Композиция для перорального введения птицам или животным для лечения или снижения риска инфекции пищеварительного тракта (варианты), ее применение (варианты) и способ лечения или снижения риска инфекции пищеварительного тракта (варианты)

Композиция для перорального введения птицам или животным для лечения или снижения риска инфекции пищеварительного тракта (варианты), ее применение (варианты) и способ лечения или снижения риска инфекции пищеварительного тракта (варианты)

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение касается композиции, содержащей ферменты и методологии их применения в качестве противоинфекционных агентов в контексте лечения или снижения риска инфекций пищеварительного тракта.

Уровень техники

В Ревизии 1998 г. Оценок и прогнозов по населению Земли Министерства экономических и социальных проблем населения США предполагалось, что население Земли достигнет в 1999 г. 6 миллиардов. В данном заключении также констатировалось, что населению потребовалось только 12 лет для увеличения с 5 до 6 миллиардов по сравнению с 123 годами, потребовавшимися для того, чтобы вырасти от одного до двух миллиардов. К середине XXI века прогнозируемая численность населения составит между 7,3 и 10,7 миллиарда. Значительный рост населения в последнее десятилетие отчасти обусловлен эффективным прибавлением массы при производстве продуктов питания в результате применения технологий и интенсивных способов производства продуктов питания. Что касается роста населения в будущем, то для сохранения темпа роста необходимо более эффективное увеличение массы продуктов питания при их производстве.

Один из подходов, который сделал производство мяса животных более эффективным, включает широкое применение антимикробных химических агентов и антибиотиков в кормах для животных. На крупных фермах распространение инфекции происходит очень быстро в условиях производства при скученности животных. Вследствие этого борьбу с широким распространением заболевания осуществляют путем профилактического и терапевтического применения данных субстанций. Например, распространена практика введения химических агентов в корма для животных с целью борьбы с кокцидиозными инфекциями (например, салиномицина, монензина, роксарзона (3-нитро), халхинола, карбадокса и олахиндокса), а также антимикробных антибиотиков (например, бацитрацина, вирджиниамицина, тилозина, тетрациклина, хлортетрациклина, пенициллина, олеандомицина, новобиоцина, линкомицина, бамбермицинов, апрамицина, спирамицина, эритромицина, неомицинаидр.). Хорошо известно, что данная практика стимулирует рост и улучшает переработку корма.

Повышение уровня множественной антибиотикоустойчивости среди патогенов человека, таких как Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenza, Neisseria gonorrhoeae и Mycobacterium tuberculosis, породило опасения того, что антибиотикоустойчивость, развивающаяся у микробов, ассоциированных с сельскохозяйственными животными, может мигрировать в патогены человека через факторы переноса лекарственной устойчивости. Имеется доказательство, что животные, которые получают корм с антибиотиками, являются источником бактерий, несущих факторы переноса устойчивости. См. статью Hooge, Feedstuffs, 71(20): 59, (1999). Хотя антибиотики, используемые для животных и человека, в основном различны, существуют аналогии механизмов, которые могли бы привести к перекрестной устойчивости. В одном случае фторхинолоны являются разрешенным средством борьбы с инфекциями Е. coli (колибактериоз) у некоторых животных и используются также для лечения человека. См. статью Hooge, supra. Недавно FDA/CVM (Департамент по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США) предложили отозвать разрешение на применение фторхинолона энрофлоксацина для лечения птицы вследствие появления фторхинолон-устойчивого Campylobacter и переноса его человеку. См. статью Murhead S., Feedstuffs, 72(45): 1-4 (2000).

В отраслях промышленности, связанных с производством мяса, существует также обеспокоенность, что при запрете на применение антибиотиков и антимикробных агентов в кормах может произойти потеря прибыли и могут вновь возникать заболевания животных. Например, в 1986 г. в Швеции было запрещено применение кормовых антибиотиков и повысилась частота заболеваний животных. Это сопровождалось увеличением применения антибиотиков в терапевтических целях, что привело к общему увеличению применения антибиотиков, а также повышению цен на продукцию мясного животноводства. См. статью Smith, Feedstuffs, 71(13): 1, (1999). В декабре 1998 г. Совет министров EU (Европейского союза) решил приостановить применение шести антимикробных агентов, которые были официально разрешены в кормовых стимуляторах роста как отпускаемые без рецепта (Official Journal of the European Communities 29.12.98, Положение Совета No. 2821/98 касательно Директивы 70/524). Две добавки на основе хиноксалина были также запрещены в августе 1999 г. вследствие обеспокоенности относительно остаточных количеств в мясе. Результатом данных действий является увеличение частоты распространения формально подавленных состояний, включая некротический энтерит у бройлеров, энтерит, вызываемый Clostridium perfringens у отнятых от матки поросят, дизентерию и вызываемую спирохетами диарею у свиней и ассоциированную с Е. coli диарею. См. публикацию Miller в сборнике Труды ассоциации по изучению здоровья животных США, 1999 г. (United States Animal Health Association, 1999 Proceedings), "Применение антибиотиков в производстве продуктов животноводства и перспективы развития устойчивости в Европе".

