Фармацевтические композиции устойчивого пролонгированного выделения для парентерального введения биологически активных гидрофильных веществ

Фармацевтические композиции устойчивого пролонгированного выделения для парентерального введения биологически активных гидрофильных веществ

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям пролонгированного выделения (высвобождения) для парентерального введения активных ингредиентов, являющихся гидрофильными веществами или становящимися таковыми в результате соответствующей дериватизации, в виде устойчивых, биологически совместимых и легко получаемых микроэмульсий типа вода в масле (w/o). Более конкретно, пептидные активные ингредиенты или биологически активные олиго- или полисахариды, которые желательно защитить от немедленной атаки гидролитических энзимов, присутствующих в живом организме, а также обеспечить их пролонгированное действие во избежание повторных применений, могут с успехом быть сформированы из указанных микроэмульсий. Указанные рецептуры терапевтического назначения можно применять в виде инъекций без каких-либо проблем и без существенных побочных эффектов, их легко получать в промышленном масштабе, что представляет собой важное техническое усовершенствование.

Описание уровня техники

В широком смысле слова, под микроэмульсиями понимают оптически изотропные системы, не проявляющие двойного преломления в лучах поляризованного света, прозрачные, термодинамически устойчивые, состоящие из чрезвычайно мелких капель с диаметром в интервале от 5 до 200 нм, получаемые в результате диспергирования двух не смешивающихся жидкостей и стабилизирующиеся в присутствии эмульгаторов, которые модифицируют физико-химические свойства поверхности раздела между указанными жидкостями, в результате чего поверхностное натяжение снижается почти до нуля. Для формирования таких микроэмульсий обычно используют масло, воду, поверхностно-активное вещество или тензид и, необязательно, вспомогательное поверхностно-активное вещество или со-тензид; тенденция к формированию микроэмульсии типа вода в масле (w/o) или масло в воде (o/w) зависит от соотношений между количеством водной и масляной фаз, а также от природы поверхностно-активного вещества. На практике, на основании экспериментальных данных строят диаграмму состояния для трехкомпонентной системы, компонентами которой являются вода, гидрофобное соединение и смесь основного и вспомогательного поверхностно-активных веществ и с помощью такой диаграммы выбирают участки, в которых существуют устойчивые микроэмульсии типа вода в масле и масло в воде. Так например, Aboofazeli с сотр. (Int.J.Pharm. Ill (1994) 63-72) исследовали способность различных соединений проявлять со-поверхностно-активное действие в образовании микроэмульсии типа вода в масле (W/O). Система, изученная авторами указанной работы, состояла из смесей эфира жирной кислоты, двойной системы лецитин-со-поверхностно-активное вещество в соотношении 1:1 и воды, взятых в различных соотношениях. Была установлена следующая шкала изменения эффективности соединений, применяемых в качестве со-поверхностно-активных компонентов: первичные амины> спирты> жирные кислоты. Кроме этого, было установлено, что эффективность связана с длиной цепи алкильного фрагмента спирта и соответствующей жирной кислоты; эффективность изменялась в ряду бутанол> пентанол> гексанол> пентановая кислота> гексановая кислота. На основании полученных экспериментальных данных, наилучшими кандидатами для использования, по-видимому, являются такие спирты, как бутанол и пентанол и, в меньшей степени, соответствующие жирные кислоты. Использование описанных соединений позволило получить устойчивые микроэмульсии типа вода в масле (w/o), но при этом не удалось обеспечить удовлетворительную устойчивость указанных рецептур, в особенности при применении в качестве депо, когда состав, подкожная и внутримышечная ткань остаются в состоянии контакта в течение дней или даже недель.

Кроме этого, из литературных источников известно, что решающее значение имеет соотношение между основным и вспомогательным поверхностно-активным веществом; данные полученные Aboofazeli с сотр. относятся к соотношению между двумя такими компонентами, равному 1:1. Atwood с сотр. (Int.J.Pharmacy 84 R5 (1992)) исследовали поведение смесей лецитин/вода/эфир жирной кислоты/бутанол, в которых соотношение между основным и вспомогательным поверхностно-активными веществами повышалось от 1,7 до 3. Авторы установили, что уменьшение количества со-поверхностно-активного компонента в пользу лецитина резко ограничивает область, в которой наблюдается существование микроэмульсии типа вода в масле (w/o), даже при использовании такого чрезвычайно эффективного со-поверхностно-активного вещества, как бутанол.

