Новые регулирующие экспрессию последовательности и продукт экспрессии в области гифомицетов

Новые регулирующие экспрессию последовательности и продукт экспрессии в области гифомицетов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к новым ферментам, продуцируемым гифомицетами, особенно штаммами рода Chrysosporium, и кодирующим последовательностям и последовательностям, регулирующим экспрессию указанных ферментов. Настоящее изобретение является продолжением изобретения, описанного в международной патентной заявке WO 00/20555 (PCT/NL99/00618), зарегистрированной 6 октября 1999 года, не опубликованной до даты приоритета настоящей заявки. Описание последней включено в данный текст в качестве ссылки.

Предпосылки к созданию изобретения

Ряд хозяев, предназначенных для генной экспрессии, и способы трансформации описаны в некоторых публикациях предыдущего уровня техники. Часто упоминаются бактерии, например Escherichia coli. Однако Е.coli является микроорганизмом, не способным секретировать ряд белков или полипептидов, и поэтому нежелательным в качестве клетки-хозяина для продуцирования белка или полипептида в промышленном масштабе. Еще одним недостатком Е.coli, который относится к бактериям в целом, является то, что прокариоты не осуществляют дополнительные модификации, требуемые для многочисленных белков или полипептидов эукариот, чтобы продуцироваться в активной форме. Гликозилирование белков и соответствующий "фолдинг" белков являются примерами процессинга, который необходим для продуцирования белка или полипептида в активной форме. Для того, чтобы достичь такого процессинга, иногда используют клетки млекопитающих; однако недостаток таких клеток заключается в том, что их зачастую трудно поддерживать и для роста требуется дорогостоящая среда. Поэтому такие трансформационные системы являются нецелесообразными для продуцирования белков или полипептидов на промышленном уровне. Они могут быть экономически эффективными для дорогостоящих фармацевтических соединений, требующихся в относительно небольших количествах, но, конечно, не для промышленных ферментов.

Был разработан ряд грибных экспрессирующих систем, в том числе грибов Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei. Ряд других был предложен, но по разным причинам они не нашли широкого признания или применения. В общем, идеальный хозяин должен удовлетворять широкому ряду критериев:

- Идеальный хозяин должен легко подвергаться ферментации с использованием недорогой среды.

- Идеальный хозяин должен использовать среду эффективно.

- Идеальный хозяин должен продуцировать полипептид или белок с высоким выходом, т.е. применение идеального хозяина должно привести к высокому отношению белка к биомассе.

- Идеальный хозяин должен быть способен эффективно секретировать белок или полипептид.

- Идеальный хозяин должен быть таким, чтобы имелась возможность легко выделить и очистить желаемый белок или полипептид.

- Идеальный хозяин должен продуцировать желаемый белок или полипептид, который продуцируется в активной форме, не требуя дополнительных стадий активации или модификации.

- Идеальный хозяин должен быть легко трансформирован.

- Идеальный хозяин должен предоставить широкий спектр регулирующих экспрессию элементов, которые следует использовать, чтобы обеспечить легкость применения и универсальность.

- Идеальный хозяин должен предоставить возможность использования легко выбираемых маркеров, которые являются недорогими для употребления.

- Идеальный хозяин должен продуцировать стабильные трансформанты.

- Идеальный хозяин должен позволить культивирование при условиях, не причиняющих вред белковому или полипептидному продукту, например низкая вязкость, небольшой сдвиг.

Международная патентная заявка WO 96/02563 и патенты США 5602004, 5604129 и 5695985 No.vo No.rdisk описывают отрицательные стороны систем Aspergillus и Trichoderma и предполагают, что условия культивирования других грибов могут быть более подходящими для продуцирования белка в большом масштабе. Единственными примерами, предусматривающими трансформированные в той или иной степени культуры, являются штаммы Myceliophthore thermophila, Acremonium alabamense, Thielavia terrestris и Sporotrichum cellulophilum. Показано, что штамм Sporotrichum лизирует и продуцирует зеленый пигмент в таких условиях ферментации, которые не приводят к аналогичным результатам в отношении других штаммов. Как сообщают, что неспорулирующий штамм Thielavia terrestris является микроорганизмом, отобранным на основании его морфологических свойств. Однако показано, что эффективность протопласта Thielavia и Acremonium (где используемый штамм Acremonium представляет собой неполное состояние используемого штамма Thielavia), является низкой и что гигромицин не пригоден в качестве селекционного маркера. Был предложен широкий ряд других штаммов, которые являются потенциально пригодными по морфологическим характеристикам, но трансформация для них не описана. Предложенными штаммами являются Corynascus, Thermoascus, Chaetomium, CteNo.myces, Scytalidium и Talaromyces. Трансформированные клетки-хозяева рассматривают как клетки, единственно продуцирующие низкие уровни внесенной ксиланазы Humicola, причем штамм Thielavia продуцирует наименьшее количество; однако эта информация является неоднозначной, и фактически можно сделать предположение, что штамм Thielavia является наилучшим воплощением. Номенклатура данной ссылки основана на названиях АТСС промышленных грибов 1994 года. Таким образом очевидно, что высокая степень гетерологичной экспрессии не была достинута и, действительно, положительная корреляция между предположенной морфологией и степенью экспрессии не могла быть получена. Если какую-либо корреляцию и можно установить, то она, самое вероятное, будет отрицательной. Согласно классификации грибов АТСС 1996 года Sporotrichum thermophilum АТСС 20493 является штаммом Myceliophthora thermophila. До настоящего времени штамм все еще идентифицируют как Myceliophthora thermophila. Невозможность прогнозирования в данной области вытекает из указанных недавних описаний.