Смерть 30000 людей в год вызвана нозокомиальными инфекциями резистентных патогенов, но гораздо меньше смертей обусловлено патогенами из продуктов питания. Ни одна из смертей от патогенов из продуктов питания не была связана с антибиотикоустойчивостью (см. статью Smith, supra). Таким образом, неясно, вносит ли вклад применение антибиотиков отраслями промышленности, связанными с производством мяса, в проблему патогенов с лекарственной устойчивостью при нозокомиальных инфекциях у человека. Другим аспектом является отсутствие новых антибиотиков для лечения инфекций, вызываемых устойчивыми патогенами. См. статью Henry С.М., Chemical and Engineering News, 6 марта 2000 г., с.41-58. Это могло бы означать, что при появлении патогенов со значительной антибиотикоустойчивостью может не оказаться новых антибиотиков для лечения инфекций. Сложность создания антибиотиков, размер рынка и регламентирующие документы, по-видимому, были причиной ухода фармацевтических компаний от научных исследований и разработок в области создания антибиотиков, в особенности применяемых для животных. Новые представленные правила регистрации лекарственных препаратов, применяемых для животных, являются настолько сложными, что остановили их создание. См. работу Smith, supra. Однако имеется ряд мелких компаний, участвующих в создании новых антибиотиков (см. работу Henry, supra).

В популяциях некоторых животных инфекция уже имеет пандемический характер. Например, кокцидиоз у птиц представляет собой заболевание, которое только лечат, но которое в действительности не находится под контролем. В действительности все стада инфицированы и введение антикокцидиозных химических агентов обычно чередуют в кормах с целью контроля поражения и ограничения развития устойчивых штаммов. Кокцидиоз стоит производителям птицы 350 миллионов долларов ежегодно в виде потерь и стоимости лечения антибиотическими препаратами, такими как салиномицин. См. публикацию Suszkiw, USDA Agricultural Research Service News, 28 октября, 1997. По имеющимся оценкам в 1999 г. в США на кокцидиостатические препараты будет истрачено около 114 милллионов долларов. См. публикацию Frost и Sullivan, U.S. Pharmaceutical Products for Food Animals, Report, 5245-54, 1995.

Имеется явная необходимость в изыскании новых и более эффективных способов борьбы с инфекциями пищеварительного тракта животных, которых выращивают с использованием приемов интенсивного фермерского хозяйства. Данная необходимость основана на потребности повышения эффективности продукции, с целью поддержания соответствия с быстро растущим населением Земли. Улучшение контроля кишечной инфекции гарантирует ускоренный рост и повышение эффективности кормов. Имеется также необходимость создания альтернатив применения антибиотиков в животноводстве в связи с соображениями возможного развития антибиотикоустойчивости у патогенов человека.

В случае применения лечения на основе ферментов, которые действуют способом, отличным от всех антибиотиков, не существует риска стимуляции эволюции резистентных патогенных микроорганизмов, которые представляют собой проблему для здоровья человека. Поскольку ферменты являются белками, отсутствует возможность того, что в мясные продукты попадет вредный химический остаток, как случается при использовании некоторых антибиотиков и антикокцидиозных химических агентов. См. American Feed Control Officials Inc., Official Publication, 1999, "Drugs and Feed Additives, Section 30.0 Enzymes," c.206-217, ISBN 1-878341-10-3.

Сущность изобретения

Таким образом, объектом объектом данного изобретения является разработка ферментативного лечения для снижения воздействия инфекций пищеварительного тракта.

Другим объектом данного изобретения является создание механизма снижения воздействия инфекций пищеварительного тракта путем нарушения связывания патогенов с клетками пищеварительного тракта.

Еще одним объектом изобретения является создание подхода, обеспечивающего улучшение прибавления массы тела и переработки корма для животных, которые инфицированы патогенами, вызывающими инфекции или некротический энтерит.

Следующим объектом данного изобретения является получение лекарственной формы, пригодной для перорального введения, которая является эффективной в плане улучшения состояния субъекта, инфицированного микробным патогеном или с риском инфекции микробным патогеном.

Для осуществления данных и иных объектов в соответствии с одним из аспектов данного изобретения предложена также композиция, содержащая (i) фермент, который расщепляет связь фосфатидилинозита с выходом клеточного поверхностного белка или углевода, и (ii) физиологически приемлемый носитель фермента, причем указанная композиция представлена в форме, пригодной для перорального применения и не содержит иной, чем указанный фермент, противоинфекционный агент. В одном из вариантов осуществления рассматриваемый фермент расщепляет связь, которая обусловливает выход клеточного поверхностного белка.