Поверхностно-активные вещества обычно классифицируются в соответствие с эмпирической шкалой, известной как гидрофильно-липофильный баланс (HLB), имеющих значение в интервале от 1 до 40. Как правило, поверхностно-активные вещества, подходящие для формирования микроэмульсий типа w/o обладают низким значением HLB, тогда как те, что обеспечивают получение микроэмульсий типа o/w, имеют высокие значения HLB. При величине поверхностного натяжения <2×10^-2 дин/см, могут образовываться устойчивые микроэмульсии. Необязательное присутствие со-поверхностно-активных веществ позволяет повысить межфазную подвижность, поскольку молекулы со-поверхностно-активного вещества проникают между молекулами поверхностно-активного компонента, вследствие чего образуется неоднородная поверхностная пленка. Вспомогательные поверхностно-активные вещества также способны понижать гидрофильность водной фазы и, следовательно, поверхностное натяжение между двумя фазами. В принципе, использование со-поверхностно-активного вещества полезно в том плане, что оно позволяет уменьшить количество необходимого поверхностно-активного компонента с повышением устойчивости микроэмульсии; однако, как отмечалось выше, предпочтительно ограничивать использование таких веществ, поскольку они обладают потенциальной местной токсичностью, особенно в случае продолжительного контакта между носителем, подкожной и внутримышечными тканями.

Известны многочисленные преимущества применения микроэмульсии в качестве носителя активных ингредиентов.

При специальных соотношениях между компонентами, микроэмульсии могут образовываться спонтанно без необходимости высоких усилий для их образования; в связи с этим может быть облегчено производство таких микроэмульсий в промышленном масштабе. Указанные спонтанные микроэмульсии термодинамически устойчивы, гомогенны и прозрачны, в связи с чем их мониторинг может осуществляться спектроскопическими методами. Могут быть получены микроэмульсии со средним диаметром <100 нм, которые могут быть подвергнуты холодной стерилизации в результате фильтрации через 0,22 микронные промышленные мембранные фильтры. Такие микроэмульсии позволяют применять плохо растворимые или малоустойчивые лекарства.

Помимо этого, в указанных системах может происходить обращение фаз в присутствии избытка диспергированной фазы, или вследствие изменения температуры: такое свойство может влиять на биодоступность активного ингредиента, причем механизм этого явления к настоящему времени остается неясным.

Микроэмульсии типа вода в масле (w/o) способны контролируемым образом выделять активный ингредиент или увеличивать срок его устойчивости в физиологических жидкостях в результате защиты от воздействия гидролитических ферментов. Имеется ряд обзоров по микроэмульсиям, например, "Industrial application of microemulsions" Marcel Dekker Ed. 1997, представляющий главу книги "Microemulsions in the Pharmaceutical field: perspectives and applications", относящейся к их использованию в фармацевтической области, и "Handbook of Microemulsion Technology", Ed. Kumar Mittal (1999), касающийся физико-химических аспектов.

В патентной литературе описывается применение w/o микроэмульсий в качестве носителей, обеспечивающих регулируемое выделение активных ингредиентов, являющихся гидрофильными веществами или приобретающими такие свойства в результате соответствующей дериватизации.

В частности, для таких биодеградируемых молекул, как пептиды, парентеральное применение w/o микроэмульсий, содержащих указанные активные ингредиенты, отмечается в исследовании [M.R.Gasco с сотр., Int.J.Pharm., 62, 119 (1990)], в котором аналог LHRH гормона, сформулированный в микроэмульсии, включающей компоненты, считающиеся биосовместимыми, и содержащей 500 мкг/мл активного ингредиента, применяемой путем однократной внутримышечной инъекции с дозировками около 3 мг/кг на взрослых самцах крыс весом около 200 г, понижал уровни содержания тестостерона в плазме крови в течение времени до 30 дней после инъекции; причем указанные уровни оказались более низкими, чем те, что наблюдались во второй группе мышей, получавших повторяющиеся инъекции (один раз в день в течение 28 дней) при дозировках активного ингредиента в буферном растворе 100 мкг/кг.

Вместе с тем, следует подчеркнуть, что отмеченное снижение концентрации тестостерона не было однородным за время наблюдения и оно становилось терапевтически эффективным только через 8 дней после применения.

Такое замедление терапевтического эффекта не является особенно желательным при лечении опухолей предстательной железы, для роста которых требуется тестостерон; в связи с этим, чем быстрее предотвращается нормальная продукция тестостерона, тем более эффективным оказывается процесс лечения.