Международная патентная заявка WO 97/26330 No.vo No.rdisk предлагает способ получения родительских клеток гифомицетов, обладающих повышенной способностью продуцировать гетерологичный полипептид. Способ включает в себя сначала обнаружение специфически измененной морфологии с последующей оценкой того, продуцирует ли трансформант более гетерологичный полипептид, чем родительские клетки. Способ иллюстрируют только в отношении штаммов Fusarium A3/5 и Aspergillus oryzae. Полагают, что способ применим к Aspergillus, Trichoderma, Thielavia, Fusarium, Neurospora, Acremonium, Tolyplocadium, Humicola, Scytalidium, Myceliophthora или Mucor. Как указано выше, невозможность прогнозирования в данной области, а также невозможность прогнозирования способа цитированной заявки не дает возможности разработать общую методологию, применение которой обеспечит ожидаемый успех.

В международной патентной заявке WO 00/20555 описана альтернативная грибная экспрессирующая система, отличающаяся простотой использования вышеупомянутых штаммов Aspergilli и Trichoderma, отвечающих указанным выше требованиям. Новая система предоставляет дополнительные преимущества, заключающиеся в том, что скорости трансформации указанной системы выше скоростей трансформации часто используемой системы Trichoderma reesei. Кроме того, культуральные условия предоставляют дополнительные преимущества для продуцирования полипептидного продукта.

Подробное описание изобретения

Итак, авторы описывают ряд интересных с точки зрения промышленного производства ферментов, продуцируемых штаммами Chrysosporium, а также приводят полную информацию о последовательностях. Также авторы описывают промоторные системы, производимые штаммами Chrysosporium и используемые для экспрессии гомологичных и гетерологичных генов.

В частности, настоящее изобретение касается гликозилгидролаз семейств 7 (например, целлобиогидролаз) и 10 (например, ксиланаз) и глицеральдегидфосфатдегидрогеназ, идентифицируемых по их аминокислотной последовательности, а также пептидов, производных указанных ферментативных белков, и последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих указанные пептиды и белки, а также, в частности, регулирующих последовательностей, родственных данным генам.

В частности, изобретение относится к изолированным или рекомбинантным ферментативным белкам или их активным частям из трех указанных выше классов, включая их мутанты, имеющих, по крайней мере, определенную степень идентичности последовательности, как указано в дальнейшем описании и в формуле изобретения, а также к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим вышеупомянутые белки или их части, и/или к последовательностям нуклеиновых кислот, регулирующим их экспрессию. Указанными ферментами, особенно, являются: (1) гликозилгидролаза из семейства 7 (целлобиогидролаза, СВН1), содержащая аминокислотную последовательность, идентичную, по крайней мере, на 75%, предпочтительно, по крайней мере, на 80% или даже, по крайней мере, на 85% последовательности аминокислот SEQ ID No. 2; (2) гликозилгидролаза из семейства 10 (эндоксиланаза XYL1), содержащая аминокислотную последовательность, идентичную, по крайней мере, на 70%, предпочтительно, по крайней мере, на 75% или даже, по крайней мере, на 80% последовательности аминокислот SEQ ID No.4; и (3) глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (GPD1), содержащая аминокислотную последовательность, идентичную, по крайней мере, на 86%, предпочтительно, по крайней мере, на 90% или даже, по крайней мере, на 93% последовательности аминокислот SEQ ID No.6. Полипептиды и последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие данные полипептиды, содержащие, по крайней мере, 20, предпочтительно, по крайней мере, 30 смежных аминокислот SEQ ID No.2, 4 и 6, являются предпочтительной частью изобретения. Соответствующие нуклеотидные последовательности отражены в SEQ ID No.1 (cbh 1), 3 (xyl 1) и 5 (gpd 1) соответственно.