В предпочтительном варианте осуществления фермент, включенный в композицию, представляет собой сфингомиелиназу или фосфолипазу, в особенности фосфолипазу типа С или типа D. В другом предпочтительном варианте осуществления фермент выбран из группы, состоящей из цереброзидаз и карбогидраз, которые расщепляют связь, что приводит к выходу клеточного поверхностного белка или углевода. В другом варианте осуществления фермент получен из штамма Bacillus cereus, предпочтительно АТСС 7004 или АТСС 6464. Альтернативно фермент получают путем экспрессии рекомбинантной ДНК, кодирующей фермент, в Bacillus megaterium. В другом варианте осуществления фермент содержится в оболочке желатиновой капсулы и присутствует в композиции в концентрации 200 - 4000 IU/кг корма.

В соответствии с другим аспектом данного изобретения представлена композиция, содержащая вышеупомянутые компоненты (i) и (ii), в которой физиологически приемлемый носитель представляет собой кормовой продукт, в который введен фермент. Таким образом, композиция может быть представлена кормом для животных, который не содержит иной, чем данный фермент, противоинфекционный агент. Композиция корма для животных, соответствующая данному изобретению, содержит кроме того зерновой материал, такой как кукуруза, сорго, пшеница, ячмень или овес, источник белка, такой как бобы или горох, а также витамины, аминокислоты и минералы.

В соответствии с другими своими аспектами данное изобретение представляет композицию, как описано выше, которая находится в твердой или жидкой лекарственной форме.

Далее представлен способ лечения или снижения риска инфекции пищеварительного тракта, предусматривающий пероральное введение субъекту, страдающему от инфекции или с риском поражения данной инфекцией, эффективного количества фермента, который расщепляет связь фосфатидилинозита, что приводит к выходу клеточного поверхностного белка или углевода. Кроме того, способ не включает введение противоинфекционного агента, отличного от самого фермента. Инфекция может быть вызвана патогенными простейшими, такими как Eimeria и Cryptosporidium, бактериями, такими как Clostridium, грибами или дрожжами.

Кроме того, представлена еще композиция, содержащая (i) фермент, представляющий собой карбогидразу или цереброзидазу, и (ii) физиологически приемлемый носитель фермента, где композиция находится в форме, пригодной для перорального введения, и не содержит иной, чем данный фермент, противоинфекционный агент.

Далее представлен также способ лечения или снижения риска инфекции пищеварительного тракта, предусматривающий пероральное введение субъекту, страдающему от указанной инфекции или с риском поражения указанной инфекцией, эффективного количества фермента, представляющего собой карбогидразу или цереброзидазу, при этом способ не включает введение вместе с ферментом эффективного в отношении микробов количества другого противоинфекционного агента.

Другие объекты, признаки и преимущества данного изобретения будут очевидны из последующего детального описания. Детальное описание и специальные примеры, хотя они и представляют предпочтительные варианты осуществления, приведены только с целью иллюстрации, поскольку из данного детального описания для компетентных специалистов в данной области будут очевидными различные изменения и модификации, входящие в сущность и объем притязаний изобретения. Кроме того, примеры демонстрируют принцип изобретения и нельзя ожидать, что они будут специально иллюстрировать применение данного изобретения в отношении всех примеров инфекций, против которых эффективность будет очевидной для компетентных специалистов в данной области.

На чертеже представлена активность рекомбинантного фермента PI-PLC, продуцируемого штаммом Bacillus megaterium, в отношении криптоспоридий.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Было обнаружено, что ферменты определенного класса, характеризующиеся способностью расщеплять связь с выходом клеточного поверхностного белка или углевода, проявляют при пероральном применении значительную антибиотическую активность, которая является эффективной, например, при лечении инфекций пищеварительного тракта. Класс ферментов включает в себя, без ограничения перечисленным, сфингомиелиназы и фосфолипазы типа С и D и ферменты с аналогичной специфичностью расщепления. Вследствие этого примерами данного класса являются ферменты, которые расщепляют и высвобождают гликопротеины или углеводы, которые заякорены в мембране посредством связи с фосфатидилинозитом. Таким образом, фермент фосфатидилинозит-специфическая фосфолипаза С (E.G. 3.1.4.10), известная также под аббревиатурой PI-PLC или как 1-фосфатидилинозитфосфодиэстераза, является членом данного класса. Другим примером является гликозил-фосфатидилинозит-специфическая фосфолипаза D или GPI-PLD. См. статью Low и Prasad, Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 980-984 (1988).