В цитированных выше статьях продемонстрирована эффективность w/o микроэмульсии, состоящей из этилолеата (60,5%), воды (10,1%), фосфатидилхолина (18,9%) и капроновой кислоты (10,5%) в плане пролонгированного выделения пептида. Соотношение поверхностно-активного вещества (фосфатидилхолин) к вспомогательному поверхностно-активному веществу (капроновая кислота) составляет 1,8. Каждый из компонентов указанной микроэмульсии рассматривается авторами как биосовместимое вещество. В работе не содержится каких-либо сведений о биосовместимости микроэмульсии в целом и о состоянии подкожной ткани, контактирующей с рецептурой.

В соответствии с цитированной статьей, получали w/o микроэмульсию, содержащую в качестве активного ингредиента ацетат леупролида, обладающий LHRH активностью, состоящую из этилолеата (66,9%), воды (9,7%), фосфатидилхолина (19,4%) и смеси капроновой и масляной кислот в соотношении 3/1 (3,9%).

В соответствие с данными статьи, смесь с масляной кислотой использовали вместо одной капроновой кислоты с целью минимизации соотношения между поверхностно-активным и со-поверхностно-активным веществом, которое в рассматриваемом случае составляло 4,9 вместо 1,8. Согласно данным испытания in vivo, проведенного в результате подкожной инъекции продукта крысам, была подтверждена эффективность препарата, но при этом неожиданно наблюдали вызывающие тревогу местную ульцерогенность и устойчивое образование подкожных гранулом. Такой фармакологически неприемлемый результат, несмотря на использование пониженных количеств со-поверхностно-активного агента, показывает, что биосовместимость индивидуальных компонентов микроэмульсии недостаточна для обеспечения биосвместимости смеси, составляющей микроэмульсию при парентеральном применении.

Подобным образом, несмотря на то, что смеси, описанные и заявленные в различных патентах, например, в WO 94/08610, образуют устойчивые микроэмульсии и обеспечивают регулируемое во времени выделение активного ингредиента, нет указаний для специалиста в данной области, как можно обеспечить пролонгированное действие гидрофильного активного ингредиента, избежав указанных выше побочных эффектов. Рассматриваемые микроэмульсии, фактически состоят из различных количеств воды, масляного компонента, поверхностно-активного компонента, поверхностно-активного со-компонента и необязательных электролитов. В цитированной работе не была проведена оценка биосовместимости микроэмульсии "in-toto" (в целом), не указаны необходимые соотношения между компонентами смеси и активным ингредиентом, обеспечивающие устойчивость как активного ингредиента, так и микроэмульсии, а также биосовместимость состава (рецептуры).

С другой стороны, в рассматриваемых патентах нет специального рассмотрения проблем, касающихся местной толерантности связанной с внутримышечным (i.m.) и подкожным (s.c.) применениями, являющимися наиболее подходящими и легкими путями парентерального введения.

Альтернативная методика уже используемая в промышленном масштабе для пролонгированного выделения пептидов описана и заявлена в ряде патентов, например в патенте США 3976071, в котором такое выделение достигается в результате использования биоразрушаемых полимеров, в которые внедрен активный ингредиент. Типичными примерами биодеградируемых полимеров могут служить полимеры на основе гликолевой кислоты и молочной кислоты. Недостаток рассматриваемой методики состоит в ее относительно высокой стоимости и трудоемкости по сравнению с описанными выше микроэмульсиями, кроме того, такая технология требует использования в ходе приготовления органических, особенно, хлорированных, растворителей, что создает проблемы, связанные с загрязнением окружающей среды и безопасностью фармацевтической рецептуры.

С другой стороны, преимущество рассматриваемых рецептур состоит в том, что они не вызывают образования устойчивых гранулом и не индуцируют локальную ульцерогенность.

Описание изобретения

Цель настоящего изобретения состоит в разработке фармацевтических композиций пролонгированного выделения в виде устойчивых w/o микроэмульсий, которые могут быть легко получены, легко стерилизуются и не вызывают значительных системных или местных побочных эффектов, хорошо подходят для парентерального введения, предпочтительно внутримышечного (i.m.) или подкожного (s.c.) активных ингредиентов, которые являются гидрофильными веществами или им могут быть приданы гидрофильные свойства в результате соответствующей дериватизации, в результате чего достигается существенное техническое усовершенствование известного способа.

Разработана методика, включающая клинические, аутопсические и гистологические исследования животных, обработанных описанными выше микроэмульсиями, пригодными для оценки биосовместимости любых рецептур, предназначенных для пролонгированного применения.