Рекомбинантные ферменты могут представлять собой, по существу, полный белок или усеченный белок, обладающий, по крайней мере, частью ферментативной активности. Такая усеченная часть может быть каталитическим доменом или составлять, по крайней мере, приблизительно 75% его аминокислот. В качестве примера каталитический домен СВН1 согласно изобретению содержит аминокислоты 20-495 аминокислотной последовательности SEQ ID No.2, и каталитический домен XYL1 согласно изобретению содержит аминокислоты 54-384 аминокислотной последовательности SEQ ID No.4. Каталитический домен может быть связан или не связан с сигнальной последовательностью, происходящей из другого белка, и/или с углевод-связывающим доменом из другого ферментативного белка. В качестве альтернативы целлюлозо-связывающий домен ферментов согласно изобретению (СВР1 и XYL1) может быть конденсированным с каталитическими доменами других ферментативных белков.

Последовательности нуклеиновых кислот согласно изобретению могут быть полными белок-кодирующими областями или олигонуклеотидами или предпочтительно последовательностями, регулирующими экспрессию. Олигонуклеотиды могут быть использованы также в качестве зондов для идентификации генов, соответствующих, но неидентичных генам SEQ ID No.1, 3 и 5; данные гены, которые удовлетворяют определенному в описании критерию идентичности, выраженной в процентах, а также кодирующие и некодирующие их части и их продукты экспрессии составляют часть изобретения. Олигонуклеотиды представляют собой предпочтительно 15-75 нуклеотидов, самое предпочтительное 20-50 нуклеотидов в длину.

Изобретение также относится к экспрессирующим системам (кассетам), содержащим либо регулирующую экспрессию область (включая промотор) любого из трех классов белков, конденсированную с геном, кодирующим другой интересующий белок, либо кодирующую область любого из данных белков, конденсированную с другой областью, регулирующей экспрессию, или также содержащим как область, регулирующую экспрессию, так и белок-кодирующую область указанных новых белков. Регулирующая экспрессию область содержит, по крайней мере, 60%, предпочтительно, по крайней мере, 70%, более предпочтительно, по крайней мере, 75% или даже 80% 5'-некодирующей области SEQ ID No.1, 3 и 5, и/или, по крайней мере, 20, особенно, по крайней мере, 40 смежных нуклеотидов из указанных 5'-некодирующих областей. Терминирующие последовательности, аналогичным образом произведенные из 3'-некодирующих последовательностей генов согласно изобретению, также применяют в экспрессирующих кассетах, причем терминирующие последовательности комбинируют либо с гомологичными, либо с гетерологичными генами.

Полинуклеотиды и олигонуклеотиды согласно изобретению могут иметь минимум идентичности последовательностей с соответствующими последовательностями SEQ ID No.1, 3 или 5, или, в качестве альтернативы, гибридизироваться в жестких условиях с указанными данными последовательностями. Жесткие условия гибридизации являются такими, которые указаны в данной области, например гибридизация в 6×SSC (20×SSC на 1000 мл; 175,3 г NaCl, 107,1 г цитрата натрия. 5Н₂O, рН 7,0), 0,1% SDS, 0,05% пирофосфата натрия, 5* раствор Denhardt и 20 мкг/мл денатурированной ДНК семени сельди при 56°С в течение 18-24 часов с последующими двумя 30-минутными промывками в 5×SSC, 0,1% SDS при 56°С и с двумя 30-минутными промывками в 2×SSC, 0,1% SSC при 56°С.

Указанные экспрессирующие системы могут находиться в хозяине Chrysosporium, таком как Chrysosporium luckNo.wense, или в другом хозяине, отличном от грибов, или предпочтительно в грибах. Примерами других грибов-хозяев являются другие виды Chrysosporium или штаммы, виды Fusarium, Aspergillus и т.д. Такой хозяин может быть преимущественно хозяином, который не сам по себе, по сути или в результате условий культивирования, продуцирует белок, соответствующий интересующему белку с тем, чтобы упростить получение интересующего белка.

Когда в описании и прилагаемой формуле изобретения ссылаются на «полипептиды», или «пептиды», или «полипептиды, представляющие интерес», или «пептиды, представляющие интерес» как на продукты экспрессирующей системы согласно изобретению, то указанный термин также включает в себя белки, т.е. полипептиды, имеющие особую функцию, и/или вторичную, и/или третичную структуру. Когда ссылаются на процент идентичности аминокислот, то такая идентичность относится к полному белку или к его специфической части, характеризованной начальным и конечным числом аминокислот, как определено с помощью обычно применяемого BLAST алгоритма.