Ферменты GPI-PLD и PI-PLC были описаны как выделенные из эукариотических источников. См. раздел, написанный Low "Разложение якорей гликозил-фосфатидилинозита специфическими фосфолипазами" (Degradation of glycosyl-phosphatidylinositol anchors by specificphospholipases"), глава 2, стр.35-63, в монографии "Молекулярная и клеточная биология мембранных белков - гликолипидные якори клеточных поверхностных белков" (Molecular and Cell Biology of Membrane Proteins: Glycolypid Anchors of Cell-Surface Proteins) под ред. A.J.Turner, Ellis Horwood, New York, 1990, статьях Low и Prasad, Proc. Natl. Acad. Scl., 85: 980-984(1988); Essen и соавт., Nature, 380: 595-602, (1996) и Essen и соавт., Biochemistry, 36: 2753-2762 (1997). Описана PI-PLC, выделенная из прокариотических источников, включая экстрацеллюларное образование бактериями. Среди известных бактериальных источников PI-PLC представлены Bacillus cereus (см. статьи Stein и Logan, J. Bacterlol., 85: 369-381, (1963); Stein и Logan, J. Bacteriol., 90: 69-81, (1965); Ikezawa и соавт., Biochimica et Biophysics Acta 450: 154-164, (1976); Griffith и соавт., Methods in Enzymology, 197: 493-502, (1991); Volwerk и соавт., J. Cell. Biochem., 39: 315-325, (1989) и Kuppe и соавт., J. Bacteriol., 171: 6077-6083, (1989)), Bacillus thuringiensis (см. статью Ikezawa и Taguchi, Methods in Enzymology, 71:731-741, (1981); Патентный документ Японии JP 55034039), Staphylococcus aureus (см. статью Low и Finean, Biochem J., 162: 235-240,(1977)) и Clostridium novyi (см. статью Taguchi и Ikezawa, Arch. Biochem. Biophys., 186: 196-201, (1978)).

Были изобретены усовершенствованные способы ферментного анализа на основе флуоресцентного субстрата для фермента PI-PLC. См статьи Hendrickson и соавт., Biochemistry, 31: 12169-12172, (1992); Hendrlckson, Anal. Biochem., 219: 1-8, (1994); Hendrickson и соавт., Bioorg. Med. Chem. Letters. 1: 619-622, (1991).

He придерживаясь определенным образом никакой теории, данные изобретатели подчеркивают, что фермент PI-PLC обладает способностью расщеплять фосфатидилинозитгликолипидные якори поверхностных клеточных белков и других гликозилфосфатидилинозитов. См. статьи Low, supra; Low и Saltiel, Science 239: 268-275,(1988). Например, различные поверхностные гликопротеины и другие поверхностные белки и углеводы ряда паразитических простейших заякорены гликозилфосфатидилинозитовыми липидами (GPI-якорями) и чувствительны к расщеплению и выходу под действием PI-PLC. Иллюстративные виды принадлежат к родам Schistosoma, Toxoplasma, Plasmodium, Trypanosoma и Leishmania (см. статью Low, supra), а также Eimereia, Babesia, Theileria, Giardia, Leptomonas и Entamoeba. См. статьи McConville и Ferguson, Biochemical J., 294: 305-324, (1993); Pearce и Sher J., Immunol., 142: 979-984, (1989); Sauma и соавт., Mol. Med. Biochem. Parasitol., 46: 73-80, (1991); Hawn и Strand, Mol. Med. Biochem. Parasitol., 59: 73-82, (1993).

Данный заякоривающий механизм компонентов клеточной поверхности, по-видимому, является универсальным для эукариотических клеток в диапазоне от клеток дрожжей до млекопитающих. Присутствие GPI-якорей у Giardia lamblia, которую считают очень примитивным эукариотическим организмом, позволяет предположить, что данный вид якоря рано развивается у эукариот. Согласующимся с данным положением является открытие у архебактерий нового фосфоглицеролипида GlcNal-6-мио-инозит-Р-диалкилглицерола (см. статью Nishihara и соавт., J. Biol. Chem., 267: 12432-12435, (1992)), который представляет собой основу более сложных структур эукариотических GPI-якорей, которые возникли в процессе эволюции. У простейших система GPI-заякоривания используется более сильно, чем у высших эукариот, и имеется доказательство, что GPI-заякоренные структуры являются важными для выживания паразита в насекомых и млекопитающих-хозяевах (см. статью (McConville и Ferguson, supra). Например, часто встречающееся прикрытие различных поверхностных гликопротеинов может быть механизмом избежания атаки иммунной системы.