Согласно рассматриваемому способу микроэмульсия считается приемлемой согласно установленным в литературе требованиям (Protein Formulation and Delivery - F.J.McKelly 2000, страницы 245-247) когда любая локальная припухлость, отмеченная в большей или меньшей степени в зависимости от применяемой дозы, в любом случае является обратимой; с другой стороны, аналогичные реакции ткани также наблюдаются для материалов, считающихся биодеградируемыми, причем указанные реакции оказываются важными в плане влияния на пролонгированное выделение лекарственного средства. Местная непереносимость в виде устойчивого изъязвления напротив рассматривается, как неприемлемая.

Микроэмульсии настоящего изобретения содержат до 20% внутренней гидрофильной водной фазы, содержащей активный ингредиент, 30-98% гидрофобной внешней фазы и до 50% поверхностно-активного соединения или его смеси с поверхностно-активным со-компонентом. Микроэмульсия предпочтительно содержит ≤35% основного и вспомогательного поверхностно-активного вещества, при соотношении поверхностно-активного вещества к вспомогательному поверхностно-активному веществу ≥2, и наиболее предпочтительно ≥3,5.

Рассматриваемые микроэмульсии также могут содержать другие биологически совместимые эксипиенты, не оказывающие влияния на устойчивость микроэмульсии.

Подходящие поверхностно-активные микроэмульсии настоящего изобретения выбирают из природных или синтетических глицерофосфолипидов, содержащих остатки C₄-C₂₀ насыщенных или ненасыщенных карбоновых кислот, а в качестве фосфоэфирного фрагмента остаток холина, этаноламина, серина, глицерина; холестерина; сложных эфиров жирных кислот C₁₂-C₂₀ таких сахаров, как сорбит, галактоза, глюкоза, сахароза; сложных эфиров жирных кислот C₁₂-C₂₀ полиоксиэтиленсорбита.

Необязательно присутствующие в системе вспомогательные поверхностно-активные вещества выбирают из жирных кислот С₈-С₂₀, C₂-C₁₄ полигидроксиалканов, в особенности пропиленгликоля, гександиола и глицерина, C₂-C₁₂ спиртов, сложных эфиров молочной кислоты с остатками спиртов C₂-C₈.

Гидрофобную непрерывную фазу выбирают из следующих соединений, как таковых или в виде смесей: сложных эфиров С₈-С₂₀ насыщенных или ненасыщенных карбоновых кислот с остатками спиртов С₈-С₂₀, или моно-, ди-и триглицеридов жирных кислот C₈-C₂₀, или растительных масел, подходящих для парентерального применения, таких как соевое, арахисовое, сезамовое, хлопковое и подсолнечное масло.

Микроэмульсии настоящего изобретения дополнительно характеризуются значениями рН в интервале от 4,5 до 7,5, предпочтительно от 5 до 7, причем указанное значение рН, если оно не характерно для микроэмульсионных композиций, предпочтительно устанавливают добавлением в микроэмульсию подходящего количества природной аминокислоты, что не оказывает влияния на устойчивость эмульсии и средний размер капелек.

Микроэмульсии настоящего изобретения типа вода в масле (w/o) особенно подходят для использования в качестве носителей пептидов, главным образом таких аналогов LHRH, как ацетат леупролида, госерелин, триптолерин, ацетат нафарелина, гистрелин, цетрореликс, или соответствующие ацетаты, или такие пептиды, как соматостатин, либо такие его аналоги, как октреотид и ацетат ланреотида.

Кроме этого, микроэмульсии изобретения особенно подходят для использования в качестве носителей полисахаридов, в особенности нефракционированного гепарина или гепаринов с низким молекулярным весом.

Микроэмульсии настоящего изобретения позволяют получать рецептуры с пролонгированным выделением гидрофильных активных ингредиентов. Указанные рецептуры пролонгированного действия, представляющие еще одну цель настоящего изобретения, не вызывают локального изъязвления и не продуцируют устойчивых гранулом, которые повторно абсорбируются в течение времени, пока лекарственный препарат эффективен. В случае пептидов типа LHRH, в особенности ацетата леупролида, госерелина, триптолерина, ацетата нафарелина, гистрелина, цетрореликса или соответствующих ацетатов, может быть достигнуто пролонгированное выделение в течение, по меньшей мере, 30 дней. В случае соматостатина, октреотида и ланреотида, может быть достигнуто пролонгированное выделение в течение, по меньшей мере, 8 дней.

Настоящее изобретение дополнительно относится к применению микроэмульсии настоящего изобретения, включающей леупролид, госерелин, триптолерин, ацетат нафарелина, гистрелин, цетрореликс или соответствующие ацетаты, для получения медикамента, предназначенного для подавления выработки тестостерона после однократного введения в течение, по меньшей мере, 30 дней, причем уровень содержания тестостерона понижается уже через 48 часов после применения.