В экспрессирующей системе грибов, описанной в международной патентной заявке WO 00/20555, рН культуральной среды может быть нейтральным или щелочным, чтобы больше не подвергать продуцируемый белок или полипептид агрессивному и потенциально инактивирующему действию кислого рН. Также возможно культивировать при кислом рН, таком как рН 4, в случаях, когда белок или полипептид лучше подходит к кислой среде. Подходящим рН культур может быть рН между 4,0-10,0. Однако предпочтение отдают рН в области между нейтральным рН и щелочным рН, поскольку хозяйский штамм лучше растет при таком рН, например между 6 и 9. Рост при щелочном рН, который может составлять от рН 8 и выше и даже может быть таким высоким, как рН 10, рассматривают как хорошую альтернативу для таких случаев. Кроме того, температура культивирования таких хозяйских штаммов должна быть благоприятной для сохранения стабильности некоторых типов продуцируемого полипептида. Подходящей температурой культивирования является температура 23-43°С. Ясно, что такие условия представляют особый интерес для продуцирования полипептидов млекопитающих. Выбранная температура будет зависеть от эффективности затрат культивирования и от чувствительности полипептида или культивируемого штамма.

Кроме того, было установлено, что отношение биомассы к вязкости и количество продуцированного белка являются чрезвычайно благоприятными для хозяина Chrysosporium. Сравнительные исследования проводили с Trichoderma longibrachiatum (прежде штамм, известный как Trichoderma reesei) и с Aspergillus niger. Штамм Trichoderma longibrachiatum давал 2,5-5 г/л биомассы, штамм Aspergillus niger давал 5-10 г/л биомассы и штамм Chrysosporium давал 0,5-1 г/л биомассы в их соответствующих оптимальных условиях культивирования. Такая продукция превышала в 5-10 раз продукцию коммерчески используемых штаммов. Цель изобретения направлена на экспрессирующие системы, содержащие последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую гетерологичный белок или полипептид, причем указанная последовательность нуклеиновых кислот связана с регулирующей экспрессию областью, описанной ниже, и необязательно с последовательностью, кодирующей сигнальную последовательность, способствующую секреции, и/или последовательностью, кодирующей белок-носитель. Предпочтительно рекомбинантный штамм согласно изобретению будет секретировать представляющий интерес полипептид. Такой подход позволяет избежать необходимости дезинтеграции клетки с целью выделения интересующего полипептида и снизить до минимума риск деградации экспрессированного продукта другими компонентами хозяйской клетки.

Штамм Chrysosporium может быть определен морфологически в соответствии с описанием, данным в Barnett and Hunter 1972, Illustrated Genera of Imperfect Fungi, 3^rd Edition of Burgess Publishing Company. Другие источники, описывающие детали касательно классификации грибов рода Chrysosporium, хорошо известны, например, Sutton Classification (Van Oorschot, C.A.N. (1980) "A revision of Chrysosporium and allied genera" in Studies in Mycology No.20 of the CBS in Baarn, The Netherlands p.1-36). CBS является одним из депозитарных институтов Будапештского соглашения. Согласно исследованиям род Chrysosporium приходится на семейство Moniliaceae, которое принадлежит к отряду Hyphomycetales. Следующие штаммы определяют как Chrysosporium, но название Chrysosporium не ограничивается указанными штаммами: С.botryoides, С.carmichaelii, C.crassitunicatum, C.europae, C.evolceannui, C.farinicola, C.fastidium, C.filiforme, C.georgiae, C.globiferum, C.globiferum вариант articulatum, C.globiferum вариант niveum, C.hirundo, C.hispanicum, C.holmii, C.indicum, C.iNo.ps, C.keratiNo.philum, C.kreiselii, C.kuzurovianum, C.ligNo.rum, C.lobatum, C.luckNo.wense, C.luckNo.wense Gard 27 К, C.medium, C.medium вариант spissescens, C.mephiticum, C.merdarium, C.merdarium вариант roseum, C.miNo.r, C.pannicola, C.parvum, C.parvum вариант crescens, C.pilosum, C.pseudomerdarium, C.pyriformis, C.queenslandicum, C.sigleri, C.sulfureum, C.synchronum, C.tropicum, C.undulatum, C.vallenarense, C.vespertilium, C.zonatum.