Простейшее Eimeria tenella содержит фосфатидилинозит-заякоренные структуры, подобные гликопротеину/гликолипиду Trypanosoma brucei. Полагают, что данные структуры являются важными для присоединения к мембране и последующей инфекции. См. статью Gumett и соавт., Mol. Med. Biochem. Parasitol., 41: 177-186, (1990). Структуры Eimeria расщепляются липазой трипаносом и PI-PLC Bacillus thuringiensis (см. статью Gumett, supra). Лечение паразитов in vivo с помощью PI-PLC, если будет показана его осуществимость, вероятно, помогло бы иммунной системе и нарушило бы присоединение и инфекцию патогенов, попавших в пищеварительный тракт. Виды Eimeria представляют собой широко распространенную и дорогостоящую проблему в птицеводстве. Другое паразитическое простейшее, Cryptosporidium parvum, широко распространено и вызывает острую диарею у человека и многих животных. На основании последовательности ДНК и того, что моноклональные антитела, реактивные с данным белком спорозоита, подавляют инфекцию, предсказано, что белок спорозоита GPI 5/45/60 является GPI-связанным белком (см. статьи Strong W.B., и соавт., Infection and Immunity, 68: 4117-4134, (2000); Cevallos A.M. и соавт., Infection and Immunity, 68: 4108-4116, (2000)). Таким образом, С. parvum является другим патогеном, который потенциально лечится с помощью PI-PLC.

Прокариотические бактерии не содержат поверхностные гликопротеины и углеводы, заякоренные фосфатидилинозитом (см. статью McConville и Ferguson, supra), но PI-PLC также могла бы снизить бактериальные инфекции путем нарушений процесса присоединения. Патогенная Е. coli и ряд других хорошо известных патогенных представителей семейства Enterobacteriaceae экспрессируют бактериальный адгезин FimH - связывающий маннозу лектин мол. массы 29 кД, присутствующий на дистальном конце фимбрий. См. статью Abraham и соавт., Nature, 336: 682-684, (1988). Было показано, что данный адгезин связывается с CD48 мастоцитов - GPI-заякоренной молекулой. См. статью Malaviya и соавт., Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 96: 8110-8115, (1999). Расщепление in vitro с помощью PI-PLC снижает связывание мутантного GPI-заякоренного рецептора дифтерийного токсина (из Corynebacterium diphtheria) с мышиными клетками NIH3T3. См. статью Lanzrein и соавт., EMBO J., 15: 725-734, (1996). Кроме того, оба, альфа-токсин Clostridium septicum и аэролизин Aeromonas hydrophila, присоединены к клеточной поверхности посредством С-концевого GPI-якоря и могут быть удалены с клеточной поверхности при обработке PI-PLC. См. статью Gordon и соавт., J. Biol. Chem., 274: 27274-27280, (1999).

Для PI-PLC механизм снижения эффекта бактериальной инфекции связан с освобождением CD48-связывающего центра мастоцитов-хозяев. Кроме того, связывание FimH с мастоцитами запускает воспалительную реакцию. Вследствие этого в соответствии с данным изобретением уменьшение числа центров связывания также снижало бы воспаление, которое могло бы стать чрезмерным и повредить здоровью самого кишечника, поскольку воспалительная реакция включает выход фактора некроза опухоли α (см. статью Malaviya, supra). Так, посредством данного механизма снижения воспаления и последующей секреции фактора некроза опухоли лечение фосфолипазой в соответствии с данным изобретением должно облегчать симптомы, характеризующиеся такими состояниями, как синдром раздраженной кишки, колит и болезнь Крона. См. статью van Deventer S.J., Ann. Rheum. Dis., 58(1): I114-I120 (ноябрь, 1999).

Данное изобретение было бы эффективным также в отношении вирусных инфекций вследствие нарушения связывания вирусных частиц и клеток, которые вирус инфицировал бы in vivo. В свете обнаружения данными изобретателями эффективности перорального применения, описанной в данном контексте, интересно, что предварительная обработка вируса гриппа фосфолипазой С, вызывающая выход приблизительно 50% вирусного фосфолипида, приводила к значительному снижению инфекционности в отношении куриных эмбрионов. См. статью Mizutani и соавт., Nature, 204: 781-782, (1964). Напротив, предварительная обработка культивируемых фибробластов куриных эмбрионов фосфолипазой С, выделенной из Clostridium perfringens, в значительной степени подавляла в клетках последующую инфекцию вируса Semliki Forest. См. статью Friedman и Pastan, Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 59: 1371-1378, (1968). Хотя область техники недальновидно не признает терапевтической важности данных феноменов, они согласуются с одним механизмом, который, как полагают, лежит в основе данного изобретения, а именно: расщепление связи патоген-поверхностный лиганд или близкий ему рецептор клеточной мембраны нарушает взаимодействие, необходимое для инфекции.