Настоящее изобретение также относится к применению микроэмульсий, содержащих Octreotide или его аналоги, для получения лекарственного средства для подавления продукции гормона роста, по меньшей мере, в течение 8 дней.

Другая цель настоящего изобретения заключается в применении микроэмульсий, содержащих нефракционированный гепарин или гепарины низкой молекулярной массы для получения медикаментов пролонгированного действия после однократного введения.

Следующие ниже примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение.

Пример 1 - Получение микроэмульсии типа вода в масле (w/o), содержащей ацетат леупролида

a) Получение водной фазы

350 мг ацетата леупролида растворяли в 10 мл воды для инъекций, в которую было добавлено 200 мг лизина.

b) Получение масляной фазы

60 г этилолеата, 25 г лецитина сои (чистота >95%) и 5 г каприловой кислоты перемешивали отдельно в подходящем сосуде с мешалкой, термостатируемом при 60-70°С. Полученный в результате прозрачный гомогенный раствор охлаждали до комнатной температуры.

c) Приготовление микроэмульсии

Водную фазу (раствор а) при перемешивании добавляли в масляную фазу (раствор b) с получением оптически прозрачной, гомогенной микроэмульсии. Значение рН около 6 определяли по используемым количествам лизина и части каприловой кислоты, растворимой в водной фазе.

Указанную микроэмульсию стерильно фильтровали через подходящую 0,22 мкм мембрану.

Количество ацетата леупролида в указанной микроэмульсии определяли ВЭЖХ при следующих условиях:

Стационарная фаза:	5 мкм колонка Vydac C18 (250×4 мм)
Подвижная фаза А:	Н2O+0,1% TFA
В:	СН3ОН +0,1% TFA
Градиент:	20'100%А до 100%В
Скорость потока:	0,8 мл/мин
Детектор:	УФ при длине волны 214 нм

Содержание ацетата леупролида составило 3 мг/мл

Пример 2: - Получение микроэмульсии типа вода в масле (w/o), содержащей ацетат леупролида

Следовали методике Примера 1, но растворяли 600 мг ацетата леупролида в 10 мл воды.

Пример 3: - Получение микроэмульсии типа вода в масле (w/o), содержащей ацетат леупролида

Следовали методике Примера 1, но не добавляли 200 мг лизина. Рассчитанная величина рН составила величину порядка 3.

Пример 4 - Получение микроэмульсии типа вода в масле (w/o), содержащей ацетат леупролида

Следовали методике Примера 1, но растворяли 900 мг ацетата леупролида в 10 мл воды.

Пример 5 - Получение микроэмульсии типа вода в масле (w/o), содержащей ацетат леупролида

Следовали методике Примера 1, но изменяли количества поверхностно-активного вещества и вспомогательного поверхностно-активного вещества на 15 г соевого лецитина и 3 г каприловой кислоты соответственно. В результате, при неизменном соотношении между двумя указанными компонентами (5:1), общее количество смеси поверхностно-активное соединение/вспомогательное поверхностно-активное соединение уменьшалось с 30% до 18%.

Пример 6 - Получение микроэмульсии типа вода в масле (w/o), содержащей октреотид

Следовали методике, описанной в Примере 1, но растворяли 3 г октреотида в 10 мл воды, вместо 350 мг ацетата леупролида в 10 мл воды.

Пример 7 - Получение микроэмульсии типа вода в масле (w/o), содержащей гепарин

Следовали методике, описанной в Примере 1, но в 10 мл воды растворяли 50 мг нефракционированного гепарина в виде кальциевой или натриевой соли, вместо 350 мг ацетата леупролида.

Пример 8 - Получение микроэмульсии типа вода в масле (w/o), содержащей ацетат леупролида

Следовали методике, описанной в Примере 1, но изменяли качественно-количественный состав масляной фазы: этилолеат (66,9%), фосфатидилхолин (19,4%) и смесь капроновой и масляной кислот в соотношении 3:1 (всего 3,9%).

Пример 9 - Получение микроэмульсии типа вода в масле (w/o), содержащей ацетат леупролида

а) Приготовление водной фазы

60 мг ацетата леупролида растворяли в 0,6 мл воды для инъекций, в которую было добавлено 8 мг лизина

b) Приготовление масляной фазы

2,1 г этилолеата, 215 мг моноолеата полиоксиэтиленсорбита и 1 г лецитина сои смешивали в подходящем сосуде и нагревали до 50°С при перемешивании. Полученную в результате прозрачную гомогенную смесь охлаждали до комнатной температуры.