C.luckNo.wense составляет один из видов Chrysosporium, который вызывает особый интерес в связи с тем, что он имеет готовый природный высокий продуцент целлюлазных белков (WO 98/15633) и родственный патент США 5811381). Характеристиками Chrysosporium luckNo.wense являются:

Колонии достигают 55 мм в диаметре на глюкозном агаре Sabourand в течение 14 дней, имеют оттенок кремового цвета, на вид войлокообразные и пушистые; плотные и 3-5 мм высотой; края являются четкими, правильными и бахромчатыми; изменяют цвет от бледно-желтого до кремового. Гифы гиалиновые, гладкостенные и тонкостенные, мало разветвленные. Гифы над поверхностью являются, главным образом, плодовитыми и разделенными перегородками, приблизительно 1-3,5 мкм в ширину. Погруженные гифы являются неплодородными, приблизительно 1-4,5 мкм в ширину, с утонченными гифами, которые часто скручены. Конидии являются терминальными и боковыми, главным образом, прикрепленными или на коротких, часто конических выступах или коротких побочных ответвлениях. Конидии являются одиночными, но близко расположены друг от друга, 1-4 конидии, развивающиеся на одной клетке, относящейся к гифам, субгиалиновые, в некоторой степени тонкостенные и гладкостенные, главным образом, субсферические, также булавовидные или яйцевидные с уменьшением к основанию, 1-ячеистые, 2,5-11×1,5-6 мкм, с широкими базальными рубцами (1-2 мкм). Интеркалярные конидии отсутствуют. Хламидоспоры отсутствуют. АТСС 44006, CBS 251.72, CBS 143.77 и CBS 272.77 являются примерами Chrysosporium luckNo.wense штаммов, и другие примеры описаны в международной патентной заявке WO 98/15633 (патент США 5811381).

Кроме того, был выделен штамм из данного вида с большей способностью к продуцированию целлюлаз. Данный штамм был назван С1 посредством записи, вытекающей из его сущности, и был депонирован в Международном Депозитарии Всероссийской Коллекции микроорганизмов Российской Академии Наук, улица Бахрушина 8, Москва, Россия 113184 29 августа 1996, в качестве депозита согласно Будапештскому соглашению и ему был дан входящий номер VKM F-3500D. Он был назван Chrysosporium luckNo.wense Gard 27K. Характеристики С1 штамма следующие:

Колонии вырастали размером приблизительно до 55-66 мм диаметром на картофельно-декстрозном агаре в течение 7 дней; были бело-кремового цвета, на вид войлочнообразные, 2-3 мкм высотой у центра; края определенные, регулярные, бахромчатые; изменяли цвет до бледно-кремового. Гифы гиалиновые, гладкостенные и тонкостенные, мало разветвленные. Гифы над поверхностью являются плодовитыми, разделенными перегородками, 2-3 мкм в ширину. Погруженные гифы являются неплодородными. Конидии являются терминальными и боковыми; прикрепленные или на коротких побочных ответвлениях отсутствуют; являются отдельными, но близко расположены друг от друга, гиалиновые, тонкостенные и гладкостенные, субсферические, также булавовидные или яйцевидные с уменьшением к основанию, 1-ячеистые, 4-10 мкм. Хламидоспоры отсутствуют. Интеркалярные конидии отсутствуют.

Способ выделения штамма С1 описан в международной патентной заявке WO 98/15633, патентах США 5811381 и 6015707. Также под определение Chrysosporium включены штаммы, выведенные из предшественников Chrysosporium, включающих такие, которые мутированы в некоторой степени либо в естественных условиях, либо путем индуцированного мутагенеза. Мутанты Chrysosporium могут быть получены путем индуцированного мутагенеза, особенно путем комбинации облучения и химического мутагенеза.

Например, штамм С1 был мутирован путем обработки ультрафиолетовым светом с получением штамма UV13-6. Данный штамм был впоследствии мутирован с помощью N-метил-N^'-нитро-N-нитрозогуанидина с получением штамма NG7C-19. Последний штамм, в свою очередь, был подвергнут мутации посредством обработки ультрафиолетовым светом, что привело к штамму UV 18-25. В течение указанного процесса мутации морфологические характеристики изменялись до некоторой степени в культуре в жидкости или на чашках, а также под микроскопом. С каждым последующим мутагенезом культуры становятся на вид менее пушистыми и войлочнообразными на чашках, что, как описано, является характерным для Chrysosporium, до тех пор, пока колонии не становятся плоскими и не приобретают тусклый внешний вид. Коричневый пигмент, наблюдаемый со штаммом дикого типа в некоторых средах, был менее распространенным в мутантных штаммах. В жидкой культуре мутант UV 18-25 был заметно менее вязким, чем штамм С1 дикого типа и мутанты UV 13-6 и NG7C-19. В то время как все штаммы сохраняли общие характеристики Chrysosporium, обнаруженные под микроскопом, мицелий становился уже с каждой последующей мутацией, и в отношении штамма UV 18-25 можно было наблюдать явное разделение мицелия. Вероятно, что указанное разделение мицелия является причиной снижения вязкости, связанной с культурами UV 18-25. Способность штаммов к споруляции уменьшается с каждой мутагенной стадией. Исходя из вышеописанного, следует, что в отношении штамма, который принадлежит к роду Chrysosporium, имеется некоторое отклонение от морфологического определения, данного выше. На каждой стадии мутации продукция целлюлазы и внеклеточного белка также увеличивается, в то время как несколько мутаций приводят к уменьшению экспрессии протеазы. Критерии, с помощью которых таксономия грибов может быть определена, доступны, например, из CBS, VKMF и ATCC. Штаммы, обозначенные как Chrysosporium штамм С1, штамм UV 13-6, штамм NG7C-19 и штамм UV 18-25, депонированы в соответствии с Будапештским соглашением во Всероссийской коллекции (VKM) депозитарного института в Москве. Штамм дикого типа С1 был депонирован под номером VKM F-3500 D, дата депозита 29-08-1996, C1 UV 13-6 мутант был депонирован как VKM F-3632 D (02-09-1998), C1 NG7c-19 мутант был депонирован как VKM F-3633 D (02-09-1998) и C1 UV 18-25 мутант был депонирован как VKM F-3631 D (02-09-1998).