Другой аспект, где данное изобретение может быть эффективным в плане предупреждения вирусной инфекции, представляет собой блокирование связывания вирусных GPI-заякоренных белков с чувствительными клетками. Примером вирусного GPI-заякоренного белка, который чувствителен к расщеплению с помощью PI-PLC, является вирус Денге NS1 (неструктурный белок 1). См. статью Jacobs и соавт., FASEB J., 14: 1603-1610, (2000). Имеется ряд примеров GPI-заякоренных белков клеток-хозяев, которые представляют собой центры связывания вирусов. Данные примеры включают человеческий эховирус 6, 7, 12 и 21, а также энтеровирус 70, которые связывают GPI-заякоренный CD55 (фактор, ускоряющий распад, DAF). См. статьи Clarkson и соавт., J. Virology, 69: 5497-5501, (1995); Bergelson и соавт., Ргос. Natl. Acad. Scl. USA, 91: 6245-6248, (1994) и Kamauchow и соавт., J. Virology, 70: 5143-5152, (1996). Инфекции собачьего парвовируса (CPV) можно блокировать in vitro предварительной обработкой кошачьих клеток с помощью PI-PLC. См. статью Barbis и Parrish, Brazilian, J. Med. Biol. Res., 27: 401-407, (1994).

Некоторые клеточные поверхностные рецепторы, имеющие определенное значение в инициировании инфекций, присоединены к мембранам с помощью механизмов, отличных от GPI-якорей. Они включают такие структуры, как холестериновые сложные эфиры (см. статью Rostand и Esko, J. Biol. Chem., 268: 24053-24059, (1993)), нефосфорилированные гликосфинголипиды (Karlsson, Am. Rev. Biochem., 58: 309-350, (1989)) и другие фосфолипиды, такие как фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин. См. статью Sylvester, Infect. Immun., 64: 4060-4066, (1996).

Вследствие этого по вышеуказанным причинам направленность на данные структуры соответствующих эстераз, цереброзидаз, карбогидраз и фосфолипаз, активных в плане высвобождения данных структур из клеточных поверхностей, дала бы положительные эффекты при пероральном введении в соответствии с данным изобретением при лечении инфекций пищеварительного тракта.

В силу универсальной природы поверхностных белков и углеводов, связанных посредством фосфатидилинозита, у эукариот терапевтическая методология, соответствующая данному изобретению, предусматривающая в остром случае или профилактически введение фермента с целью расщепления заякоривающей связи данных поверхностных клеточных белков или углеводов, найдет широкое применение при лечении инфекций пищеварительного тракта простейшими, бактериями, грибами и вирусами. С этой стороны, ключевым аспектом данного изобретения является демонстрация того, что фермент, активный не только в плане расщепления компонентов поверхности клетки, может быть перорально введен в качестве противоинфекционного агента и быть эффективным in vivo. Примечательно, что, хотя репрезентативный подходящий фермент, PI-PLC, был доступен с 1960-х годов, данный подход ранее не предлагался.

Другим аспектом данного изобретения является применение фермента, как описано выше, в качестве эффективного противоинфекционного агента в кормовых препаратах для животных, которые служат для лечения или снижения риска инфекций пищеварительного тракта у животных, которые употребляют корм. Известны кормовые препараты, которые содержат эндо-1,4-β-D-маннаназу, и в ряде публикаций имелось предположение о противогрибковой активности маннаназы. См. патентную публикацию WO 00/21381 (РСТ/ЕР 99/07835) и статью Kudo и соавт., Experentia, 48: 227-281, (1992). В данных случаях маннаназу комбинируют с известным антибиотиком, хотя в общем плане обсуждалась перспектива применения фермента в корме, не содержащем антибиотик. См. публикацию Adams, Feed Mix (Special 2000), стр.16-18.

Вследствие этого в одном из своих аспектов настоящее изобретение касается композиций, включая кормовые композиции, которые содержат фермент, характеризующийся вышеупомянутой активностью расщепления, который отличен от маннаназы или, в частности, отличен от эндо-1,4-β-D-маннаназы, как отличается, например, от маннан-направленного фермента с иной специфичностью расщепления, как описано в Номенклатуре ферментов (Enzyme Nomenclature) 1992 (Academic Press) (см. разделы 3.2.1.77, 3.2.1.78, 3.2.1.101, 3.2.1.106, 3.2.1.130 и 3.2.1.137). Кроме того, настоящее изобретение подразумевает композицию, которая содержит данный фермент, включая маннаназу, но не содержит никакой другой противоинфекционный агент.

Таким образом, в соответствии с данным изобретением неклеточный ферментный препарат, полученный из Bacillus cereus и стандартизованный по содержанию PI-PLC, может быть использован для получения очень значительного улучшения в плане прибавки массы тела и усвоения корма при наличии инфекции. Данный результат является неожиданным, поскольку B. cereus является оппортунистическим патогеном, который обычно вызывает связанные с кормом гастроэнтериты и эндофтальмит, обусловленный B. cereus.