Водный раствор порциями медленно добавляли при перемешивании в маслянистую смесь с образованием оптически прозрачной микроэмульсии, содержащей 1,5% ацетата леупролида.

Пример 10 - Получение микроэмульсии типа вода в масле (w/o), содержащей ацетат леупролида

a) Получение водной фазы

60 мг ацетата леупролида растворяли в 0,2 мл воды для инъекций, в которую добавляли 4,1 мг лизина.

b) Приготовление масляной фазы

1,2 г этилолеата, 0,5 г моноолеата полиоксиэтиленсорбита и 0,1 г каприловой кислоты перемешивали в подходящем сосуде и нагревали при перемешивании до 50°С. Полученную в результате прозрачную гомогенную смесь охлаждали до комнатной температуры.

Порции водного раствора медленно добавляли при перемешивании к маслянистой смеси с получением оптически прозрачной микроэмульсии, содержащей 3 мг/мл ацетата леупролида.

Пример 11 - Получение микроэмульсии типа вода в масле (w/o), содержащей ацетат октреотида

a) Получение водной фазы

20 мг ацетата октреотида растворяли в 0,2 мл воды для инъекций, содержащей 0,2 г пропиленгликоля и 4 мг лизина.

b) Приготовление масляной фазы

0,98 г этилолеата, 0,5 г лецитина сои и 0,1 г каприловой кислоты смешивали в подходящем сосуде и нагревали при перемешивании до 50°С. Полученную в результате прозрачную гомогенную смесь охлаждали до комнатной температуры.

Порциями водный раствор медленно добавляли при перемешивании к масляной смеси. Полученная в результате оптически прозрачная микроэмульсия содержала 10 мг/мл ацетата октреотида.

Пример 12 - Получение микроэмульсии типа вода в масле (w/o), содержащей ацетат октреотида

a) Получение водной фазы

10 мг ацетата октреотида растворяли в 0,1 мл воды для инъекций, в которую добавляли 2 мг лизина.

b) Приготовление масляной фазы

0,59 г этилолеата, 0,25 г лецитина сои и 0,05 г каприловой кислоты смешивали в подходящем сосуде и нагревали при перемешивании до 50°С. Полученную в результате прозрачную гомогенную смесь охлаждали до комнатной температуры.

Порциями водный раствор, при перемешивании, медленно добавляли к масляной смеси. Полученная в результате оптически прозрачная микроэмульсия содержала 1% ацетата октреотида.

Пример 13 - Получение микроэмульсии типа вода в масле (w/o), содержащей ацетат октреотида

0,59 г этилолеата, 0,25 г лецитина сои и 0,05 г каприловой кислоты смешивали в подходящем сосуде и нагревали при перемешивании до 50°С. Полученную в результате прозрачную гомогенную смесь охлаждали до комнатной температуры. 0,1 г воды для инъекций, содержащей 2 мг лизина, при перемешивании, постепенно добавляли к масляному раствору. В полученную в результате оптически прозрачную микроэмульсию, при перемешивании, добавляли 10 мг ацетата октреотида. Активный ингредиент за несколько секунд вводили в указанную микроэмульсию. Полученную микроэмульсию фильтровали через 0,22 мкм полисульфоновый фильтр. Согласно ВЭЖХ полученная в результате оптически прозрачная микроэмульсия содержала ацетат октреотида в концентрации 6,35 мг/мл.

Пример 14 - Получение микроэмульсии типа вода в масле, содержащей миоглобин

a) Приготовление водной фазы

5,5 мг миоглобина растворяли в 1,5 мл воды для инъекций, в которую добавляли 10 мг лизина.

b) Получение масляной фазы

2 г этилолеата, 1,2 г лецитина сои и 0,25 г каприловой кислоты смешивали в подходящем сосуде и нагревали при перемешивании до 50°С. Полученную в результате прозрачную гомогенную смесь охлаждали до комнатной температуры.

Порциями водный раствор, при перемешивании, медленно добавляли к масляной смеси. Полученная в результате оптически прозрачная микроэмульсия содержала миоглобин в концентрации 1,3 мг/мл.

Пример 15 - Оценка in vivo эффективности действия микроэмульсии, содержащей ацетат леупролида, приготовленной по методикам, описанным в примерах 1 и 2.

Три группы самцов крыс Sprague Dawley (10 животных в каждой группе) перед обработкой содержали в клетках в течение 5 дней, обеспечивая водой и кормом ad libitum (no потребности).