Предпочтительным является использование нетоксичных штаммов Chrysosporium, из которых некоторое количество известно в данной области, как штаммы, осуществляющие продуцирование в большом масштабе с наименьшим риском по отношению к окружающей среде и способствующие упрощению способов продуцирования с сопутствующим снижением себестоимости.

Областью, регулирующей экспрессию, является последовательность ДНК, узнаваемая хозяйским штаммом Chrysosporium, предназначенным для экспрессии. Она содержит промоторную последовательность, связанную с последовательностью нуклеиновых кислот, которая кодирует экспрессируемый полипептид. Промотор связан таким образом, что расположение по отношению к кодону инициации последовательности, которая должна экспрессировать, способствует экспрессии. Промоторная последовательность может быть конститутивной или индуцибельной. Любая последовательность или ее комбинация, регулирующая экспрессию, способная осуществить экспрессию полипептида из штамма Chrysosporium, предусмотрена. Регулирующая экспрессию последовательность является подходящей регулирующей экспрессию областью из грибов, например регулирующей областью аскомицетов. Подходящей регулирующей экспрессию областью грибов является регулирующая область из любого из следующих родов грибов: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Hansenula, Mucor, Pichia, Neurospora, Tolypocladium, Rhizomucor, Fusarium, Penicillium, Saccaromyces, Talaromyces или их альтернативные половые формы, подобно Emericella, Hypocrea, например, промотор целлобиогидролазы из Trichoderma, промотор глюкламилазы из Aspergillus, промотор глицеральдегидфосфатдегидрогеназы из Aspergillus, промотор алкогольдегидрогеназы А и алкогольдегидрогеназы R из Aspergillus, промотор ТАКА амилазы из Aspergillus, промотор фосфоглицерата и промоторы, контролирующие переключение путей экспрессии, из Neurospora, промотор аспартильной протеиназы из Rhizomucor miehei, промотор липазы из Rhizomucor miehei и промотор бета-галактозидазы из Penicillium canescens. Последовательность, регулирующая экспрессию, находящаяся в штамме такого же рода, что и хозяйский штамм, является чрезвычайно подходящей, так как она, вероятно, специфическим образом адаптирована к специфическому хозяину. Таким образом, предпочтительной последовательностью, регулирующей экспрессию, является последовательность из штамма Chrysosporium.

Предпочтительно, когда применяют регулирующую экспрессию область, осуществляющую высокую экспрессию в выбранном хозяине. Предпочтительно, когда регулирующая экспрессию область произведена из Chrysosporium согласно изобретению. Кроме того, регулирующая высокую экспрессию область может быть произведена из гетерологичного хозяина, который хорошо известен в данной области. Специфические примеры белков, которые, как известно, экспрессируются в больших количествах, и, таким образом, предоставление подходящих последовательностей, регулирующих экспрессию, не ограничивается гидрофобином, протеазой, амилазой, ксиланазой, пектиназой, эстеразой, бета-галактозидазой, целлюлазой (например, эндоглюканазой, целлобиогидролазой) и полигалактуроназой. Высокая продукция была отмечена как в твердом состоянии, так и в условиях погружения при ферментации. Способы оценки наличия или продуцирования таких белков хорошо известны в данной области. Каталоги Sigma и Megazyme, например, предоставляют многочисленные примеры. Фирма Megazyme расположена Bray Business Park, Bray, County Wicklow в Ирландии. Фирма Sigma Aldrich имеет много филиалов по всему миру, например USA P.O. Box 14508 St. Louis Missouri. Что касается целлюлазы, авторы ссылаются на коммерчески доступные способы анализа, такие как анализы CMCase, эндовискозиметрический способ анализа, способы анализа авицелазы, способ анализа бета-глюканазы, способ анализа RBBCMCase, способ анализа целлазима C. Также способ анализа ксиланазы является коммерчески доступным (например, DNS Megazyme). Альтернативные способы анализа хорошо известны специалисту в данной области и могут быть найдены в обычной литературе, касающейся предмета обсуждения, и такая информация включена в данный текст в виде ссылки. В качестве примера авторы ссылаются на "Methods in Enzymology" Volume 1, 1955 и volumes 297-299, 1998. Подходящим является то, что промоторная последовательность Chrysosporium применяется с целью обеспечения хорошего узнавания последовательности хозяином.