В ранних исследованиях показано, что инъекция экстрацеллюларного фермента В. anthracis или В. cereus кроликам вызывает фосфасемию и даже гибель. Например, см. статью Stein и Logan, J. Bacterlol., 85: 369-381, (1963). Вследствие этого неожиданно, что экстрацеллюларный фермент из патогена, который вызывает гастроэнтерит, согласно данному изобретению мог бы обладать лечебным действием в отношении заболевания, вызываемого бактериальной инфекцией.

Bacillus cereus вырабатывает множество экстрацеллюларных активных в отношении мембраны ферментов и цитолитических токсинов, включая PI-PLC и цереолизин АВ, состоящий из фосфолипазы С и сфингомиелиназы. См. статью Gilmore, J. Bacteriol., 171: 744-753, (1989). Полагают, что в вышеупомянутом ферментном препарате экстрацеллюларная фосфатидилинозит-специфическая фосфолипаза С [E.G. 3.1.4.10], образуемая 8. cereus, является активным ингредиентом. Ферментный лечебный препарат, соответствующий данному изобретению, эффективно действует как кокцидиостатик и антибиотик. Вследствие этого данный подход является эффективным и коммерчески приемлемым для лечения инфекций пищеварительного тракта, в особенности в случае запрета используемых в настоящее время субстанций.

При отсутствии покрытия ферменты могут необратимо инактивироваться желудочным соком. В Патенте США No. 4079125 описаны усовершенствованные содержащие ферменты композиции с энтеросолюбильным покрытием для приема через рот млекопитающими с дефицитом ферментов. Удивительно, что введение PI-PLC в корм для животных без покрытия обеспечивает эффективное лечение инфекций патогенов.

Предпочтительно ферментные композиции, соответствующие изобретению, приготовлены в виде в виде сухих, твердых или жидких композиций для перорального применения. Данные композиции в основном будут включать стабилизаторы, такие как буфер, углевод и/или гликоль. Сухие препараты ферментов, стабильные при хранении, которые являются пригодными, в соответствии с данным изобретением, для введения в таблетки или капсулы, могут быть, например, приготовлены путем лиофилизации, распылительной сушки в сушилке с псевдоожиженным слоем с инертным или углеводным носителем или путем использования технологий выпаривания в сочетании со стеклообразующими стабилизаторами. См. статью Franks и соавт., Biopharm., 4: 38-55, (1991). Другой подход включает осаждение соли, например, получение осадка с помощью сульфата аммония или растворителя и использование ацетона для получения порошка с последующей сушкой и перемешиванием с носителем.

Некоторые углеводы, в особенности моносахариды, дисахариды и низшие олигосахариды представляют собой важные стеклообразующие углеводы. Примерами углеводов для применения в качестве носителей являются в числе других ксилоза, фруктоза, глюкоза, сорбит и мальтотриоза, как описано в статье Franks, supra. Выбор углеводного носителя основан на совместимости с ферментом, тенденции к низкой гигроскопичности и удовлетворительной кривой стеклования. Стабилизатор трегалоза является особенно подходящим для получения биологических агентов, стабильных при комнатной температуре. См. Патент США No. 4891319, статьи Roser, Biopharm. 4 (8): 47-53, (1991); Colaco и соавт., Bio/Technology, 10: 1007-1011, 1992; публикацию Aldridge, Genetic Engineering News, 15 марта 1995 г., стр.10-11.

Ферменты, соответствующие данному изобретению, могут быть приготовлены в виде жидкостей, например, в виде сиропов, содержащих сорбит или глицерин, для снижения активности воды и стабилизации белка. Данные растворы, как правило, стерилизуют фильтрацией перед фармацевтическим применением.

Как отмечено ранее, данное изобретение в одном из аспектов касается доставки фермента в виде компонента корма или продукта питания. Корма состоят в основном из зернового материала, источника белка, витаминов, аминокислот и минералов. Зерновой материал, как правило, включает кукурузу, сорго, пшеницу, ячмень или овес. Источником белков могут быть, например, бобы или горох. Примеры минералов, аминокислот и витаминов включают В₁₂, А, пантотеновую кислоту, никотиновую кислоту, рибофлавин, К, DL-метионин, L-лизин, холина хлорид, фолиевую кислоту, фосфат дикальция, сульфонат магния, сульфат калия, карбонат кальция, хлорид натрия, селенит натрия, оксид марганца, иодат кальция, оксид меди, оксид цинка и D-активированный стерин животного происхождения.