Две микроэмульсионные рецептуры, полученные по методикам Примеров 1 и 2, с различными концентрациями ацетата леупролида, 3 мг/мл (Пример 1) и 6 мг/мл (Пример 2), вводили в виде однократной дозы в каждой группе испытуемых животных, что соответствовало дозировке активного ингредиента 0,750 мг/кг.

Контрольные животные (3 животных в каждой группе) получали физиологический раствор.

Уровни содержания тестостерона в плазме определяли после взятия образцов крови на 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21, 28, 42 и 56 день после введения. Образцы крови подвергали центрифугированию и количество сывороточного тестостерона измеряли с помощью набора EIA.

Уровни содержания тестостерона определяли вплоть до 60 дня после введения.

Полученные результаты приведены на Фигуре 1.

В следующей ниже таблице 1 суммированы данные, относящиеся к весу органов обработанных животных.

Таблица 1Влияние микроэмульсий, полученных по методикам примеров 1 и 2 на вес тела и репродуктивных органов крыс
Микроэмульсия	Вес тела и репродуктивных органов (г) через 28 и 56 дней
28 дней	56 дней
Тело	Яички	Простата	Семенные пузырьки	Тело	Яички	Простата	Семенные Пузырьки
Физиологический раствор	570,0±13,2	3,73±0,09	0,72±0,07	1,95±0,010	631,2±10,1	3,54±0,05	0,80±0,05	1,96±0,26
Пример 1	546,6±8,8	1,84±0,11*	0,33±0,03*	0,49±0,08*	600,0±16,4	2,39±0,17*	0,50±0,03#	1,39±0,14
Пример 2	532,8±4,6	1,68±0,14*	0,22±0,03*	0,25±0,03*	626,6±25,5	2,5±0,21Δ	0,51±0,08#	1,43±0,22
Приведенные значения представляют собой среднее значение±стандартная ошибка (для группы из 5 животных) *р<0,001; Δр<0,01; # р<0,05 относительно физиологического раствора (тесты ANOVA и Bonferroni для множественных сравнений)

Составы настоящего изобретения, независимо от концентрации активного вещества в микроэмульсии, не проявляют существенных системных или локальных побочных эффектов и обеспечивают устойчивое пролонгированное высвобождение активного ингредиента в течение, по меньшей мере, 30 дней и терапевтическое действие уже через 48 часов после инъекции.

Полученная эффективность сравнима с соответствующим значением, которого можно достичь при использовании коммерческой депо-рецептуры "Enantone" на основе биодеградируемого полимера.

Пример 16 - Оценка подкожной переносимости микроэмульсий

Этот тест по оценке подкожной переносимости осуществляли однократной инъекцией группе из, по меньшей мере, 9 крыс микроэмульсий, указанных в следующей ниже Таблице 2.

Клинические, аутопсические и гистологические исследования проводили через 48 часов, 7 дней и 14 дней после применения.

Таблица 2
Соединение	Количество (мг)	Наличие припухлости (средняя оценка*)	Наличие изъязвлений
48 ч	7 дней	14 дней	48 ч	7 дней	14 дней
Микроэмульсия A(1)	125 мкл	2	2	1	Нет	Нет	Нет
Микроэмульсия А(1)	500 мкл	3	3	2,5	Нет	Нет	Нет
Микроэмульсия В(2)	125 мкл	3	3	3	Да	Да	Да
(1) Микроэмульсии полученные по методике Примера 1.(2) Микроэмульсии полученные по методике Примера 8.* описание оценок: 1 легкий эффект; 2 умеренный эффект; 3 тяжелый эффект

Результаты проведенного теста указывают на биологическую совместимость рецептур, которые не индуцируют стойких локальных изъязвлений, тогда как согласно данным Howard с сотр., Int. J. Pharm. 16 (1083) 31-39 наличие припухлостей является функцией количества инъецированного продукта и степени удаления этилолеата из подкожных тканей.

Пример 17 - In vivo оценка эффективности действия микроэмульсий, содержащих ацетата Окреотида (Octreotide ацетат)

Дозу, соответствующую 6 мг/крысу микроэмульсии, содержащей октреотид, полученной по методике примера 11, вводили 6 самцам крыс весом около 175-200 г. Образцы плазмы отбирали до применения соединения и через 0,5 часа, 24 часа, 4, 6 и 8 дней после введения. Октреотид экстрагировали из плазмы и анализировали по калибровочной кривой полученной на приборе LC-MS-MS. В следующей ниже таблице 3 представлены уровни содержания указанного вещества в плазме:

Таблица 3
Время отбора образца	0,5 ч	24 ч	4 дня	6 дней	8 дней
Octreotide (нг/мл)	539	40,2	62,5	4,5	7,6

Значительные уровни содержания октреотида обнаруживаются в плазме до 8 дней после применения.