Авторы обнаружили, что гетерологичные последовательности, регулирующие экспрессию, функционируют в Chrysosporium также эффективно, как и нативные последовательности Chrysosporium. Полученные результаты позволяют использовать хорошо известные конструкции и векторы в трансформации Chrysosporium, а также предоставляют другие многочисленные возможности для конструирования векторов, достигающих экспрессии с хорошей скоростью в данном новом экспрессирующем и секретирующем хозяине. Например, можно использовать стандартный способ трансформации Aspergillus, описанный, например, Christiansen et al. in Bio/TechNo.1., 6:1419-1422 (1988). Другие публикации, описывающие детально трансформационные векторы Aspergillus, включают в себя, например, патенты США 4816405, 5198345, 5503991, 5364770 и 5578463, европейский патент ЕР-В-215594 (также для Trichoderma), и их содержание включено в данный текст в виде ссылки. Поскольку для штаммов Chrysosporium показаны чрезвычайно высокие скорости экспрессии, то области, регулирующие экспрессию таких белков, являются особенно предпочтительными. Авторы ссылаются на специфические примеры ранее описанных депозитных штаммов Chrysosporium.

Нуклеиновокислотный конструкт, который содержит область нуклеиновых кислот, регулирующую экспрессию, из Chrysosporium, предпочтительно из Chrysosporium LuckNo.wense или из производного штамма, является предпочтительным аспектом изобретения, как и мутантный штамм Chrysosporium, содержащий такую конструкцию, связанную с геном, кодирующим экспрессируемый полипептид. Такая конструкция нуклеиновых кислот будет представлять собой область из Chrysosporium, регулирующую экспрессию, ассоциированную с экспрессией целлюлазы или ксиланазы, предпочтительно с экспрессией целлобиогидролазы или с экспрессией глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, как будет описано ниже. Последовательность нуклеиновых кислот согласно изобретению может быть получена подходящим образом из такого штамма Chrysosporium, который был ранее определен в описании. Способы, с помощью которых промоторные последовательности могут быть определены, являются многочисленными и хорошо известными в данной области. Эксперименты, связанные с делецией нуклеазой области в обратном направлении ATG кодона у начала соответствующего гена, дадут такую последовательность. Кроме того, например, анализ консенсусных последовательностей может привести к открытию интересующего гена. Используя методы гибридизации и амплификации, специалист в данной области сможет легко получить соответствующие промоторные последовательности.

Промоторные последовательности С1 эндоглюканаз были идентифицированы таким методом, путем клонирования соответствующих генов. Согласно изобретению предпочтительным промотором является промотор целлобиогидролазы (СВН1) 55 кДа, промоторы ксиланазы (Xyll) 30 кДа и промотор глицеральдегидфосфатдегидрогеназы, поскольку указанные ферменты экспрессируются на высоком уровне с помощью их собственных промоторов. Соответствующие промоторные последовательности идентифицированы прямым методом с помощью клонирования, как описано в международной патентной заявке WO 00/20555, используя информацию о последовательности, данную в SEQ ID No.1 (для СВН1) и SEQ ID No.3 (для Xyll) соответственно. Промоторы гидролизующих углеводы ферментов из Chrysosporium, особенно С1 промоторы, можно успешно использовать для экспрессии желаемых полипептидов в организме хозяина, особенно грибов или другого хозяйского организма микробного происхождения. Промоторные последовательности, имеющие, по крайней мере, 65%, предпочтительно, по крайней мере, 70%, самое предпочтительное, по крайней мере, 75% нуклеотидных последовательностей, идентичных последовательности, данной в SEQ ID No.s 1, 3 и 5, или имеющие идентичные последовательности, найденные для других генов Chrysosporium, являются частью настоящего изобретения.

