEPES, 5 мМ HEPES-Na, 20 мМ глюкозы, 10 мкМ глицина, рН 7.4). После промывания к клеткам добавляют тестируемые соединения в указанном выше растворе (90 мкл/на ячейку). Измерения кальция внутри клетки проводят ячеечным флуориметрическим счетчиком: повышение Fluo-4-флуоресценции и, следовательно, кальция внутри клетки вызывают введением 40 мкМ NMDA. Ингибирующая активность тестируемых соединений оценивается измерением понижения в повышении уровня кальция в присутствии различных концентраций соединений. После измерения используют стандартную калибровочную процедуру с небольшими изменениями для преобразования флуоресцентных данных в значения концентрации кальция [Meth. Cell. Biol. 40, 155-181 (1994)].

Кривые доза - отклик и IC₅₀-величины рассчитывают с помощью данных, полученных по крайней мере из трех независимых экспериментов. Ингибирующая активность соединения в точке единичной концентрации выражается как ингибирование в процентах отклика NMDA. Сигмоидальные кривые концентрация - ингибирование соответствуют данным и определяют IC₅₀ величины как концентрацию, которая проявляет половину от максимального ингибирования, вызванного соединением.

В Таблице 1 представлены IC₅₀ величины для большинства эффективных соединений данного изобретения, измеренные в этом тесте (колонки 1-2), вместе с самыми эффективными исследованными соединениями из уровня техники (колонки 3-4).

Соединениями из уровня техники являются следующие:

Со 101244: 1-[2-(4-гидроксифенокси)этил]-4-гидрокси-4-(4-метилбензил) пиперидин

EMD 95885: 6-[3-(4-фторбензил)пиперидин-1-ил]пропионил]-2,3-дигидробензоксазол-2-он

СР-101,606: (1S,2S)-1-(4-гидроксифенил)-2-(4-гидрокси-4-фенилпиперидин-1-ил)-1-пропанол

Со-111103: 1-[2-(4-гидроксифенокси)этил]-4-(4-фторбензил)пиперидин

Ro 25.6981: R-(R*,S*)-1-(4-гидроксифенил)-2-метил-3-[4-(фенилметил)пиперидин-1-ил]-1-пропанол.

Как показывает Таблица 1, большинство соединений настоящего изобретения, подвергшихся исследованию, превышают по активности соединения, известные из уровня техники.

Тест на субъединичную селективность на клетках, экспрессирующих рекомбинантные NMDA-рецепторы крыс

Для подтверждения селективности NR2B-субъединицы соединений используют клетки, трансфицированные с ДНК крысы NR1a и NR2A или NR2B-субъединицы. Гены, клонированные в соответствии с известными последовательностями [gi508809 (NRIa крысы), gi205738 (NR2B крысы), gi2905805 (NR2A крысы)], встраивают в индуцированные векторы экспрессии млекопитающего, несущие различные устойчивые гены (гигромицин в случае NRIa или неомицин в случае NR2-субъединиц). Конструкции векторов вводят в НЕК293 клетки с помощью катионного липидного способа трансфекции. Экспрессию белка вызывают с помощью 3 мкМ Муристерона А. Клетки поддерживают в присутствии 365 мкМ кетамина в течение 48-72 часов в атмосфере 95% воздух-5% CO₂ при 37°С до экспериментов.

Оценка NMDA-антагонистической активности на клетках, трансфицированных NR1a/NR2B-субъединицами флуориметрическим методом

Для введения клеточных клонов, стабильно экспрессирующих NR1a/NR2B-рецепторы, трансфицированные клетки обрабатывают выбранными антибиотиками в течение 4 недель, затем выращивают устойчивые клоны. Экспрессию белка NR2B-субъединицы осуществляют с помощью поточного иммуноцитохимического метода, основанного на цитометрии. Далее положительные клоны тестируют на функциональную активность в экспериментах с фиксированным делением. Лучший клон, продуцирующий самый большой ионный поток, вызванный NMDA, используют для тестирования NMDA антагонизма с помощью измерения NMDA, вызывающего повышение концентрации кальция в цитозоле. Индукция экспрессии протеина и выращивание клеток были такими же, как описано выше.

Клетки помещают в стандартные 96-ячеечные микропланшеты. Для измерения NMDA-антагонизма используют флуориметрические испытания с помощью счетчика на подложке. По существу способ является таким же, как способ, описанный выше для тестирования первичных культур кортикальных нейронов крыс.