Пример 18 - Оценка соотношения доза/эффективность действия микроэмульсии, содержащей ацетат леупролида

Рецептуры, содержащие ацетат леупролида, полученные по методике примера 2, применяли на крысах в виде однократных доз в 2,25 мг/кг (Пример). Контрольные животные получали соответствующую дозу физиологического раствора (Контроль).

Уровни содержания тестостерона в образцах крови определяли на 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 28, 42 и 56 день. Образцы крови центрифугировали и количество сывороточного тестостерона измеряли с помощью набора Elisa.

Полученные результаты представлены на Фигуре 2.

В следующей ниже Таблице 4 суммированы данные, касающиеся веса органов обработанных животных.

Таблица 4Влияние микроэмульсии на основе ацетата леупролида или физиологического раствора на вес тела и репродуктивных органов крыс (Пример и Контроль)
Вес тела и репродуктивных органов (г) на 56 день
	Тело	Яички	Простата	Семенные пузырьки
Контроль	645±34	3,73±0,16	0,82±0,04	1,96±0,09
Пример	608±35	1,94±0,42(p<0,01)	0,35±0,14(р<0,5)	0,55±0,16(p<0,05)

Через 56 дней после введения микроэмульсии зафиксировано явное снижение как содержания тестостерона в плазме крови, так и уменьшение веса репродуктивных органов.

Две группы животных (крыс) обработали путем однократного подкожного введения 600 мкл композиций LHRH (леупролида), каждая из которых содержала 4.5 мг олигопептида, что эквивалентно 22.5 мг/кг. Состав двух композиций приведен в Таблицах 5 и 6.

Отбирали образцы крови у 5 животных одновременно через различные промежутки времени в течение 112 дней после обработки. Уровни леупролида в плазме определяли с помощью метода LC/MS-MS. Средние значения уровня в плазме и стандартные отклонения для каждого момента времени показаны на Фиг.3.

Присутствие Леупролида обнаруживалось до последнего образца (т.е. в течение 112 дней) после s.c. инъекции обеих композиций.

Таблица 5
Композиция А	мас.%/мас.
Ацетат леупролида	0.82
изопропилмиристат	59.18
Соевый лецитин	25.00
Каприловая кислота	5.00
Вода	10.00
Всего	100.00
Таблица 6
Композиция В	мас.%/мас.
Ацетат леупролида	0.82
изопропилмиристат	57.18
Соевый лецитин	25.00
1-гексанол	7.00
Вода	10.00
Всего	100.00

Ингибирование тестостерона после s.c. инъекции композиции А

В параллельном эксперименте композицию А (100 мкл, 1.125 мг леупролида) инъецировали под кожу крысам (образцы отбирали одновременно у пяти животных) и измеряли уровень тестостерона в крови с использованием коммерчески доступного набора.

Результаты представлены на Фиг.4, на которой показано значительное ингибирование тестостерона во все моменты времени по сравнению с контрольными животными, которым вводили только раствор соли. Более того, ингибирование тестостерона было практически полным даже спустя 112 дней после инъекции, что согласуется с результатами кинетического эксперимента, представленными на Фиг.3.

1. Устойчивая, биологически совместимая, хорошо переносимая микроэмульсия типа вода в масле (w/o), предназначенная для парентерального введения биологически активных соединений, являющихся гидрофильными или становящимися таковыми в результате соответствующей дериватизации, обеспечивающая устойчивое пролонгированное выделение содержащихся в ней активных соединений, причем указанная микроэмульсия содержит

a) до 20% внутренней гидрофильной водной фазы, содержащей терапевтически активное гидрофильное соединение;

b) 30-98% гидрофобной внешней фазы, выбранной из сложных эфиров C₈-C₂₀ насыщенных или ненасыщенных карбоновых кислот с С₂-С₈ спиртовыми остатками, или моно, ди- и триглицеридов C₈-C₂₀ жирных кислот;

c) до 50% поверхностно-активного компонента в смеси со вспомогательным поверхностно-активным веществом, причем указанное поверхностно-активное вещество выбрано из природных или синтетических глицерофосфолипидов, содержащих остатки С₄-С₂₀ насыщенных или ненасыщенных карбоновых кислот, ф