Что касается особых аспектов, связанных с рекомбинантным штаммом и последовательностью нуклеиновых кислот согласно изобретению, авторы также ссылаются на примеры. Авторы также обращаются к рекомбинантным штаммам, разработанным на предыдущем уровне техники, для которых описаны промоторные последовательности с высокой экспрессией, в частности такие, которые обеспечивают высокую экспрессию в грибах, например такие, как описаны для Aspergillus и Trichoderma. Данные, полученные на предыдущем уровне техники, свидетельствуют о том, что ряд регулирующих экспрессию областей был применен для Aspergillus, например, в патентах США 5252726 No.vo и 5705358 Unilever. Содержание данных публикаций предыдущего уровня техники включено в текст в виде ссылки.

Ген гидрофобина является геном грибов, который проявляет высокую экспрессию. Таким образом, полагают, что промоторная последовательность гена гидрофобина, предпочтительно из Chrysosporium, может быть использована подходящим образом в качестве регулирующей экспрессию последовательности в соответствующем аспекте изобретения. Генные последовательности Trichoderma reesei и Trichoderma harzianum для гидрофобина описаны, например, на предыдущем уровне техники, а также генная последовательность для Aspergillus fumigatus и Aspergillus nidulans, и соответствующая информация о последовательности включены в данный текст в виде ссылки (MuNo.z et al., Curr. Genet. 1997, 32 (3):225-230; Nakari-Setala T. Et al., Eur. J. Biochem. 1996 15:235 (1-2):248-255, M. Parta et al. Infect. Inimun. 1994 62 (10): 4389-4395 и Stringer M.A. et al. Mol. Microbiol. 1995 16(1):33-44). Используя указанную информацию о последовательности, специалист в данной области сможет получить регулирующие экспрессию последовательности генов гидрофобина из Chrysosporium без кропотливого эксперимента после стандартного метода, как предложено уже выше. Рекомбинантный штамм Chrysosporium согласно изобретению может содержать гидрофобин-регулирующую область, связанную с последовательностью, кодирующей интересующий полипептид.

Кроме того, регулирующая экспрессию последовательность может содержать энхансер или сайпексер. Указанные гены хорошо известны из предыдущего уровня техники и обычно расположены на некотором расстоянии от промотора. Также регулирующие экспрессию последовательности могут содержать промоторы с активатор-связывающими сайтами и репрессор-связывающими свитами. В некоторых случаях такие сайты могут быть модифицированы, чтобы элиминировать указанный тип регуляции. Промоторы гифомицетов, в которых присутствуют creA сайты, описаны. Такие creA сайты могут подвергаться мутации, чтобы убедиться, что подавление глюкозы, которое в нормальных условиях является результатом наличия немутированных сайтов, элиминировано. Международная патентная заявка WO 94/13820 Gist-Brocades иллюстрирует указанный подход. Данные промоторы могут быть использованы с их creA сайтами или без них. Мутанты, в которых creA сайты мутированы, могут быть использованы в качестве регулирующих экспрессию последовательностей в рекомбинантном штамме согласно изобретению, и последовательность нуклеиновых кислот, которую она регулирует, затем может быть экспрессирована в присутствии глюкозы. Такие промоторы Chrysosporium обеспечивают дерепрессию аналогично тому способу, который описан в международной патентной заявке WO 97/09438. Идентичность creA сайтов известна из предыдущего уровня техники. В качестве альтернативы, возможно, применять промотор с creA-связывающими сайтами, которые не были мутированы в хозяйском штамме, с мутацией в другом месте в репрессионной системе, например, в самом сгеА гене, так что штамм может, несмотря на присутствие creA-связывающих участков, продуцировать белок или полипептид в присутствии глюкозы.

Терминаторные последовательности являются регулирующими экспрессию последовательностями, и они связаны с 3^'-концом последовательности, подлежащей экспрессии. Вероятно, любой терминатор грибов является функциональным в хозяйском штамме Crysosporiurn согласно изобретению. Примерами являются A.nidulans терминатор trpC (1), A.niger терминатор альфа-глюкозидазы (2), А.niger терминатор глюкоамилазы (3), Mucor miehei терминатор карбоксильной протеазы (патент США 5578463) и терминатор Trichoderma reesei целлобиогидролазы. В естественных условиях терминаторные последовательности Crysosporium будут функционировать в Crysosporium и будут подходящими, например, как СВН1 терминатор.

Подходящий рекомбинантный штамм Crysosporium, который применяют согласно изобретению, содержит экспрессирующую последовательность нуклеиновых кислот, связанную с последовательностью, кодирующую аминокислотную последовательность, определенную как сигнальная последовательность. Сигнальная последовательность является аминокислотной последовательностью, которая в случае связывания ее с аминокислотной последовательностью экспрессированного полипептида обусловливает его секрецию из хозяина-гриба.