Оценка NMDA-антагонистической активности на клетках, трансфицированных NR1a/NR2A-субъединицами, методом с фиксированным делением

В экспериментах с фиксированным пятном используют клетки, быстро экспрессирующие NR1a/NR2A-рецепторы и выращенные под покровными стеклами. Цельноклеточное записывающее устройство с фиксированным делением изготовляют в соответствии со стандартными способами. Клеточные культуры постоянно промывают внеклеточным раствором (140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 5 мМ Hepes, 5 мМ Na-Hepes, 2 мМ CaCl₂, 20 мМ глюкозы, 10 мкМ глицина, рН 7.35) при комнатной температуре. Делительные пипетки сопротивлением между 3 и 6 M Ω наполняют внеклеточным раствором (140 мМ CsCl, 11 мМ EGTA и 10 мМ Hepes, pH 7.3). Записывают внутренний поток, вызываемый 100 мкМ NMDA, от клеток при фиксированном напряжении -70 мВ. Соединения пропускают через мультибаррельное выталкивающее устройство, контролируемое электромагнитными клапанами. Первый NMDA вводят повторно до стабилизации откликов, затем вводят тестируемое соединение. Степень ингибирования - выраженную в процентах - рассчитывают из пика потоков, вызванных NMDA, в присутствии и отсутствии тестируемого соединения. Соотношение селективности (NR2B/NR2A) рассчитывают как соотношение тестируемой дозы на NR1/2A трансфицированные клетки и ИК₅₀ величины NMDA антагонизма на NR1/NR2B экспрессированные клетки. Результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 2Оценка селективности для NR2B от NR2A субъединицы, содержащей рецепторы
Соединение	NR1/NR2B*	NR1/NR2A** % ингибирования NMDA Са+ - отклик	Селективность
	ИКС50
	[мкМ]	15 мкМ
4570001461	0.015	14.9	>1000
4570002260	0.030	3.3	>500
СР-101,606	0.033	-8.8	>1200

*: Данные, полученные на НЕК293 клетках, стабильно экспрессирующих NR1a/NR2B субъединицы, измерением внутриклеточной концентрации кальция счетчиковым флуориметром на подложке. Представлены значения 3 экспериментов.**: Результаты экспериментов с фиксированным делением на NR1a/NR2A быстро трансфицирующих НЕК клетках. Представлена тестируемая концентрация. Приведены значения 3, 6, 2 экспериментов для 4570001461, 45070002260 и СР-101,606 соответственно.

Селективность: соотношение селективности (NR2B/NR2A), рассчитанное как соотношение тестируемой концентрации на NR1/2A трансфицированные клетки и ИК₅₀ величины на NR1/NR2B экспрессирующие клетки.

В соответствии с результатами, представленными в Таблице 2, соединения 4570001461 и 4570002260, так же как и СР-101,606, являются высоко селективными в отношении NR2B-субъединицы, содержащей NMDA-рецепторы. Синтез соединений и фармацевтических композиций в соответствии с изобретением представлен следующими не ограничивающими примерами. Кодовые номера соединений, которые приведены в биологических тестах, указаны после названия соединений, получаемых в Примерах.

Пример 1

6-(4-Бензилпиперидин-1-карбонил-3H-фуро[3',2':4,5]бензо[1,2-d]оксазол-2-он (4514255)

а) Этил 3Н-фуро[2,3-f]бензоксазол-2-он-6-карбоксилат

Смесь 0.9 г (4.2 ммоль) этил 5-гидрокси-6-аминобензофуран-2-карбоксилата [Helv. Chim. Acta 77, 100 (1994)], 60 мл тетрагидрофурана, 3.1 мл 20% водного раствора фосгена в толуоле и 2.0 мл триэтиламина перемешивают при комнатной температуре в течение часа. Тетрагидрофуран отгоняют в вакууме, к остатку добавляют воду и продукт экстрагируют этилацетатом. Объединенные органические слои промывают 5% водным раствором гидрокарбоната натрия, водой, 1 N раствором соляной кислоты и снова водой, сушат над сульфатом натрия и концентрируют, что дает 1.0 г (96%) названного соединения в виде масла.

b) 3Н-Фуро[2,3-f]бензоксазол-2-он-6-карбоновая кислота

Перемешиваемую смесь 1.0 г (4 ммоль) этил 3Н-фуро[2,3-f]бензоксазол-2-он-6-карбоксилата, 100 мл этанола и 0.5 г гидроксида калия нагревают при кипении с обратным холодильником в течение часа. Смесь концентрируют, остаток растворяют в воде и подкисляют 20% водным раствором серной кислоты. Осажденные кристаллы отфильтровывают и промывают водой, что дает 0.84 г (95%) названного соединения. Т.пл.:190-192°С (вода).

c) 6-(4-Бензилпиперидин-1-карбонил)-3Н-фуро[3',2':4,5]бензо[1,2-d]оксазол-2-он

Смесь 0.42 г (1.9 ммоль) 3Н-фуро[2,3-f]бензоксазол-2-он-6-карбоновой кислоты, 0.3 мл (2.1 ммоль) триэтиламина, 0.35 мл (2.0 ммоль) 4-бензилпиперидина, 0.76 г (2.0 ммоль) HBTU (Advanced Chem. Tech.) и 10 мл диметилформамида перемешивают при комнатной температуре в течение 6 часов. Реакционную смесь концентрируют и остаток очищают с помощью хроматографической колонки, используя кизельгель 60 в качестве адсорбента (Merck) и смесь - толуол: ацетон = 2:1 в качестве элюента, затем продукт кристаллизуют из диэтилового эфира, что дает 0.39 г (54%) названного соединения. Т.пл.:205-210°С (диэтиловый эфир).