Для применения в кормах жидкий препарат фермента может быть приготовлен с водным раствором соли (например, NaCl, 15-18% мас./мас.) или с сиропом для снижения активности воды и предотвращения роста микробов в концентрированном продукте. Другие консерванты для корма, такие как бензоат натрия, пропилпарабен, сорбат натрия или калия и аскорбилпальмитат представляют собой примеры разрешенных химических консервантов, которые также могут быть использованы для предотвращения потенциальной порчи вследствие микробного роста в продукте. См. Association of American Feed Control Officials (Ассоциация американских официальных контролеров по кормам), Inc., Official Publication (Официальная публикация) 2000, часть 18, "Химические консерванты" ("Chemical Preservatives"), стр.215-217, ISBN 1-878341-11-1. Данные консерванты могут применяться в кормах посредством дополнительного гранулирования с использованием большого разведения с использованием технологии автоматизированного распыления. См. публикацию Fodge и соавт., Feedstuffs, 29 сентября 1997. Данные жидкие препараты могут содержать стабилизирующие углеводы, такие как сорбит или глицерин при совместимости. Для повышения эффективности могут быть включены материалы, которые являются желательными компонентами корма, такие как другие термолабильные ферменты или витамины.

В случаях, когда корм используют в негранулированной кормовой смеси (т.е. не прошедшей тепловую обработку), ферменты, соответствующие данному изобретению, могут быть представлены в виде сухого концентрата для добавления в смеситель для корма. Такие сухие концентраты ферментов готовят путем первого концентрирования жидкого препарата фермента, используя NMWC 10 кД или другой подходящий ультрафильтр для достижения высокого процента содержания фермента, с последующим смешиванием с очень сухим носителем, таким как кукурузная крупа, соевая крупа или даже инертный материал или нерастворимая соль, которые разрешены к применению в кормах. См. Official Publication, American Feed Control Officials, supra. Часть 582, "Субстанции, в основном рассматриваемые как безопасные к кормах для животных" ("Substances generally regarded as safe in animal feeds.")

Существует ряд способов получения ферментов, достаточно стабильных для того, чтобы переносить процесс гранулирования в некоторых мельницах для кормов при пониженных температурах с сохранением достаточной активности для того, чтобы работать в пищеварительном тракте. Хорошо известно, что модификация структуры белка, во-первых, путем изменения кодирующей последовательности ДНК или, во-вторых, путем химической модификации может сделать ферменты более стабильными в отношении инактивации. В этом плане одной из иллюстраций является применение химического перекрестного сшивания кристаллов ферментов. См. статью Collins и соавт., Organic Process Research and Development, 2(6): 400-406, (1998). Другой подход к повышению стабильности фермента, соответствующего данному изобретению, предусматривает изменение аминокислот путем мутагенеза гена, который кодирует представляющий интерес фермент, или путем получения генов или фрагментов генов для перетасовки. См. статьи Crameri и соавт., Nature, 391: 288-291, (1998); Arnold, Nature Biotechnol., 16: 617-618, (1998b); Zhao и соавт., Nature Biotechnol., 16: 258-235, (1998); Zhao и Arnold, Protein Eng., 12: 47-53, (1999). Возможной является также мутация и селекция для "направленной эволюции" ферментов с желательными свойствами. Например, см. статьи Giver и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 12809-12813, (1998); Liao и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 576-580, (1986); Cherry и соавт., Nature Biotechnol., 17: 379-384, (1999).

Некоторые модификации белков, включая гликозилирование, полиэтиленгликилирование и сукцинилирование, также могут повышать стабильность и изменять оптимум рН, характеристики, которые могли бы быть оптимизированы у ферментов, предназначенных для применения в данном изобретении. Таким образом, в этом плане известные протоколы можно было бы использовать для получения модифицированного фермента для тестирования в соответствии с примерами с целью оценки применимости в соответствующей изобретению методологии лечения.

Эффективный способ получения PI-PLC основан на клонировании гена 6. cereus в В. megaterium. Экспрессионная система (см. статью Rygus и Hillen, Appl. Microbiol. Bacteriol., 35: 594-599, (1991)) позволяет применять элементы из регулона ксилоэы Bacillus megaterium (см. статью Rygus и соавт., Arch. Microbiol., 155: 535-542, (1991)) и коммерчески производится В10101 Corp. (Vista, California). Получают слияние лидерной кодирующей последовательности гена PI-PLC и первых трех аминокислот гена xylA В. megaterium в плазмиде, стабилизированной устойчивостью к тетрациклину и регулируемой чувствительным к ксилозе репрессором. Штаммы данного типа с усиленной экспрессией представляют собой средство, пригодное для получения PI-PLC в коммерчески приемлемых количествах для включения в корм для животных в соответствии с данным изобретением.

Некоторые изоляты Bacillus cereus продуцируют антибиотики, такие как туникамицин. См. статью Kamogashira и соавт., Agric. Biol. Chem., 52:859-861, (1988). Другой изолят Bacillus cereus (ATCC 53522) описан в Патентах США No. 4877738 и No. 5049379 как агент для биологической борьбы для предупреж