Пример 2

6-(4-Бензилоксипиперидин-1-карбонил)-3Н-фуро[3',2':4,5]бензо[1,2-d]оксазол-2-он (4514254)

Названное соединение получают из 3Н-фуро[2,3-f]бензоксазол-2-он-6-карбоновой кислоты и 4-бензилоксипиперидина в соответствии со способом, описанным в примере 1/с. Т.пл.: 217-219°С (диэтиловый эфир).

Пример 3

1-(4-Бензилпиперидин-1-ил)-1-(1,6-дигидро-1,6-диаза-аз-индацен-2-ил)метанон (4514305)

a) Метил (2)-2-азидо-3-(1Н-индол-5-ил)акрилат

В атмосфере азота к раствору метоксида натрия (полученного из 15 мл метанола и 0.66 г (29 ммоль) натрия) добавляют по каплям при температуре 0°С смесь 1.02 г (7 ммоль) индол-5-карбальдегида [Helv. Chim. Acta, 1616 (1968)], 3.34 г (29 ммоль) метил азидо-ацетат и 7 мл метанола и таким образом полученную смесь перемешивают при той же самой температуре в течение 5 часов. Затем реакционную смесь разбавляют 50 мл воды и экстрагируют трижды 50 мл хлороформа. Объединенные органические слои промывают 20 мл воды, отфильтровывают с помощью разделяющей фазы пористой бумаги и концентрируют, что дает 1.3 г (77%) названного соединения. Т.пл.: 130-133°С (хлороформ).

b) Метиловый эфир 1.6-дигидро-1,6-диаза-аз-индацен-2-карбоновой кислоты

К кипящему раствору 36 мл ксилола добавляют небольшими дозами 1.09 г (4.5 ммоль) метилового эфира (2)-2-азидо-3-(1Н-индол-5-ил)акриловой кислоты. Реакционную смесь нагревают при кипении с обратным холодильником, пока не закончится выделение азота, затем концентрируют и остаток кристаллизуют гексаном, продукт отфильтровывают и промывают гексаном, что дает 0.6 г (62%) названного соединения. Т.пл.: 183-184°С (гексан).

с) 1,6-Дигидро-1,6-диаза-аз-индацен-2-карбоновая кислота

Смесь 0.53 г (2.5 ммоль) метилового эфира 1,6-дигидро-1,6-диаза-аз-индацен-2-карбоновой кислоты, 0.36 г (2.5 ммоль) триметилсиланолята калия (Aldrich) и 6.0 мл тетрагидрофурана нагревают при кипении с обратным холодильником в течение часа, потом добавляют еще 0.18 г (1.25 ммоль) триметилсиланолята калия и после 5 часов нагревания при кипении с обратным холодильником реакционную смесь концентрируют. Остаток перемешивают с 20 мл воды, нерастворенный остаток отфильтровывают, к фильтрату добавляют 0.32 мл соляной кислоты, осажденный сырой продукт отфильтровывают и очищают с помощью хроматографической колонки, используя кизелыель 60 (Merck) в качестве адсорбента и смесь - хлороформ: метанол = 9:1 в качестве элюента. Продукт кристаллизуют из диэтилового эфира, что дает 0.22 г (44%) названного соединения. Т.пл.: 248-250°С (диэтиловый эфир).

д) 1-(4-Бензилпиперидин-1-ил)-1-(1,6-дигидро-1,6-диаза-аз-индацен-2-ил)метанон

Названное соединение получают из 1,6-дигидро-1,6-диаза-аз-индацен-2-карбоновой кислоты и 4-бензилпиперидина в соответствии со способом, описанным в примере 1/с. Т.пл.:186-188°С (диэтиловый эфир).

Пример 4

(4-Бензилпиперидин-1-ил)-(2-пропил-8Н-оксазол[5,4-g]индол-7-ил)метанон (4570001079)

a) 1-(4-Бензилпиперидин-1-ил)-1-(6-гидрокси-1Н-индол-2-ил)метанон

Смесь 5.0 г (28.2 ммоль) 6-гидроксииндол-2-карбоновой кислоты [J. Chem. Soc. 1605-1608 (1948)], 4.4 мл (31,6 ммоль) триэтиламина, 5.0 г (28.5 ммоль) 4-бензилпиперидина, 12.0 г (31,6 ммоль) HBTU (Advanced Chem. Tech.) и 50 мл диметилформамида перемешивают при комнатной температуре в течение 6 часов. Выпавший в осадок продукт отфильтровывают и перекристаллизовывают из этанола, что дает 6.75 г (71%) названного соединения. Т.пл.: 214-215°С (этанол).

b) (4-Бензилпиперидин-1-ил)-(2-пропил-8Н-оказол[5,4-g]индол-7-ил)метанон

В атмосфере аргона к раствору 0.5 г (1.49 ммоль) 1-(4-бензилпиперидин-1-ил)-1-(6-гидрокси-1Н-индол-2-ил)метанона и 0.14 г (0.2 ммоль) н-бутиламина в 100 мл димети